混菌發酵對油茶粕中茶皂素表面活性指標和抗氧化活性的影響

韓帥鵬,曾萬祥,伍丹惠,藍秀權,華濤,程建華,*,周心慧,周辛

1(華南理工大學 環境與能源學院,廣東 廣州,510006) 2(湖南金昌生物技術有限公司,湖南 衡陽,421300)3(華南協同創新研究院,廣東 東莞,523808)

油茶(CamelliaoleiferaAble)為世界四大木本油料作物[1],我國油茶種植總規模已達446.67萬hm2[2]。油茶籽榨油后會產生大量的油茶粕,油茶粕中含有茶皂素、多糖、蛋白質、多酚、黃酮等多種有效成分[3]。目前,大部分油茶粕被用做燃料進行焚燒或者直接廢棄,這一優質資源并未得到充分利用[4]。油茶粕中的茶皂素含量為10%～15%[5],茶皂素是一類由有機酸、糖體和皂苷元組成的五環三萜類化合物[6],為優良的天然非離子型表面活性劑[7],具有乳化、分散、去污、發泡、穩泡等多種特性,在日化、醫藥、農業、環保等多個領域有良好的應用[8],因此,加強對油茶粕的綜合利用研究對提高其經濟價值有著重大的現實意義。

目前,茶皂素的提取工藝以水提法和醇提法為主。水提法雖然成本較低,但提取率和純度不高,不易實現工業化生產[9],醇提法在提取過程中消耗大量甲醇、乙醇等有機溶劑,成本高、工藝復雜、設備要求較高[10]。王文杰等[11]采用二次發酵法(先在玉米粉加入復合酶進行酶解,接入酵母菌發酵3～4 d得到玉米醪液,再添加油茶粕后第二次發酵2～3 d)提取茶皂素,茶皂素的提取率達80%左右,且粗提茶皂素純度為62.37%,此法工藝流程較為復雜繁瑣。利用微生物發酵提取植物中的有效成分,同時具有降低原料毒副作用,改善其功效性的作用,本研究采用2種乳桿菌協同發酵促進油茶粕中茶皂素的浸出,建立了一種提取率較高、綠色環保的茶皂素生產新工藝,并將其與傳統水提、醇提工藝以及單菌發酵提取進行對比分析,對油茶粕資源開發模式具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶粕(粉碎過60目篩),湖南金昌生物技術有限公司提供;植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum, LP)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei, LC),仙農生物科技(上海)有限公司;MRS肉湯、大豆蛋白胨,環凱微生物科技有限公司;葡萄糖、K2HPO4,天津市大茂化學試劑廠;無水乙醇、正丁醇、三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)、98%H2SO4、H2O2,廣州化學試劑廠;抗壞血酸(維生素C)、考馬斯亮藍、牛血清蛋白,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;茶皂素標準品、鐵氰化鉀、三氯乙酸、DPPH、ABTS,上海麥克林生化科技有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀,日本島津;U2910紫外可見分光光度計,日本Hitachi公司;SQ510C高壓蒸汽滅菌鍋、DP43C真空干燥廂,雅馬拓科技貿易有限公司;3k15臺式高速冷凍離心機,德國Sigma公司;旋轉蒸發儀,德國IKA公司;T15表面張力儀,德國SITA公司;TENSOR27傅里葉紅外光譜儀,德國布魯克公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 茶皂素的制備

1.3.1.1 發酵法

稱取10 g油茶粕,以料液比(1∶10,g∶mL)加入到液態發酵培養基中121 ℃滅菌15 min,冷卻至室溫后分別接入體積分數為2%的LP、LC、混菌(LP+LC,1∶1)種子液,在37 ℃條件下發酵48 h, 以6 000 r/min轉速離心10 min后過0.45 μm濾膜得到LP發酵液、LC發酵液、混菌發酵液。將混菌發酵液與水飽和正丁醇混合靜置過夜,將萃取劑60 ℃下減壓旋蒸濃縮,真空干燥8 h得到混菌發酵茶皂素。

1.3.1.2 水提法

稱取10 g油茶粕和水以料液比1∶10(g∶mL)混合后80 ℃水浴浸提6 h,冷卻后以6 000 r/min,離心10 min,上清液過0.45 μm濾膜得到水提液。將水提液與水飽和正丁醇混合靜置過夜,將萃取劑60 ℃下減壓旋蒸濃縮,回收正丁醇,濃縮液真空干燥8 h得到水提茶皂素。

1.3.1.3 醇提法

稱取10 g油茶粕和體積分數為80%的乙醇溶液以料液比1∶10(g∶mL)混合后70 ℃水浴浸提2 h,冷卻后6 000 r/min,離心10 min,上清液過0.45 μm濾膜過濾得到醇提液。將醇提液減壓旋蒸后,真空干燥8 h得到醇提茶皂素。

1.3.2 提取液成分分析

1.3.2.1 茶皂素的測定

參考江勛等[12]的方法并有所改進,采用高效液相色譜儀測定提取液中茶皂素含量。色譜條件為:COSMOSIL Packed Column C18柱(4.6 mm×150 mm);柱溫為30 ℃;紫外檢測波長:267 nm;流動相:體積分數為0.1%TFA水溶液和甲醇,V(0.1%TFA)∶V(甲醇)=60∶40;總流速:0.5 mL/min;進樣量:5 μL。繪制標準曲線方程為:y=1 656x-35 428,R2=0.999 7,根據標準曲線計算樣液中的茶皂素含量。茶皂素的浸出率計算如公式(1)所示:

(1)

式中:c為提取液中茶皂素的質量濃度,mg/mL;V為提取液的體積,mL;m1為油茶粕添加量,mg。

1.3.2.2 茶皂素純度、提取率和表面活性指標的計算

茶皂素純度、提取率的計算如公式(2)～公式(3)所示:

(2)

(3)

式中:X為茶皂素純度,%;Y為茶皂素提取率,%;m1為油茶粕添加量,mg;m2為提取所得茶皂素粗品質量,mg;m3為HPLC測樣所用茶皂素樣品的質量,mg;c為HPLC測得茶皂素樣品質量濃度,mg/mL;V為測樣所用溶液體積,mL。

將茶皂素樣品配制成2 mg/mL的溶液,在25 ℃下采用鉑金環法測定表面張力。分別將茶皂素樣品配制為2 mg/mL的磷酸緩沖液(pH=6.2),取25 mL用均質機12 000 r/min高速分散1 min。記錄分散結束后的體積為V0,靜置30 min后的體積為V1,起泡性和泡沫穩定性的計算如公式(4)～公式(5)[13]所示:

(4)

(5)

1.3.2.3 多糖的測定

取2 mL樣液,置于具塞試管中,以2 mL的蒸餾水作為空白對照,加入1 mL質量分數為5%苯酚溶液,搖勻,緩慢滴加5 mL濃硫酸搖勻,置于沸水浴中煮沸20 min,取出冷卻至室溫,在488 nm處測定吸光值[14]。

1.3.2.4 多酚的測定

運用Folin-Ciocalteau法[15]測定提取液中的多酚含量,取樣液1 mL加入5 mL體積分數為10%福林酚溶液,反應10 min后加入4 mL質量分數為7.5%Na2CO3溶液,避光反應1 h后在765 nm處測得吸光值。以沒食子酸為標準品繪制標準曲線,根據標準曲線計算樣液中的多酚含量。

1.3.2.5 黃酮的測定

取待測樣液 6 mL于25 mL容量瓶中,加入質量分數為5%亞硝酸鈉溶液1 mL,混勻靜置5 min后,加入1 mL質量分數為10%硝酸鋁溶液,混勻靜置5 min后,加入質量分數為4% NaOH溶液10 mL,加水定容,搖勻后放置15 min后在500 nm波長處測定吸光值[16]。

1.3.2.6 蛋白質的測定

采取考馬斯亮藍法[17],取待測溶液1 mL加入5.0 mL考馬斯亮藍G250溶液搖勻,在室溫下反應5 min,分光光度計595 nm波長處測定樣品組的吸光值,以牛血清蛋白為標準品繪制標準曲線計算樣液中蛋白質濃度。

1.3.3 抗氧化能力的測定

將水提、醇提和混菌發酵3種工藝提取得到的茶皂素樣品用體積分數為75%乙醇溶液配制成0.25～4 mg/mL質量濃度梯度的溶液,以維生素C為陽性對照,分別測定3種茶皂素對DPPH自由基、ABTS自由基陽離子、羥自由基的清除能力和還原力。

1.3.3.1 DPPH自由基清除率

參考馮燕茹等[18]的方法,取2 mL不同質量濃度茶皂素溶液,加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH 乙醇溶液,混勻靜置30 min,517 nm測吸光值,按公式(6)計算不同濃度樣品的DPPH自由基清除率:

(6)

式中:A0,蒸餾水+DPPH的吸光值;A1,樣品溶液+DPPH的吸光值;A2,樣品溶液+無水乙醇的吸光值。

1.3.3.2 ABTS陽離子自由基清除率

參考肖亨[19]的方法,略作修改,將7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合,黑暗中反應12 h,用體積分數為95%乙醇將溶液稀釋至734 nm處的吸光值為0.7。取0.4 mL不同質量濃度茶皂素溶液,加入到3 mL稀釋后的ABTS混合液中,混勻后室溫避光沉淀6 min,然后測量波長為734 nm的反應溶液的吸光值。ABTS陽離子自由基清除率計算如公式(7)所示:

(7)

式中:A0,以95%乙醇代替樣液的吸光值;A1,樣品反應溶液的吸光值。

1.3.3.3 羥自由基(·OH)清除率

參考楊琦等[20]的方法并稍作修改,取2.0 mL不同質量濃度的茶皂素溶液,依次加入0.5 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液和0.5 mL 6 mmol/L的H2O2溶液,充分混勻后于室溫下反應10 min,再分別加入0.5 mL 6 mmol/L水楊酸混勻,室溫反應30 min,在510 nm處測得吸光值為A1。在上述反應體系中,以無水乙醇代替水楊酸,測定吸光值為A2;以蒸餾水代替樣品溶液,測定吸光值為A0。羥自由基清除率計算如公式(8)所示:

(8)

1.3.3.4 還原力

參考SAVI等[21]的方法,略作修改,分別吸取不同質量濃度的茶皂素溶液0.5 mL,加入0.5 mL(0.2 mol/L,pH=6.6)磷酸緩沖液、0.5 mL質量分數為1%鐵氰化鉀,在50 ℃的水浴鍋中加熱30 min,冷卻后,加入0.5 mL質量分數為10%三氯乙酸,3 000 r/min離心10 min,取上清液1 mL,加入1 mL蒸餾水和0.4 mL質量分數為0.1% FeCl3溶液,靜置10 min,靜置10 min,以蒸餾水為參比,700 nm下測定吸光值A0,用蒸餾水代替各樣品測得吸光值A1,還原力計算如公式(9)所示:

總還原力=A0-A1

(9)

1.3.4 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer, FT-IR)分析

在干燥條件下,將茶皂素樣品與KBr混合后壓片,傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內掃描,得到紅外光譜圖。

2 結果與分析

2.1 提取液成分分析

不同工藝提取液的茶皂素濃度及浸出率如圖1所示,其中水提液的質量濃度最低,僅為18.11 mg/mL?；炀l酵液的質量濃度最高,達到21.86 mg/mL,超過醇提液濃度,比水提液濃度高20.77%。LP發酵液與醇提液質量濃度無顯著差異,顯著高于LC發酵液,而混菌發酵液質量濃度顯著優于2種單菌發酵液(P<0.05)。在2種微生物的共同作用下,高效促進茶皂素從植物細胞中釋放,提高了浸出率。5種提取液的茶皂素浸出率大小關系為醇提液>混菌發酵液>LP發酵液>LC發酵液>水提液。其中,醇提法浸出率更高的原因是由于醇提工藝更易實現固液分離,所得到的提取液體積多于其他幾種工藝?；炀l酵提取液的浸出率相較于水提和單菌種發酵均有明顯提升。

不同工藝提取液的其他有效成分含量如表1所示。5種提取液的多糖含量具有顯著性差異(P<0.05),其中水提液中多糖含量最高,為(14.66±0.26) mg/mL,醇提液次之,3種發酵液多糖含量相對較低,這是由于微生物發酵過程中消耗一部分多糖作為生長因子。提取液中多酚質量濃度在0.93～1.14 mg/mL,其中醇提液的質量濃度最高,為(1.14±0.02) mg/mL;混菌發酵液濃度高于2種單菌發酵液,與水提液濃度無顯著差異。各提取液的黃酮質量濃度為0.85～1.06 mg/mL,其大小關系為醇提液>混菌發酵液>LP發酵液>水提液>LC發酵液;混菌發酵液濃度與醇提液無顯著差異,顯著高于水提液(P<0.05)。蛋白質濃度受提取工藝的影響較大,水提液蛋白質濃度最高,顯著高于其他工藝提取液(P<0.05),醇提液濃度較低是由于蛋白質在乙醇溶液中比較難溶。LC發酵液中蛋白質質量濃度最低,僅為(1.59±0.08) mg/mL。這是由于微生物生長代謝過程中會將一部分植物蛋白作為氮源進行利用。

圖1 油茶粕提取液中茶皂素濃度和浸出率Fig.1 Concentration and leaching rate of tea saponin in extraction solution of Camellia oleifera meal注:小寫字母不同表示茶皂素濃度具有顯著差異(P<0.05)。

表1 不同提取液中的有效成分含量Table 1 Contents of active components in different extraction solutions

2.2 茶皂素的純度、提取率和表面活性指標

水提、醇提和混菌發酵法所提取茶皂素的純度和提取率及表面活性指標如表2所示。水提法工藝雖然簡單、易于操作,但產品純度不高,為53.2%,且提取率僅有9.60%,不能很好地滿足工業使用要求。醇提法的純度和提取率分別為69.6%、13.44%?；炀l酵茶皂素的純度和提取率最高,分別為75.2%和14.12%,該方法明顯優于水提法。發酵茶皂素具有更強降低溶液表面張力的能力,溶液表面張力為39.2 mN/m。在25 ℃、pH=6.2、質量濃度為2 mg/mL條件下,混菌發酵茶皂素的起泡性和泡沫穩定性最高,分別為128%、96.9%,優于水提茶皂素和醇提茶皂素,具有更好的泡沫性能,說明混菌發酵法所得的茶皂素產品具有更好的表面活性,在日化領域有較好的適用性。

表2 不同茶皂素的純度、提取率和表面活性指標Table 2 Purity, extraction rate, and surface activity index of different tea saponin

2.3 抗氧化性分析

水提法、醇提法和混菌發酵法所提取的茶皂素的抗氧化測試結果如圖2-a～圖2-c所示,在0.25～4 mg/mL內,茶皂素對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基的清除率隨著樣品質量濃度的增加呈現先增加后趨于穩定的趨勢。在同一質量濃度下醇提茶皂素的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率均高于水提茶皂素和發酵茶皂素,低于維生素C。DPPH自由基清除實驗常被用作植物提取物的抗氧化活性評價,由圖2-a可知,當質量濃度為1 mg/mL時,三者對DPPH自由基的清除率分別達到了(79.14±0.78)%、(93.42±1.12)%、(88.82±1.68)%,當質量濃度大于1 mg/mL時,三者的清除率逐步趨于穩定,略低于陽性對照維生素C,顯示出較強的抗氧化能力。IC50代表達到50%抗氧化效果時的抗氧化劑濃度,其值越低代表抗氧化能力越強。由表3可知,水提、醇提、混菌發酵茶皂素清除DPPH自由基的IC50分別為0.522、0.303、0.373 mg/mL。由圖2-b可知,當質量濃度為4 mg/mL時,3種茶皂素清除ABTS陽離子自由基的清除率為(92.99±1.38)%、(99.51±0.25)%、(97.88±0.81)%,該質量濃度下,醇提和混菌發酵茶皂素接近維生素C的抗氧化能力,水提、醇提、混菌發酵茶皂素清除ABTS陽離子自由基的IC50分別為0.620、0.434、0.533 mg/mL。

3種茶皂素對羥自由基具有較強的清除能力,當質量濃度為0.5 mg/mL時,水提、醇提、混菌發酵茶皂素的清除率分別為(57.06±2.14)%、(45.81±2.75)%、(79.5±0.86)%,清除羥自由基的IC50分別為0.373、0.592、0.153 mg/mL。質量濃度為4 mg/mL時,清除率分別達到了(97.75±0.77)%、(87.11±1.25)%、(99.52±0.23)%,該質量濃度下混菌發酵茶皂素的清除率高于另外兩者,與維生素C相近。3種茶皂素的還原力測定結果如圖2-d所示,在700 nm處,反應體系的吸光值越大代表還原力越強,在0.25～4 mg/mL內,隨著質量濃度的提高其還原力也隨之增高。在同一質量濃度下,水提茶皂素的還原力最低,混菌發酵茶皂素表現出較強的還原能力,強于醇提茶皂素,低于陽性對照維生素C。

a-DPPH自由基清除率;b-ABTS陽離子自由基清除率;c-羥自由基清除率;d-還原力圖2 不同工藝提取茶皂素的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of tea saponin extracted by different methods

表3 不同茶皂素抗氧化活性的IC50值 單位:mg/mL

2.4 紅外光譜分析

圖3 茶皂素的傅里葉紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of tea saponin

3 結論

本文采用混菌發酵法提取油茶粕中的茶皂素,與水提、醇提、單菌發酵提取液中主要成分進行對比分析。其中,混菌發酵液中茶皂素質量濃度為(21.86±0.39) mg/mL,比水提法高20.77%,優于醇提液和單菌發酵液?；炀l酵提取的茶皂素樣品純度為75.2%,提取率為14.12%;其表面張力值為39.2 mN/m,起泡性為128%,泡沫穩定性為96.9%,優于水提和醇提茶皂素?；炀l酵茶皂素對于DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力優于水提茶皂素,弱于醇提茶皂素;對羥自由基清除能力和還原力強于另外兩者,在4 mg/mL時與維生素C相近。該工藝在雙菌種協同作用下促進茶皂素的浸出,提取物具有優異的表面活性和抗氧化活性,提取過程更加高效環保,為茶皂素的工業化提取提供了新的思路。