川麥冬多糖的結構特征及對過度運動小鼠肝損傷的改善作用

任東根,龔婷,王麗娟,關濤

1(河南科技學院 體育學院,河南 新鄉,453000)2(河南中醫藥大學 藥學院,河南 鄭州,450046)

運動對機體的影響是雙向的,適宜的運動能夠提高機體的代謝能力、改善心肺功能,同時還能提高免疫調節能力,然而當運動強度或運動量超出了機體的承受范圍,出現過度運動時,易誘發機體出現運動疲勞癥狀[1]。此時,機體內會產生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),使細胞內氧化和抗氧化平衡被打破,導致細胞出現嚴重的氧化應激,對機體的代謝功能和組織細胞造成一定程度損傷,進而產生繼發性疾病。肝臟作為人體最大的新陳代謝器官,也是最主要的排毒器官,研究表明,肝臟易受外源刺激,同時在自身的排毒過程中易受到副代謝產物的氧化應激作用[2],另外,較多學者研究認為,機體在受到外源刺激后,體內積累的ROS是導致肝臟功能紊亂和肝臟組織細胞受損的主要原因[3-4]。因此,通過添加外源活性物質降低肝臟組織的氧化應激水平是緩解因過度運動導致肝損傷的有效方法之一。

肝臟組織內有著較復雜的抗氧化應激反應系統,以平衡細胞內的氧化和抗氧化,這些抗氧化應激反應系統里起著關鍵作用的是一些抗氧化蛋白和各種反應酶類。核轉錄因子E2相關因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)是機體內抗氧化應激反應系統中的樞紐,其主導的氧化應激信號通路是較多學者研究的主要通路[5]。研究表明,在降低細胞內氧化應激水平作用上,Nrf2介導的信號通路起著關鍵作用,該信號通路是保護肝臟免受外源刺激損害的重要靶點[6-7]。腺苷酸活化蛋白激酶(adenylate-activated protein kinase,AMPK)是機體能量代謝中的一種關鍵酶,研究表明,AMPK可被外源物質誘導產生的ROS激活,進而參與調節細胞內抗氧化蛋白、氧化應激酶水平,在氧化應激系統中同樣起著重要作用[8]。AMPK被激活后可以誘導細胞質中Nrf2與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1解偶聯,Nrf2則進入細胞核中與抗氧化應答元件(antioxidant response element,ARE)結合,進而啟動該應答元件調控下游抗氧化蛋白和反應酶基因mRNA的高表達[9],從而降低細胞的氧化應激水平,緩解外源物質誘導的損傷。

麥冬(Ophiopogonjaponicus),百合科(Liliaceae),沿階草屬(Ophiopogon)植物,其干燥塊根入藥,為我國傳統中藥。目前,麥冬的主要產區為四川和浙江,而以四川三臺縣的川麥冬產量最大[10]?，F代藥理研究表明,麥冬含有多糖、多酚、皂苷、氨基酸等活性成分,具有保肝護肝[11]、免疫調節[12]、抑制炎癥[13]、改善心肺功能[14]、抗氧化[15]、抑制細胞凋亡[16]等作用。目前,已有研究表明,麥冬多糖可以通過提高體內抗氧化酶活性來緩解外源物質對機體組織的損傷作用[17],然而關于川麥冬多糖對過度運動誘導的小鼠肝損傷的保護作用還未見文獻報道,且對其具體的作用機制還不清晰,因此,本研究以AMPK/Nrf2/HO-1信號通路及氧化應激作用為切入點,通過建立小鼠的過度運動疲勞模型,觀察肝臟組織的病理變化,并檢測相關生化指標和AMPK/Nrf2/HO-1信號通路上的相關抗氧化蛋白和反應酶mRNA的表達量,探討川麥冬多糖對過度運動引起小鼠肝損傷的改善作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川麥冬:四川省農業科學院經作所提供,采集自四川省綿陽市三臺縣花園鎮,采集塊根清洗干凈后,室內晾干,切片,厚度在0.5 mm～1 cm,然后在50 ℃烘箱中烘干,烘干至恒重,經中藥材粉碎機粉碎,過0.15 mm篩后,4 ℃冷藏備用。樣地環境概述如下:年均溫度為16.4 ℃,樣地海拔486 m,年無霜期為283 d,年降雨量為882.2 mm,年日照時間共計1 290 h。

SPF級昆明小鼠:65只[雄性,4周齡,體重14～16 g,許可證:SCXK(豫)2019-0002]:鄭州市惠濟區華興實驗動物養殖場,小鼠運動疲勞試驗在河南中醫藥大學附屬醫院開展,倫理委員會批準文號:syzx202112-012;小鼠普通飼料(D12450B):成都達碩實驗動物有限公司。

葡萄糖(glucose,Glc)、甘露糖(mannose,Man)、半乳糖(galactose,Gal)、木糖(xylose,Xyl)、阿拉伯糖(arabinose,Ara)、巖藻糖(fucose,Fuc)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GlcUA)、鼠李糖(rhamnose,Rha)等單糖標準品,Sigma公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司;天冬氨酸氨基轉移酶(aspartic transaminase,AST)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、蛋白質羰基化(protein carbonylation,PCO)測定試劑盒,南京建成生物工程研究所;Invitrogen TRIzol試劑,賽默飛公司;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

WF-20中藥材粉碎機,中國佛山麥可酷;Delta 1-24 LCS真空冷凍干燥機,德國Christ公司;MS-TS分析天平,瑞士METTLER TOLEDO公司;MCO-15AC CO2細胞培養箱,日本SANYO公司;N-1210BS-WB旋轉蒸發儀,日本Eyela公司;CKX53倒置顯微鏡,日本Olympus公司;Forma 3111 CO2細胞培養箱,美國Thermo公司;SpectraMax L酶標儀,美國Molecular Devices公司;傅立葉紅外光譜儀,美國Nicolet公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 川麥冬多糖提取與純化

采用傳統水提醇沉法獲得川麥冬粗多糖[18]。準確稱取100 g川麥冬粉末,加入1 L體積分數為95%的乙醇過夜脫脂,后離心(5 000 r/min)去除乙醇,樣品置于37 ℃烘箱中烘干。干燥后的川麥冬粉末加入900 mL的蒸餾水,95 ℃水浴2 h,5 000 r/min離心5 min,分離濾液,重復操作2次,合并濾液,旋轉蒸發儀減壓濃縮濾液后加入9倍體積的95%乙醇,4 ℃靜置12 h。離心收集沉淀,風干后加入37 ℃蒸餾水,使沉淀全部溶解。采用Sevag法除去溶液中的蛋白,獲得的溶液經7 500 Da分子質量透析袋流水透析3 d,截留透析液,后用真空冷凍干燥機冷凍干燥得到川麥冬粗多糖。

準確稱取2 g川麥冬粗多糖,加入20 mL蒸餾水,振蕩溶解。0.45 μm的濾膜過濾,濾液上樣于DE-52纖維素柱(4.5 cm×80.0 cm),洗脫分離,洗脫條件設定為:洗脫液為氯化鈉溶液,濃度0.5 mol/L,洗脫速度設定為1.0 mL/min,每管收集洗脫液5 mL。采用苯酚硫酸法檢測監測多糖含量,合并洗脫峰濃縮透析,冷凍干燥,得到川麥冬多糖的半純品。準確稱取半純品100 mg并用蒸餾水溶解,溶液上樣于Sephadex G-100凝膠柱(2.6 cm×100 cm)洗脫分離,洗脫檢測條件同粗多糖的分離,收集洗脫峰,濃縮并冷凍干燥,得到川麥冬多糖(Ophiopogonjaponicuspolysaccharides,POJ)。

1.3.2 POJ分子質量測定

準確稱取純化后凍干的POJ粉末0.5 g,加入帶刻度的5 mL樣品瓶中,加入用無菌蒸餾水配制的0.1 mol/L的NaNO3溶液,至5 mL刻度線,經0.45 μm濾膜過濾。樣品溶液在超聲波分散器下處理3 min,待測。參考標準SH/T 1759—2007用凝膠滲透色譜法測定POJ樣品分子質量。

1.3.3 POJ單糖組成測定

采用PMP-柱前衍生法測定POJ的單糖組成[19]。通過2 mol/L的硫酸酸解POJ,得到POJ的單糖水解溶液。POJ的單糖水解溶液中加入PMP試劑,進行柱前衍生,0.45 μm的濾膜過濾,獲得上機液。HPLC的色譜條件設定為:流動相A為0.1 mol/L磷酸鹽(KH2PO4-NaOH,pH 7.4)緩沖液,流動線B為色譜純乙腈,體積比為A∶B=80∶20,柱溫設定為35 ℃,檢測波長250 nm,單針進樣量為20 μL,反應過程中流速設定為1 mL/min。

1.3.4 POJ紅外光譜檢測

通過傅立葉紅外光譜儀測定POJ的紅外光譜并比對分析其所含有的功能基團。精確稱取POJ凍干粉末5 mg,置于干燥的研缽中,稱取1 g溴化鉀加入研缽,充分研磨后進行壓片,最后上機掃描。掃描參數設定為:共掃描32次,分辨率設定為4 cm-1,掃描范圍限定為4 000～400 cm-1。

1.3.5 POJ電鏡掃描

取上述凍干的POJ粉末1 g,在60 ℃烘箱進行干燥1 h,然后在真空鍍膜儀中對樣品進行噴金鍍上一層導電層,固定在樣品臺上,掃描電子顯微鏡在5 000倍下自動觀察。

1.3.6 POJ抗氧化活性測定

通過測定POJ對超氧陰離子自由基、羥自由基以及DPPH自由基的清除率來評價其抗氧化能力。依據OKTAY等[20]的方法完成上述測定,準確稱取10 mg POJ置于試管,加入2 mL無菌水,振蕩溶解,獲得并稀釋成0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mg/mL的工作液備用。采用質量濃度為1 mg/mL的維生素C作為陽性對照,同一質量濃度重復測定3次,計算清除率。

1.3.7 小鼠分組與建模

65只小鼠適應性飼養1周后,通過不負重游泳訓練,淘汰不合格的小鼠,將剩余小鼠60只,隨機分為5組,每組12只。依次設定為安靜對照組(control group,CG)、運動模型組(model group,MG)、川麥冬多糖運動組(POJ,低、中、高劑量依次對應50、100、200 mg/kg,記作POJ-L、POJ-M和POJ-H)。灌胃體積5 mL/kg,安靜對照組和運動模型組灌胃等量的無菌生理鹽水。

CG組不進行游泳干預,MG、POJ-H,POJ-M和POJ-L組每天進行游泳訓練,實驗期間,小鼠游泳訓練之前分別進行稱重,具體的訓練方案為第1周每天進行不負重游泳30 min;第2周開始每天進行負重游泳,負重3%小鼠體質量的鉛塊,游泳訓練30 min;第3周每天負重3%小鼠體質量的鉛塊,游泳40 min;第4周每天負重5%小鼠體質量的鉛塊,全部游泳至力竭。在4周游泳期間如有小鼠無法訓練達到規定時間,則訓練至力竭即可。在過度運動游泳時間期間,MG組小鼠死亡2只,POJ-M和POJ-L組各死亡1只,剩余小鼠滿足實驗要求。

1.3.8 生理生化指標檢測

末次游泳訓練結束12 h后,引頸法處死小鼠,摘取小鼠眼球并取血,6 000 r/min離心8 min收集血清。完整剝離肝臟并稱重,將小鼠肝臟組織部分制成100 g/L的勻漿。按照試劑盒給出的方法測定小鼠血清中ALT、AST的含量,測定勻漿組織中SOD、CAT和GSH-Px的活性,同時測定肝臟組織中MDA和PCO的含量。參考曹智[21]的方法進行肝臟組織染色制片,配制蘇木精染液、伊紅染液及體積分數為1%的鹽酸乙醇分化液,選定肝臟組織,在同一位置上切取組織塊,修整成合適大小,流水沖洗12 h,依次進行脫水透明,包埋修塊,脫蠟復水、染色封片后,于光學顯微鏡下觀察。

1.3.9 肝臟組織AMPK/Nrf2/HO-1信號通路上相關基因mRNA的表達分析

采用Invitrogen TRIzol試劑,按照說明書方法提取小鼠肝臟組織RNA,按照TaKaRa試劑反轉錄成cDNA,參考文獻王僮[22]進行三步法RT-PCR檢測AMPKα、Nrf2、HO-1、SOD、GSH-Px、CAT的mRNA表達水平,以β-actin為內參,采用2-△△Ct法對目的基因進行定量分析。具體的引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequences

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 POJ的分離純化和分子質量測定

通過水提醇沉法從100 g的川麥冬粉末中,提取出川麥冬粗多糖14.48 g,得率為14.48%。2 g川麥冬粗多糖通過DE-52纖維素柱以及Sephadex G-100凝膠柱的分離洗脫,最終凍干獲得POJ干粉108 mg,計算出從川麥冬粗多糖粉末中提取到純多糖的得率為5.4%。

通過GPC軟件分析得到POJ的相對分子質量,結果見圖1,其Z均分子質量(Mz)為21 755 Da,z+1均分子質量(Mz+1)為24 138 Da,重均分子質量(Mw)為19 315 Da,最高峰值處的分子質量(Mp)為18 140 Da,數均分子質量(Mn)為17 005 Da。分散度D(Mw/Mn)為1.14。研究表明,不同的提取方法所得的多糖分子質量會有較大的差異,王小梅等[23]通過不同超聲波功率提取麥冬多糖,發現提取的麥冬多糖分子質量分布在幾千到幾十萬間,這與本研究通過熱水浸提的多糖分子質量差距較大,可能原因是超聲波的能量較大,能將大分子多糖全部提取出來,而通過熱水浸提時難以提出大分子多糖,還可能是熱水可以使大分子多糖鏈斷裂變成較多的短鏈分子多糖。另外,周彬等[24]通過不同溫度浸提麥冬多糖時,發現隨著浸提溫度的提高,麥冬多糖的浸出率顯著升高,多糖的分子質量隨著浸提溫度的升高而變小,通過熱水浸提的麥冬多糖分子質量分布為4 000～19 000 Da,這與本研究提取的多糖分子質量分布差異較小。

圖1 POJ分子質量Fig.1 Molecular weight of POJ

2.2 POJ單糖組分分析

準確稱取Glc、Man、Gal、Xyl、Ara、Fuc、GlcUA、Rha各100 mg,分別配制質量濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mg/mL的8種單糖標準液,各上樣品20 μL,以各單糖濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)進行線性回歸,回歸方程見表2。

表2 各單糖的線性回歸Table 2 Linear regression of monosaccharides

通過PMP柱前衍生法測定了POJ的單糖組成(圖2)。圖2-A為8種單糖標準品的HPLC圖,可以看出8種單糖能夠很好得被分開,圖2-B為POJ的HPLC圖,通過與標準單糖比較,結果表明,POJ主要由Glc、Man、Gal以及少量Xyl組成,通過標準單糖的線性回歸方程,計算得出POJ的水解產物中Glc∶Man∶Gal∶Xyl摩爾比為4.35∶5.21∶1.34∶1。王小梅等[25-26]在對產地為浙江的浙麥冬多糖單糖分析時發現浙多糖樣品只含有葡萄糖,然而其在2013年時對其他浙江麥冬多糖的單糖組成分析時發現主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖組成,這一結果與本研究的川麥冬多糖的單糖組成較相似,可見,不同產地麥冬多糖的單糖組成有一定差異。

2.3 POJ的紅外光譜

A-8種單糖-PMP衍生物色譜分離圖; B-POJ-PMP衍生物色譜分離圖圖2 樣品PMP衍生化產物色譜圖Fig.2 Chromatograms of PMP derivatization for the samples

圖3 POJ紅外光譜吸收圖譜Fig.3 Infrared absorption spectra of POJ

2.4 POJ掃描電鏡

POJ的掃描電鏡見圖4,POJ在2 000倍電鏡下,多糖呈現不規則顆粒狀,顆粒表面不平整且顆粒分散不粘連。在5 000倍電鏡下,多糖顆粒上有疊加層,凹凸不平,顆粒周圍部分呈現鋸齒狀,另外,表面有裂紋,呈交聯式的立體結構,說明,POJ顆粒并不只是多糖片層的疊加而是通過某種結構連接成的立體形態。

2.5 POJ的抗氧化活性

A-2 000倍;B-5 000倍圖4 POJ電鏡圖Fig.4 Electron microscope image of POJ

2.6 POJ對小鼠肝組織氧化指標的影響

如表3所示,MG組小鼠的內源性抗氧化酶系(SOD、CAT、GSH-Px)的活性相較于CG組均出現極顯著的下降(P<0.01),而MDA和PCO的含量卻極顯著的升高(P<0.01)。與MG相比,POJ-L、POJ-M、POJ-H組SOD、CAT、GSH-Px的活性均逐漸顯著升高(P<0.05),MDA、PCO含量則逐漸顯著降低(P<0.05),可見,小鼠灌胃POJ后,提高了肝臟組織抗氧化酶活性,并降低了細胞的脂質過氧化,從而緩解了細胞的氧化應激損傷。與POJ-L相比,POJ-M的SOD、CAT、GSH-Px的酶活性均顯著升高(P<0.05),MDA、PCO的含量進一步顯著降低(P<0.05),POJ-H組SOD、CAT、GSH-Px的酶活性均極顯著升高(P<0.01),MDA、PCO的含量極顯著降低(P<0.01),由此可見,在提高肝臟組織抗氧化酶活性上,POJ質量的濃度越高,細胞內抗氧化酶活性越強。

A-POJ對DPPH自由基的清除能力;B-POJ對·OH的清除能力;C-POJ對的清除能力圖5 POJ對DPPH自由基的清除能力Fig.5 Scavenging capacity of POJ to DPPH, ·OH, and

表3 POJ對小鼠肝組織氧化損傷的影響Table 3 Effects of POJ on oxidative damage of liver tissue in mice

2.7 POJ對小鼠血清轉氨酶ALT、AST的影響

血清中ALT、AST是臨床上常用于反映肝功能異常的指標,ALT、AST存在于肝臟組織中,當肝臟受到損傷后,則會滲透到血液,血清中轉氨酶的活性越高說明肝臟受損程度越高[28]。表4統計了小鼠血清中ALT和AST的濃度。與CG相比,MG組血清ALT和AST的含量顯著升高,說明過度運動造成了小鼠肝臟嚴重損傷。與MG相比,POJ-L,POJ-M、POJ-H組小鼠血清ALT分別顯著降低了47.90%、51.16%、66.17%(P<0.05),AST分別顯著降低了20.46%、32.38%、39.69%(P<0.05)。另外與POJ-L相比,POJ-H組ALT、AST分別極顯著降低了35.07%和24.18%(P<0.01)。結果表明,POJ緩解了過度運動對小鼠肝臟造成的損傷,且隨著POJ質量濃度的增加,其緩解損傷效果隨之增強。

表4 POJ對小鼠肝功能的影響Table 4 Effects of POJ on the liver function of mice

2.8 POJ對小鼠肝臟的影響

結果如圖6所示,CG組的小鼠肝臟組織結構、細胞形態完整(圖6-A),細胞核清晰可見,細胞質均勻。MG組小鼠肝細胞發生腫脹(圖6-B,箭頭1),細胞核偏移(圖6-B,箭頭2),細胞間隔模糊,細胞內出現大量的脂肪變性空泡,有大量脂質顆粒(圖6-B,箭頭3),可見,運動模型組肝臟細胞損傷較為嚴重。小鼠灌胃POJ后,POJ-L組小鼠肝細胞核移位明顯減少(圖6-C,箭頭1),胞核裂變減少(圖6-C,箭頭2),但細胞腫脹還是較多,空泡現象較嚴重;POJ-M組小鼠肝細胞核逐漸清晰(圖6-D,箭頭1),核移位進一步減少(圖6-D,箭頭2),但仍然存在一定的空泡現象;POJ-H組小鼠肝細胞形態逐步恢復正常,胞漿豐富,空泡和濁腫變性明顯減少(圖6-E,箭頭1、2)。

A-安靜對照組(CG);B-運動模型組(MG); C-POJ低劑量運動組(POJ-L);D-POJ中劑量 運動組(POJ-M);E-POJ高劑量運動組(POJ-H)圖6 小鼠肝臟組織病理學變化Fig.6 Pathology changes of liver in mice注:比例尺=50 μm。

2.9 POJ對肝臟組織AMPK/Nrf2/HO-1信號通路上相關基因mRNA表達的影響

AMPK/Nrf2/HO-1信號通路是研究肝臟氧化損傷的重要通路,共檢測了該信號通路上AMPKα、Nrf2、HO-1、SOD、GSH-Px、CAT六種mRNA相對表達水平(圖7)。由圖7可知,與CG相比,過度運動組(MG、POJ-L、POJ-M、POJ-H)組中AMPKα、Nrf2、HO-1的mRNA表達量均極顯著升高(P<0.01),表明過度運動使肝臟細胞內產生了較多的ROS,從而激活了該信號通路,使下游相關基因出現高表達;與MG相比,POJ-L、POJ-M、POJ-H組中AMPKα、Nrf2、HO-1的mRNA表達量均極顯著升高,表明POJ可進一步提高該信號通路上相關基因的表達;與POJ-L相比,POJ-M、POJ-H組中AMPKα、Nrf2、HO-1的mRNA表達量均出現不同程度的提高,可見,POJ提高AMPK/Nrf2/HO-1信號通路上相關基因的表達與濃度成正比。

A-POJ對AMPKα的mRNA表達的影響;B-POJ對Nrf2的mRNA表達的影響;C-POJ對HO-1的mRNA表達的影響圖7 POJ對AMPKα、Nrf2、HO-1的mRNA表達的影響Fig.7 The effect of POJ on the mRNA expression of AMPKα, Nrf2 and HO-1注:與CG相比,*表示P<0.05,**表示P<0.01;與MG相比,△表示P<0.05,△△表示P<0.01;與POJ-L相比,#表示P<0.05,##表示P<0.01;下同。

2.10 POJ對肝臟組織抗氧化酶基因mRNA表達的影響

SOD、GSH-Px、CAT為AMPK/Nrf2/HO-1信號通路的下游抗氧化酶基因,該信號通路的激活可以促進下游抗氧化酶相關基因的高表達,從而清除細胞內過多的ROS,維持細胞的氧化抗氧化平衡。由圖8可知,與CG相比,MG組中SOD、GSH-Px、CAT的mRNA的表達水平均略低,但不存在顯著差異(P>0.05),可見,過度運動產生的大量ROS抑制了抗氧化酶基因的表達,從而使肝臟組織細胞處于氧化應激狀態,該結果與上述抗氧化酶活性結果相應證;與MG相比,POJ-L、POJ-M、POJ-H組中3種抗氧化酶mRNA的表達水平均極顯著升高(P<0.01),且隨著POJ質量濃度的升高,3種抗氧化酶mRNA的表達水平均隨之顯著升高,結果表明,POJ可提高AMPK/Nrf2/HO-1信號通路的下游抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)基因的表達。

A-POJ對SOD的mRNA表達的影響;B-POJ對GSH-Px的mRNA表達的影響;C-POJ對CAT的mRNA表達的影響圖8 POJ對SOD、GSH-Px、CAT的mRNA表達的影響Fig.8 The effect of POJ on the mRNA expression of SOD, GSH-Px and CAT

3 討論

多糖是一類由一種或幾種單糖聚合而成的多聚物,明確其單糖組成及異頭碳的構型對其生理活性的研究十分必要。ZHANG等[29]、金鑫等[30]研究認為,多糖的單糖組成中含有少量木糖時,其抗氧化活性更強。本研究中分離純化后POJ的單糖組成包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖以及少量木糖,通過抗氧化活性分析表明POJ具有較高的清除自由基能力。結合紅外光譜中3 365 cm-1處的吸收峰論證出O—H的存在,可以推測POJ具有一定的還原性,具有抗氧化活性[31]。此外,相關研究證實,強化免疫是多糖的一個重要的生理活性,而β-型異頭碳是保證此活性的重要條件之一,889 cm-1左右較小的特征吸收峰證明POJ具有β-構型的異頭碳,說明POJ可能具有免疫強化的活性[32]。另有研究表明,多糖的抗氧化活性除了與多糖的單糖組成、分子構象有關,還與其分子質量緊密相關。SU等[33]、YANG等[34]研究表明,純化后多糖的分子質量與其生物活性之間存在密切關系,分子質量越高,多糖的生物活性越強,其清除自由基的能力越高,本研究提取純化后的POJ重均分子質量為19 315 Da,數均分子質量為17 005 Da,本研究提取純化后的POJ分子質量相對較大,其可能具有較高的生物活性。

研究表明,過度運動作為外應激源,易誘發機體發生氧化應激[7]。肝是人體最大的臟器,也是人體新陳代謝的中心,在過度運動疲勞狀態下,肝細胞中會產生大量的代謝產物如ROS和一氧化氮(nitric oxide,NO),這些代謝產物被認為是導致肝功能紊亂的主要元兇。細胞內積累的ROS會攻擊體內脂肪產生脂質過氧化產物MDA,MDA則會使細胞膜發生氧化損傷,從而改變細胞膜的通透性,另外,ROS還會直接作用于肽鍵,使蛋白質發生氧化損傷出現PCO,因此,MDA和PCO是機體氧化損傷的重要標志[35]。SOD、GSH-Px、CAT作為機體重要的抗氧化酶系,可以清除體內過多的ROS,降低細胞的氧化應激水平,保護細胞免受氧化應激損傷。本研究結果表明,過度運動導致小鼠肝臟組織內MDA和PCO含量顯著升高,而抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性顯著降低,在補充POJ后,肝臟組織內MDA、PCO含量顯著降低,抗氧化酶活性則顯著升高,另外,還發現補充的POJ劑量越高,細胞內抗氧化酶活性越強,這一研究結果與李明[36]、SUN等[37]的研究結果相似。此外,FAN等[38]研究發現POJ能夠提高大鼠血清和心肌細胞中抗氧化酶活性,從而緩解心臟組織的氧化損傷,ZHANG等[39]研究發現POJ能夠提高糖尿病大鼠心臟組織抗氧化酶活性,降低MDA含量,維持機體內抗氧化酶水平,從而改善心血管功能。這些研究和本研究結果均顯示,補充POJ后能明顯提高體內抗氧化酶活性,保護機體免受氧化應激損傷。

AMPK/Nrf2/HO-1信號通路在抗氧化、抗炎、提高免疫、保護細胞免受損傷等作用上,均發揮著重要作用。研究表明,該信號通路是機體細胞內調節氧化應激水平的重要信號途徑[40-41]。在肝臟的氧化應激作用上,已有較多學者研究發現,該信號通路上的Nrf2轉錄因子不僅能被外源物質激活還能被AMPK激活,激活后的Nrf2能從二聚體中解離進入細胞核并出現高表達,繼而與抗氧化應答元件ARE結合,誘導下游抗氧化酶基因的高表達,從而降低肝細胞的氧化應激反應[42-43],LEE等[44]研究表明,激活肝臟組中AMPK/Nrf2/HO-1信號通路有利于緩解細胞的氧化應激作用。本研究結果顯示,運動模型組小鼠肝臟組織中AMPKα、Nrf2、HO-1的mRNA的均出現了高表達,可見,過度運動作為外源物質激活了AMPK/Nrf2/HO-1信號通路,與運動模型組相比,在補充POJ后,AMPKα、Nrf2、HO-1的mRNA的表達量進一步顯著提高。此外,運動模型組中AMPK/Nrf2/HO-1信號通路下游抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)基因的mRNA表達量出現了一定程度的下降,說明此時的肝臟組織處于較嚴重的氧化應激中,推測大量激增的ROS導致肝臟抗氧化水平不足以應對,抗氧化酶活性均低于正常水平。補充POJ后,肝臟中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)基因的mRNA表達量均出現了顯著提高,說明,POJ可大大的激活AMPK/Nrf2/HO-1信號通路,促進下游SOD、GSH-Px、CAT的mRNA的高表達。近年來較多的研究表明,機體處于疲勞狀態時,不僅肝臟組織會受到一定程度損傷,還常常伴隨著腸道菌群紊亂,腸道和肝臟看上去是體內2個作用完全不同的器官,然而當腸道菌群紊亂時,會增加腸道的通透性,使腸道內的一些毒素向外滲,其經過血液循環流向肝臟,進一步加劇了肝臟組織的損傷[45-46]。因此,下一步將會研究POJ是否會改善過度運動疲勞狀態下小鼠的腸道菌群,以期進一步解析POJ對運動疲勞小鼠的具體作用機制。

4 結論

本研究通過熱水浸提并純化得到POJ,凝膠滲透色譜分析顯示POJ重均分子質量為19 315 Da,數均分子質量為17 005 Da。經單糖組成分析發現,POJ是由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖組成,摩爾比為4.35∶5.21∶1.34∶1,紅外光譜顯示POJ的異頭碳為β構型,體外抗氧化結果表明,在一定范圍內,POJ清除自由基的能力隨著質量濃度的增加而顯著提高。肝臟損傷模型結果顯示,POJ能顯著提高肝臟組織抗氧化酶活性,同時還具有修復肝臟細胞損傷的作用;此外,還發現POJ能激活AMPK/Nrf2/HO-1信號通路,提高該信號通路上抗氧化蛋白和酶基因mRNA的表達;結果表明,POJ具有改善過度運動引起小鼠肝臟氧化損傷的作用。由此可見,川麥冬多糖可作為運動添加劑應用于功能食品上。