奎寧酸的抗氧化活性和神經保護作用研究

王碩,梁婷,羅磊,劉永清,方勇,李森*,管驍

1(上海理工大學 健康科學與工程學院,上海,200093)2(國家糧食產業(城市糧油保障)技術創新中心,上海,200093) 3(南京財經大學 食品科學與工程學院,江蘇 南京,210023)

近年來,氧化應激和神經炎癥在神經疾病中的作用受到廣泛關注。氧化應激是指機體對活性氧(reactive oxygen species, ROS)的清除效率低于其產生效率,導致機體、組織及細胞受到氧化損傷[1]。生物體內與氧代謝有關的含氧自由基和易形成自由基的過氧化物統稱為ROS。其含有不成對的電子,因而具有較高的化學反應活性。為了防止氧化損傷,機體內的抗氧化系統會消除ROS的毒性影響,抗氧化系統主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和過氧化氫酶(catalase, CAT)等抗氧化酶和非酶類抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione, GSH)等[2]。健康機體的細胞行使正常功能需要ROS和抗氧化系統處于一個相對平衡的狀態,過量的ROS會導致細胞大分子(DNA、脂質和蛋白質)受損[3],當打破這一平衡,ROS會攻擊細胞膜導致細胞分子結構改變從而造成細胞功能障礙,也可以使蛋白質交聯導致蛋白質變性及酶的失活。

氧化應激和神經炎癥是兩種病理狀態,但它們相互關聯并相互影響[4]。當機體的還原和氧化反應處于平衡狀態時,炎癥反應可以作為一種防御機制發揮作用。ROS水平過高時,氧化應激會造成能量代謝受損、細胞信號傳導和細胞周期改變、細胞轉運機制受損及生物活性功能失調,產生炎癥反應[5]。ROS可以進一步引起主要大分子的修飾,在復雜的生物體中,氧化的蛋白質可能通過形成細胞毒性聚集體而獲得毒性功能。氧化后的蛋白質、核酸和脂質等大分子直接影響關鍵神經炎癥介質,而神經炎癥可以誘導NADPH氧化酶的表達及其活性的增加,導致產生高度氧化的環境[6]。另外,ROS的積累和線粒體功能障礙與中樞神經系統的疾病有關[7]。過度的氧化應激可能會使大腦功能喪失,TELEANU等[4]發現ROS與抗氧化劑之間的不平衡以及氧化應激通過影響細胞穩態、Aβ和р-tau的形成上調來影響阿爾茲海默癥的發生。

植物多酚是一種廣泛存在于植物中的次生代謝物,具有極好的抗氧化能力。有研究表明,多酚及其衍生的代謝產物能夠有效地減少氧化應激和炎癥,改善神經系統疾病[8-9]。另外,前期研究發現小米多酚通過抑制氧化應激發揮神經保護作用,而奎寧酸是小米多酚的主要成分之一[10]。雖然奎寧酸已被廣泛的用于合成具有抗氧化和抗菌作用的藥物[11],但對于奎寧酸在神經細胞中的抗氧化功能和抗炎作用并沒有太多的報道。因此本研究采用H2O2誘導的SH-SY5Y神經細胞氧化應激損傷模型驗證奎寧酸的抗氧化活性和神經保護作用,為進一步探討奎寧酸在預防和治療氧化應激相關疾病中的作用機制提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y,中國科學院;奎寧酸,上海源葉生物科技有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、DMEM-F12培養基、青霉素鏈霉素、胰酶、引物序列(Primer Premier 5.0 軟件設計)、PIPA裂解液,上海生工生物工程股份有限公司;H2O2,上海國藥集團化學試劑有限公司;BCA蛋白濃度試劑盒、動物RNA抽提試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、GSH試劑盒、MTT細胞增殖及細胞毒性測定試劑盒、SOD試劑盒、BeyoColorTM彩色預染蛋白分子質量標準(10～170 kDa)、聚偏二氟乙烯膜、鼠抗腫瘤壞死因子(TNF-α)、兔抗白介素-1β(IL-1β)、極超敏ECL化學發光試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司;Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix、HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper),南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

MCO-20AIC型CO2細胞培養箱,日本三洋;BSC-1300IIA2型超凈工作臺,江蘇凈化設備有限公司;HH-W-600水浴鍋,金壇市江南儀器廠;S1000TM Thermal Cycler梯度PCR儀、ChemiDocTMImaging System凝膠成像系統,美國BIO-RAD;TGL-25M高速冷凍離心機,美國ALPHA公司;Thermo Lifetech ABI QuantStudio3,美國Thermo;Synergy HTX多功能酶標儀,美國Berten;WH-861渦旋混合器,太倉華立達公司;碎花冰制冰機,松下冷鏈(大連)有限公司;電泳儀,北京六一生物科技有限公司;脫色搖床,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;LE104E/02電子天平,梅特勒-托力多儀器(上海)有限公司;PH-140A電熱鼓風干燥箱,上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SH-SY5Y細胞的培養

在37 ℃下,SH-SY5Y細胞在5%(體積分數)CO2的細胞培養箱中生長至對數期。培養基為含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM-F12培養基。另外,SH-SY5Y細胞具有中等水平的多巴胺β羥化酶活性,其起源于神經母細胞瘤。在用于后續的實驗前應用10 μmol/L全反式維甲酸(all-transretinoic acid,ATRA)誘導SH-SY5Y細胞48 h,使其向神經元分化,細胞形態及生理功能等隨之發生改變,與成熟的神經細胞非常相似。

1.3.2 H2O2誘導的氧化應激模型的建立及奎寧酸處理

實驗分為空白對照組(Control)、過氧化氫組(H2O2)、奎寧酸組(H2O2+Quinic)。參考文獻[12]中方法,H2O2+Quinic組先用奎寧酸(50、100、200、300 μg/mL)誘導SH-SY5Y細胞12 h 后,再用300 μmol/L的H2O2誘導SH-SY5Y細胞15 h,建立氧化應激模型。對照組不經任何處理,H2O2組僅用300 μmol/L的H2O2處理。

1.3.3 細胞活力測定

通過3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)細胞增殖及細胞毒性測試評估奎寧酸對H2O2誘導的SH-SY5Y細胞活力的影響。將生長密度為90%的細胞先用Hanks洗滌,然后使用胰蛋白酶將其消化,并按數量為104個細胞/孔接種在細胞96孔板中,培養24 h使其完全貼壁。根據MTT說明書方法,MTT與SH-SY5Y細胞反應后,通過酶標儀測定其在570 nm處的吸光度。最后結果為實驗組與對照組相比得出。

1.3.4 SH-SY5Y細胞內抗氧化指標的測定

將培養至對數期的SH-SY5Y細胞轉移至6孔板中,用10 μmol/L全反式維甲酸處理48 h后,再更換新的DMEM-F12培養基培養12 h。按照1.3.2節的方法經奎寧酸和H2O2處理后收集細胞,按照相應的試劑盒說明書測定MDA、GSH含量和SOD活性。

1.3.5 RNA提取及實時熒光定量PCR分析

采用實時熒光定量PCR檢測不同組SH-SY5Y細胞抗氧化酶因子和炎癥因子的相對表達量。將培養好的SH-SY5Y細胞棄去培養基,加入適量的Hanks清洗兩遍,使用RNA提取試劑盒提取各SH-SY5Y細胞總RNA,依據逆轉錄說明書將其逆轉錄為cDNA,進行后續的實時熒光定量PCR檢測。內參基因為β-actin,抗氧化酶Sod1、Sod2、Cat、Gpx2以及炎癥因子IL-1β和TNF-α等基因的引物序列(5′-3′)見表1,ΔΔCt用于計算基因的相對表達量。

表1 實時定量PCR引物序列Table 1 Real time quantitative PCR primer sequence

1.3.6 蛋白印跡分析細胞炎癥因子表達

采用蛋白免疫印跡法檢測不同分組中SH-SY5Y細胞炎癥因子TNF-α和IL-1β的蛋白表達情況。H2O2造模結束后的SH-SY5Y細胞,使用RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白,用BCA試劑盒測定細胞蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性10 min。按照之前報道的方法進行Western blot檢測[13]。配制SDS-PAGE用于分離各樣品中等量的蛋白質。濃縮電壓為80 V,分離電壓為120 V。200 mA×1.5 h轉膜后,使用50 g/L脫脂牛奶將聚偏二氟乙烯膜封閉2 h。封閉結束后,分別與β-actin、TNF-α和IL-1β抗體(稀釋倍數為1∶1 000)在4 ℃冰箱孵育過夜。孵育結束后TBST每10 min洗膜1次,3次過后,與對應的二抗(稀釋倍數為1∶10 000)室溫孵育2 h,TBST緩沖液洗膜3次后使用極超敏ECL發光試劑盒對蛋白條帶呈像,并利用Image J軟件計算灰度值。

1.4 數據分析

本研究采用3次重復實驗,使用GraphPadTMPrism 8.0版和SPSS Statistics 25等軟件對實驗數據進行分析和處理,最終結果以平均值±標準差表示,以P<0.05表示組間差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 奎寧酸可提高SH-SY5Y細胞在氧化應激下的活力

H2O2是一種強氧化劑,低濃度的H2O2是一種信號分子可以調控細胞的生長,而一定量的H2O2可以使SH-SY5Y細胞的細胞膜脂質過氧化,可導致細胞凋亡。在細胞實驗中,作為重要的氧化應激誘導物,H2O2對細胞模型中的氧化應激機制的研究具有重要的意義[14]。因此,建立H2O2誘導的SH-SY5Y細胞以評估奎寧酸的保護作用。

如圖1所示,在300 μmol/L H2O2處理細胞15 h后,檢測細胞活力,發現H2O2組細胞活力顯著降低(P<0.01),說明H2O2誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激模型建立成功。而當利用不同濃度奎寧酸處理后細胞活力有顯著上升,其中經過100 μg/mL奎寧酸處理的SH-SY5Y細胞的活力最強,但更高質量濃度(200、300 μg/mL)的奎寧酸處理并沒有顯著的作用,說明100 μg/mL是奎寧酸的最適質量濃度。該實驗結果表明,奎寧酸預處理可抑制氧化應激引起的細胞活性下降,對SH-SY5Y細胞起到保護作用。

圖1 不同濃度奎寧酸對H2O2誘導下SH-SY5Y 細胞活力的影響Fig.1 Effect of different concentrations of quinic acid on the cell viability of SH-SY5Y under the inducation of H2O2

2.2 奎寧酸對H2O2誘導的SH-SY5Y細胞抗氧化功能的影響

抗氧化劑的抗氧化能力取決于分子結構,其苯環上的—OH位置和數量決定了清除自由基的能力,自由基可以從酚羥基得到氫原子或單個電子,使其失去氧化性,變成穩定的自由基[15]。有研究證明奎寧酸衍生物具有發揮抗氧化活性的主要官能團及對各種自由基的清除能力[16]。除了抗氧化劑外,機體自身的抗氧化能力也是對抗氧化應激損傷的重要防御系統?？寡趸富盍Φ母叩痛碇宄w內自由基的能力,其中抗氧化酶活力越高,抗氧化能力越強,能夠有效地清除體內的自由基。另外,當體內MDA含量開始降低時,則表明機體的抗氧化狀態得到了改善。

為了進一步研究奎寧酸對細胞抗氧化能力的影響,本研究測定了在100 μg/mL奎寧酸處理下,SH-SY5Y細胞中SOD、GSH和MDA的含量(圖2)。實驗結果顯示,H2O2抑制了細胞中SOD的活性,降低了GSH在細胞中的水平(圖2-a、圖2-b),并增加了MDA含量(圖2-c),表明H2O2使SH-SY5Y細胞的氧化應激水平增加、抗氧化能力下降;而奎寧酸預處理顯著上調了SOD的活性和GSH的水平,并降低了MDA水平,說明奎寧酸預處理抑制了H2O2引起的SH-SY5Y細胞氧化應激水平的升高并加強了細胞的抗氧化能力。

a-SOD;b-MDA;c-GSH

對于氧化應激相關基因表達水平的檢測也進一步證實了奎寧酸對神經細胞抗氧化能力的調控作用(圖3)。Sod1、Sod2、Cat、Gpx2的相對表達量在H2O2處理后降低,而奎寧酸預處理恢復了Sod1、Sod2、Cat、Gpx2的表達水平。以上結果表明,奎寧酸可顯著提高神經細胞面對氧化應激的抗氧化能力,在H2O2誘導的氧化應激中發揮了重要的抗氧化作用。

圖3 細胞抗氧化相關基因表達水平的變化Fig.3 Changes in the expression levers of antioxidant-related genes in cells

2.3 奎寧酸對H2O2誘導SH-SY5Y細胞中炎癥因子表達的影響

由于氧化應激的增加會使氧反應性物質(oxygen reactive substance,ORS)和氮反應性物質(nitrogen reactive substance,NRS)水平升高,從而進一步刺激促炎因子和趨化因子在細胞中得到釋放,引起細胞炎癥水平升高,加重神經損傷[17]。已有研究證明小米多酚的攝入具有抗炎作用[9],因此本研究利用實時熒光定量PCR進一步研究了奎寧酸對H2O2誘導的神經細胞中炎癥因子表達的調控作用。結果表明,H2O2誘導使SH-SY5Y細胞中促炎因子IL-1β和TNF-α的表達顯著升高,而奎寧酸處理則顯著抑制了促炎因子的表達(圖4)。

圖4 SH-SY5Y細胞炎癥因子表達水平的變化Fig.4 Change of the expression level of inflammatory factors in SH-SY5Y cells

對炎癥因子的蛋白水平免疫印跡檢測發現,與對照組相比,經H2O2處理后,炎癥因子TNF-α和IL-1β在蛋白水平上的表達量相比于Control組有顯著性提高(P<0.05),而經過奎寧酸預處理后,均明顯降低(P<0.05)(圖5)。以上結果表明,奎寧酸可以通過抑制氧化應激引起的炎癥對神經細胞起到保護作用。

a-Western blot檢測TNF-α、IL-1β蛋白水平;b-IL-1β定量分析;c-TNF-α定量分析

3 結論與討論

多酚是膳食中重要的功能因子,具有優異的抗氧化性能。關于小米多酚中重要活性物質-奎寧酸及其衍生物的炎癥抑制作用已有報道。例如,?KESSON等[18]和AHN等[19]發現奎寧酸及其衍生物可以抑制NF-κB活化來抑制炎癥的發生。PERO等[20]研究表明奎寧酸可以通過胃腸道菌群轉化為色氨酸和煙酰胺,最終抑制NF-κB的活性,并使得DNA修復增強。1,5-二咖啡?？鼘幩峥梢酝ㄟ^抑制α-synuclein的過度表達來減輕PC12細胞的氧化應激[21],部分奎寧酸代謝物可以抑制小膠質細胞的活化從而起到神經保護作用[22]。而目前缺乏奎寧酸對神經細胞的保護作用的直接證據,奎寧酸單體對神經細胞氧化應激和炎癥的抑制作用仍需進一步研究。

本研究以小米多酚中的奎寧酸為研究對象,采用H2O2誘導SH-SY5Y細胞,通過MTT細胞增殖及細胞毒性測試,發現在加入奎寧酸培養后,面對H2O2誘導的氧化應激,SH-SY5Y細胞的活力與H2O2組相比顯著升高。對于奎寧酸的抗氧化功能的研究發現,奎寧酸提高了SH-SY5Y細胞中抗氧化酶SOD的活性、GSH水平并降低MDA的含量,并且提高了抗氧化相關基因Sod1,Sod2,Cat和Gpx的表達水平,增強了SH-SY5Y細胞的抗氧化能力。同時,奎寧酸可通過抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的表達來抑制氧化應激引起的炎癥水平升高,起到對SH-SY5Y細胞的神經保護作用。

綜上,本研究的實驗結果表明了奎寧酸的抗氧化和神經保護作用,為奎寧酸在預防和治療氧化應激相關神經系統疾病提供了理論基礎。