茶葉制備血管緊張素轉換酶抑制肽可行性及功能分析

李 麗，陳 潔

（南華大學附屬第二醫院，湖南 衡陽 421001）

中國是全球第一大茶生產大國，2017年度，干茶總產量達到258萬噸。在對茶進行深加工的研究中，茶的深加工范圍也在持續擴大，速溶茶、茶飲料以及茶多酚等茶深加工產品的產量在快速地增加。在我國，由于我國茶園的規模不斷擴大，在生產中會產生大量的殘留物。因此，對其進行高效處理，將其轉化為可再生資源，成為當前急需突破的技術難題。

1 研究意義

在全世界范圍內，每年都有越來越多的人患上高血壓，這給衛生體系帶來了很大的挑戰。因此，對高血壓病的預防和治療一直是醫學領域的一個難點。將具有降壓作用的天然植物蛋白質轉化為具有降壓功效的多肽，以其為原料，研制成功能化的藥物已成為當前的研究和發展方向。茶葉活性物質是一種具有最大保健作用的天然物質，其活性物質如茶多酚、茶黃素、茶多糖、茶氨酸等與人體健康有關的科研報告也在不斷增多[1]。茶中所含的各種活性物質對身體具有一定的保健作用，對其進行合理的開發和應用已成為國際上的一個熱門話題。

中國是茶的起源地，也是全球首位的種植和生產大國。近年來，隨著茶葉的種植面積和產量的不斷擴大，每年都會生產出大量的茶和深加工后產生的廢料，也說明了我國擁有豐富的茶葉蛋白資源。研究者在前期工作的基礎上，通過分離純化茶葉中的蛋白質，利用酶水解法，從茶葉中分離得到的 ACE抑制多肽，并通過動物實驗驗證其降壓效果，闡明其降壓機理，為進一步研發新型的茶葉降壓多肽產品奠定基礎，同時也可以進一步拓展茶葉深加工產品種類，降低茶葉資源的浪費，提高茶葉的附加值，延長茶葉產業鏈，提高人們的體質和體質，從而推動我國茶葉產業快速發展[2]。

2 ACE抑制肽的來源及結構

早在1965年，Ferreira等人從蛇毒中首次發現了 ACE抑制多肽，并以其為模式藥物，開發了一系列的ACE抑制劑，其中包括目前仍然被廣泛應用的卡托普利。在1979年，Oshinma等人利用細菌的膠原蛋白對明膠進行降解，得到了6個活性很高的ACE抑制多肽。蛋白質來源是決定酶水法合成降壓多肽的活性及收率的重要因素，但因蛋白質結構差異，導致其酶水法合成降壓多肽，其降壓作用也不盡相同。多肽的分子質量通常低于10kDa，含有不超過100個氨基酸，其抗腫瘤作用的強弱與多肽的分子質量及氨基酸組成密切相關。已有研究顯示，分子質量小于1kDa的多肽碎片，其降壓效果更好。通常情況下，具有較多的疏水氨基酸，尤其是具有較高的酪氨酸，具有較好的降壓作用。盡管疏水型氨基酸不會提高多肽在水相中的溶解性，但是卻可以提高多肽在油脂環境中的溶解性，從而提高多肽的降壓效果。肽段的C端為脯氨酸或芳香族氨基酸，具有良好的降血壓作用，N端為長鏈或含支鏈的疏水性氨基酸，具有良好的降血壓作用，N端為脯氨酸則具有一定的降壓作用。此外，已有報道顯示，ACE抑制劑的活性與其結構具有較強的相關性[3]。

3 ACE抑制肽制備方法

3.1 超濾

超濾是一種以高壓為驅動力的膜分離技術，在多種生物大分子、多種小分子的分級分離、濃縮以及海水淡化等方面有著重要的應用。杜璟等人采用超濾法制備了一種含有3ku分子量的多肽水溶液，其ACE抑制效果最好。前期研究發現，在3ku的超濾層中，雙低型小白菜的降壓活性顯著增強，其滲透物IC50降低15%。利用10kDa、3kDa的超濾膜對條斑紫菜降壓肽段進行了研究，發現其ACE抑制活性在3kDa以下，其IC50從0.844mg/mL下降到0.523mg/mL。采用超濾技術從豇豆中提取降壓多肽，結果表明，在1kDa以下的超過濾組分具有較好的降壓效果。

3.2 凝膠色譜

凝膠層析技術是基于蛋白質網絡的特點，依據蛋白質分子大小和形狀的不同，將蛋白質分子從蛋白質網絡中分離出來的一種新方法。目前，凝膠層析技術已被廣泛應用于降壓活性多肽的研究。在大氣壓下，通常使用的是瓊脂糖（SePHadex)G-15、G-25以及聚丙烯酰胺（Biogel）的Bio-gelP-2、P-4、P-6、P-10等多種形式的葡萄糖（gel）作為大氣壓下的凝膠層[4]。

利用凝膠電泳（SePHadex）G-25對米糠蛋白水解液進行了分離，獲得了3個組分，分別是F2（IC50=0.24mg/mL）和ACE（IC50=32μg/mL），對DPPH自由基的清除作用最大。使用SePHadexLH-20凝膠過濾色譜對牡蠣蛋白水解產物進行了分離，得出三個組分的IC50值分別為1.2mg/mL、0.49mg/mL和0.53mg/mL。使用凝膠過濾色譜的方法，對雞蛋水解產物進行了分離，從而獲得了高活性的ACE抑制肽，并對其中一種肽的氨基酸序列進行了分析，得出Arg-Val-Pro-Ser-Leu的結果。

4 茶葉蛋白研究現狀

我國茶樹資源豐富，茶葉生產歷史悠久。茶葉是中國的一種傳統和特色的農業經濟作物，茶葉種類繁多，茶葉產地面積廣闊，中國是全球最重要的茶葉生產國、出口國和消費國。茶葉生物化學組分種類繁多，蛋白質含量高達20%-30%，但大部分非水溶性，只有1%-2%的蛋白質屬于可溶蛋白。從遠古時代起，茶就被人類用作藥材，并得到了廣泛的應用。近年來，隨著現代科技的進步，以及對茶樹生化、藥理學等方面的研究，對茶樹營養物質的健康作用也日益引起了人們的重視。茶蛋白質中約80%為大分子，且谷蛋白與谷蛋白之間存在二硫鍵與疏水性官能團的相互作用，導致其不易溶于水，不易被人體吸收，極大地制約了茶蛋白質的應用[5]。

5 茶葉蛋白的制備

5.1 茶葉蛋白的提取

從植物中分離出蛋白質主要有堿法、酸法和酶法。茶葉中含有超過80%的堿可溶蛋白質，堿性溶液可以解離茶素中的極性基，使其表面電荷趨于一致，打破蛋白質間的氫鍵，提高其溶解度，提高其萃取效率。在此基礎上，提出了一種新的茶樹籽蛋白萃取方法，其萃取效率可達61.86%，而在超聲技術的幫助下，將茶樹籽蛋白萃取效率從單純的堿萃取方法的49.3%提升至86.5%。雖然采用堿法制備的茶樹蛋白質產量高、生產費用低廉，但需采用高堿含量時，才能得到高得率[6]。

在堿性溶液中，高含量的堿性溶液使其營養性質改變，并產生賴-丙氨酸等有毒化合物，使其營養成分流失。另外，在高密度的堿性溶液中，容易導致蛋白質和糖類等產生美拉德反應，造成茶葉蛋白質的不可逆變性，并導致了某些非蛋白質的溶解，從而增大了蛋白質的分離難度。研究結果顯示，在 PH高于7.0后，茶葉蛋白提取率會隨著PH升高而提升。但是，鹽析后的蛋白質沉淀物并不容易對其進行脫色，而且蛋白質容易與茶多酚形成具有較低營養價值的沉淀。

在酶法中，利用到的酶以蛋白酶為主，蛋白酶可以對茶葉中的蛋白質進行改性和降解，從而使得其肽鏈縮短，分子量減小。利用蛋白酶對茶中蛋白質進行降解，并對與之連接的其他成分進行降解，可加快茶中蛋白質的溶解速度。相對于堿浸出，酶浸出工藝要求較低，且不會造成對蛋白養分的損傷，能夠最大限度地保持蛋白的營養和功能性[7]。

結果表明，采用堿性蛋白酶對茶樹中的蛋白質進行了萃取，萃取得率可達34.2%。當前，茶樹中蛋白質的酶法制備技術還不夠完善，存在著得率不高、成本高等問題，限制了該技術的工業化推廣。擬通過對茶樹中蛋白質的酶學性質等方面的深入探索，進一步完善茶樹中蛋白質的酶學性質，為茶樹中蛋白質的產業化提供理論依據。

復合工藝是將酶法和堿法結合在一起的一種工藝，也就是采用一次用堿液或酶液來一次提取茶葉蛋白，然后用另外一種工藝來二次提取茶葉蛋白。該方法僅用少量的堿性溶液，就可以獲得很高的蛋白浸出率，并且保留了茶樹蛋白原有的營養和功能性。利用堿溶法、酶水法、酸水法分別對茶葉蛋白質進行處理，得到了茶葉蛋白質，具體公式為：

萃取得率=（蛋白質質量/茶葉質量）×100%（1）

5.2 茶葉蛋白的純化

目前，對茶中蛋白質的研究主要集中在三個方面，即沉淀、脫色和淡化。因為在沉淀后的茶葉蛋白仍然具有較深的顏色，所以在沉淀后，還需要對茶葉蛋白進行脫色，其中的脫色方法主要有：有機溶劑脫色法、活性炭吸附法和過氧化氫脫色法等。用水提取法可以除去因茶樹褐色而引起的水溶性黑色素。目前，活性碳雖能對顏料進行有效的吸收，但其對顏料的選擇能力較差，易導致一些已解離態的蛋白在其表面被吸附，導致蛋白丟失。而在有機試劑萃取法中，大多以丙酮為主，通過丙酮洗脫后，所獲得的茶葉蛋白的脫色效果十分顯著。與此同時，丙酮還可以被循環使用，與活性炭脫色的方法相比，丙酮清洗脫色法獲得的茶葉蛋白的提取率也比較高。

5.3 茶葉蛋白的功能性質

除了具有一定的營養價值之外，還具有其它一些理化特性，例如溶解性，起泡性，乳化性，粘度等。蛋白的功能特性對食物的感覺品質有很大的影響，在食物的制備、加工和儲存等環節中，蛋白的理化性能也會有很大的改變，這也是蛋白制品在食物中的運用的一個關鍵問題。很多蛋白質的內部因素都會對其的功能特性產生影響，具體有：蛋白質的大小、形狀、結構、疏水性與親水性之比、氨基酸組成與序列、分子的柔性與剛性、靜電荷的分布以及分子之間的相互作用等。

外部環境也會對蛋白質的功能特性產生影響，比如溫度、鹽濃度、PH值、壓力、貯存條件等，都會導致蛋白質的功能特性發生變化。根據調查顯示，在等電點（PH4.0）附近，茶渣蛋白的溶解性是最低的，其乳化性及乳化穩定性隨著 PH的變化而與溶解性呈現出同樣的趨勢，在等電點附近，其起泡穩定性也是比較好的，其吸油性為0.85g油/g蛋白，其吸油性比大豆蛋白粉要好，但是比大豆分離蛋白要差。

6 高血壓及其治療方式

高血壓作為一種常見病，并可導致腦、心、腎等多個靶組織的損傷，是導致心血管病致死的重要因素。不斷增長的血壓升高對全球衛生體系提出了巨大挑戰，數據顯示，2015年世界范圍內，高血壓患病人群約為11.3億，而在中國，高血壓病人數量更是突破了兩億。所以，對其防治一直是醫學領域的一個難點問題，對高血壓的藥物和治療的研究也越來越多。鈣通道阻斷劑、血管緊張素轉換酶抑制劑、β-受體阻斷劑、血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑、利尿劑等都是臨床上比較常見的降壓藥物。這幾種降壓藥的降壓作用都很好，但是它們都有一些不良反應，或者是不適合特定的人群，所以它們的持續使用會有一些局限性[8]。

比如，β-受體阻斷劑會引起眩暈、胃腸紊亂、對糖脂代謝產生影響，所以不適用于鼻竇性心動過緩、重度房室傳導阻滯和支氣管哮喘患者，ACE抑制劑藥物會引起無痰干咳或血管性水腫，活動性肝炎、肝病患者、高鉀血癥、嚴重腎功能損傷以及懷孕早期等也都不適用。從植物和動物中，開發出一種安全有效、毒副作用小，可以替代西藥的天然降壓活性物質，正日益被研究者們所重視。對食源性多肽進行研究，并開發出一種能夠幫助或替代高血壓藥物的功能食品，這對于高血壓的防控具有十分重大的意義[9]。

7 高血壓的抑制機理

高血壓的發生與遺傳、環境及其它多種原因有關，例如：高鹽攝入，交感神經活動增強，飲食中鉀鈣攝入不足，內皮功能受損，RAS活性增高，血管阻力增高，VGF活性增高，VEGF活性升高，血管阻力升高，血管生長因子活性增高等。自1952年Skeggs LT等人首先闡明Respons-Angiogenesis系統并闡明其在心血管中的重要調控功能以來，并對這一內分泌系統的構成和功能進行了廣泛研究。

AngII作為 RAS系統的關鍵組分，可通過活化 AngII Type1，增加glycine glycin分泌，增加交感神經活性，從而引起血壓升高。AngII還可以活化腎臟中的AT1，刺激腎上腺的醛固酮的分泌，或者是通過中樞神經系統引發口渴，進而對鈉和水的再吸收產生影響，進而對血壓進行調控[10]。

8 結語

高血壓作為一種常見病，可促進AS進展或提高其對AS的易感，并可導致腦、心、腎等多個靶組織的損傷，是導致心血管病致死的重要因素。從茶葉開發出一種安全有效、毒副作用小，可以替代西藥的天然降壓活性物質，正日益被研究者所重視。對食源性多肽進行研究，并開發出一種能夠幫助或替代高血壓藥物的功能食品，這對于高血壓的防控具有十分重大的意義。