在明串珠菌構建高產甘露醇的細胞工廠

劉成川,金紅星

(河北工業大學 化工學院,天津,300401)

甘露醇是具有多種功效的一種六糖醇,被廣泛地應用于醫藥、食品、化工和電子等行業[1-2]。目前主要有4種方法生產甘露醇:海藻提取法產生大量廢水、能耗高、污染嚴重;催化加氫法需在高溫高壓、貴金屬催化和通氫氣條件下進行且產物分離困難[3];酶轉化法需要昂貴的輔酶,天津工業生物技術研究所構建了一鍋化學計量合成法,但甘露醇產量只有9.6 g/L[4];微生物發酵法產甘露醇具有綠色清潔的特點,滿足了產業轉型升級的迫切需要。產甘露醇的細菌、酵母和霉菌中,進行異型乳酸發酵的細菌效果較好[5],其中明串珠菌、酒球菌和乳桿菌等[6]可將果糖底物轉化為甘露醇。近幾年本課題組[7-12]也嘗試了基因敲除、基因過表達等手段改造菌株,轉化率雖然較高,但甘露醇產量還未達到合成生物學“定量”投資邏輯學[13]和大宗化學品的高轉化率、高產物濃度[14]的標準。另外,江南大學篩選獲得了較優性能的甘露醇脫氫酶LpMDH編碼基因和葡萄糖脫氫酶BaGDH編碼基因并在大腸桿菌中共表達,以D-果糖為底物發酵24 h獲得D-甘露醇的最高產量為81.9 g/L[15];HANKO等[16]利用鉤蟲貪銅菌經還原型戊糖磷酸循環途徑自養生產了甘露醇,但產量只有3.9 g/L。

本研究提出了將底盤細胞轉化為高產目標產物菌株的理論:細胞工廠的“源-庫”學說,以便指導細胞工廠的遺傳育種工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)CCTCC M2018815[Δdts1ΔldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdhΔaldh::(mtld-mlp)]、CGMCC1.10327、CCTCC M2020762[CCTCC M2018815 0385/0386::ldhA-eeΔadh::mepΔldh(0503)::mepΔldh(0373)::mep]、大腸桿菌(E.coli)DH5α、質粒pUC19均由本實驗室保存。

1.1.2 試劑

高保真的DNA聚合酶、T4DNA連接酶,謙泰生物技術有限公司;PCR純化試劑盒,Axygen公司;限制性內切酶、氨芐青霉素,大連寶生物工程有限公司;引物、FDH基因編碼序列,金唯智生物科技有限公司(表1)。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.1.3 培養基與培養條件

E.coli用LB培養基培養,培養溫度37 ℃;L.mesenteroides用MRS培養基培養,培養溫度30 ℃。

1.1.4 儀器

Eppendorf Mastercycler?nexus PCR儀,Eppendorf;Bio-Rad Gene Pluser XcellTM電轉化儀,Bio-Rad;Agilent LC-20AD CTO-20A高效液相色譜儀,Agilent。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因表達盒的構建

(1)FDH基因表達盒:根據GenBank中登錄號為AJ011046的博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)的fdh(NAD+依賴型甲酸脫氫酶即EC 1.2.1.2)編碼序列,按照明串珠菌染色體的密碼子偏好性優化了核苷酸序列,并委托公司人工合成DNA序列。以L.mesenteroidesCGMCC1.10327染色體DNA為模板,利用一對引物ldhA1/ldhA2 PCR擴增D-ldhA基因的表達元件;利用一對引物FDH1/FDH2 PCR擴增FDH編碼序列;通過重疊延伸PCR將D-ldhA基因表達元件和FDH編碼序列連接成為FDH基因表達盒。

(2)0386基因表達盒:以L.mesenteroidesCGMCC1.10327染色體DNA為模板,利用2對引物ldhA-ee1/ldhA-ee2、0386-1/0386-2,通過重疊延伸PCR將表達元件序列和0386編碼序列連接成為0386基因(部分序列)的表達盒。

1.2.2 同源重組載體的構建

(1)用于打斷0385-0386操縱子和重疊基因模式的同源重組載體:利用2對引物0385-0386-l1/0385-0386-l2、0385-0386-r1/0385-0386-r2,通過重疊延伸PCR獲得的產物后將其插入到pUC19的EcoRI和XbaI位點上,成為中間帶有KpnI識別序列的0385-0386基因的同源重組載體。以L.mesenteroidesCGMCC1.10327染色體DNA為模板,利用2對引物0385-1/0385-2、ldhA-ee-0386-1/ldhA-ee-0386-2,進行重疊延伸PCR,其產物為0385(以終止密碼子結束的終止密碼子一側的部分序列)-ldhA-ee-A-0386(以起始密碼子開始的起始密碼子一側部分序列)序列,即中間帶有表達元件序列(ldhA-ee)-A的0385-0386基因同源重組載體。

(2)用于在染色體上定點插入mep序列(甘露醇外排泵蛋白)的同源重組載體:分別利用2對引物(0373-l1/0373-l2、0373-r/0373-r2)(0503-l1/0503-l2、0503-r1/0503-r2)(adhl1/adhl2、adhr1/adhr2),通過重疊延伸PCR后將其獲得的產物插入到pUC19的EcoRI和XbaI(乙醇脫氫酶基因同源重組載體為SalI)位點上,分別成為中間帶有KpnI識別序列的0373(乳酸脫氫酶)、0503(乳酸脫氫酶)和乙醇脫氫酶基因的同源重組載體。

(3)用于NADH再生的同源重組載體:利用2對引物2043-l1/2043-l2、2043-r1/2043-r2,通過重疊延伸PCR后將其獲得的產物插入到pUC19的EcoRI和HindIII位點上,成為中間帶有XbaI識別序列的2043(乳酸脫氫酶)基因的同源重組載體。

以pCW7[17]為模板,利用一對引物amy1/amy2(amy01/amy02)通過PCR獲得的產物后將其插入到同源重組載體KpnI(XbaI)位點上,成為中間帶有α-淀粉酶基因標記的同源重組載體。分別以mep序列和FDH表達盒序列為模板,分別利用一對引物mep1/mep2(FDH01/FDH02)通過PCR獲得的產物后將其插入到同源重組載體的KpnI(XbaI)位點上,分別成為中間帶有mep序列和FDH表達盒的同源重組載體。

1.2.3 突變菌株的構建和驗證

參照文獻[18]的方法進行明串珠菌的電擊轉化。通過2次同源重組獲得相關序列定點插入到染色體的突變菌株。第一次同源重組:用中間帶有α-淀粉酶基因標記的同源重組載體轉化初始菌株,在平板上獲得藍色的目的菌株,即靶基因失活、帶有標記基因的菌株。第二次同源重組:用中間帶有表達元件序列-A的0385-0386基因同源重組載體或中間帶有mep序列或FDH表達盒的同源重組載體轉化第一次同源重組獲得的目的菌株,在平板上獲得白色的目的菌株,即靶基因失活、定點插入相關序列的菌株。

以染色體DNA為模板,利用一對引物進行PCR,經過瓊脂糖凝膠電泳條帶的大小來驗證定點插入位點失活、插入位點帶有標記基因和插入位點帶有相關序列的菌株。

1.2.4 熒光定量PCR驗證

以原始菌株與突變菌株RNA反轉錄得到的cDNA作為模板,以Test-F/R為引物,進行RT-PCR驗證。以16S rRNA為管家基因,用相對定量2-ΔΔCT法計算0386基因(或FDH基因)在突變菌株與原始菌株之間的相對表達水平,重復3次。

1.2.5 發酵產甘露醇和液相檢測

野生型菌株和突變菌株用發酵培養基[18]進行搖瓶發酵20 h,用HPLC測定甘露醇含量,參照文獻[9]。敲入FDH表達盒菌株的發酵培養基中,添加15 g/L的甲酸鈉。

2 結果與分析

2.1 基因表達盒的構建

第1輪PCR擴增得到了預期長度為1 111 bp的FDH編碼序列(圖1-a)和193 bp的D-ldh基因表達元件(圖1-b)。第2輪PCR通過2個第1輪PCR產物末端的反向互補序列相互退火結合,構建成D-ldh基因表達元件和FDH編碼序列連接在一起的DNA融合體。但是此時該融合體的量比較少,經過第3輪PCR特異性地擴增,成功得到了預期為1 296 bp的FDH基因表達盒(圖1-c)。

a-FDH編碼序列;b-D-ldh基因表達元件;c-FDH基因表達盒;d-D-ldh基因表達元件和0386部分編碼序列;e-0386基因表達盒+起始密碼子一側的部分編碼序列圖1 合成基因表達盒的重疊延伸PCRFig.1 Overlapping extension PCR for the synthesis of gene expression cassette注:1-MarkerII;2-FDH編碼序列;3-MarkerII;4-D-ldh基因表達元件;5-2K plus Marker;6-FDH表達盒;7-D-ldh基因表達元件;8-Marker;9-0386基因編碼序列(起始密碼子一側的部分);10-0386基因(部分序列)表達盒;11-Marker。

第1輪PCR擴增得到了預期長度為180 bp的D-ldh基因表達元件和810 bp的0386部分編碼序列(圖1-d)。第2輪PCR利用2個第1輪PCR產物末端的反向互補序列相互退火結合,并通過8輪循環使2個DNA片段重疊延伸,經過第3輪PCR特異性地擴增,成功得到了預期為970 bp的0386基因表達盒+起始密碼子一側的部分編碼序列(圖1-e)。

2.2 同源重組載體的構建

構建好的同源重組載體經酶切驗證,其瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2～圖6,可知定點插入位點序列的同源重組載體、攜帶α-淀粉酶基因標記的同源重組載體和攜帶欲敲入序列的同源重組載體都準確無誤。

a-攜帶左右同源臂的同源重組載體;b-攜帶α-淀粉酶基因標記的同源重組載體;c-攜帶欲敲入序列的同源重組載體圖2 用于打破0385-0386操縱子和重疊基因的同源重組載體Fig.2 Vector of homologous recombination for breaking 0385-0386 operon and overlapping gene注:2、3、6-Marker;1-同源重組載體經EcoRI和XbaI酶切產生的載體和左右同源臂連接體;4-攜帶α-淀粉酶基因標記的同源重組載體經KpnI酶切產生的載體+左右同源臂連接體和α-淀粉酶基因表達盒;5-攜帶欲敲入序列的同源重組載體經EcoRI和XbaI酶切產 生的載體和左右同源臂+表達元件序列-A連接體條帶。

2.3 敲入基因表達盒的驗證

設定原始菌株的表達量為1,由RT-定量PCR結果可知,在突變菌株中,0386的相對表達量在打斷操縱子和重疊基因模式的菌株為1.081,敲入1個拷貝mep的菌株為1.450,敲入2個拷貝mep的菌株為2.972,敲入3個拷貝mep的菌株為5.882,證明了兩點,一是打斷操縱子和重疊基因模式也提升基因表達量,二是mep基因表達量隨著0386拷貝數的增加而增加。

RT-定量PCR結果顯示,在突變菌株中FDH的相對表達量0.506,說明原始菌株染色體中沒有的FDH基因在突變菌株中異源表達成功。

2.4 基因的操縱子和重疊基因模式對產甘露醇的影響

在原核生物染色體中的很多基因以操縱子和/或重疊基因模式排列的,操縱子的相鄰結構基因之間或重疊基因插入表達元件(啟動子和RBS)和相關核苷酸序列,可以改善基因表達效率。

具有兩個核苷酸結合域和兩個跨膜結構域的ABC轉運蛋白分為內向轉運蛋白和外向轉運蛋白2種,其中大多數原核生物的ABC型外向轉運蛋白與胞內“有毒物質”的輸出相關。腸膜明串珠菌L.mesenteroidessubsp.mesenteroidesATCC8293的基因組中,注釋為ABC型多藥轉運系統的LEUM_0385和LEUM_0386,經生物信息學分析表明,構成異源二聚體而發揮外排泵的作用。0385和0386以操縱子和重疊基因的方式存在于原始菌株的染色體中,即0385和0386共用同一個表達元件并依次排列著,而且0385和0386的編碼框共用同一個核苷酸(A),見圖7。乳糖操縱子中lacY和lacA表達效率的遠低于lacZ[19],以α-淀粉酶基因為篩選標記、通過2次同源重組打破了基因的操縱子和重疊基因模式,即染色體0385和0386的核苷酸序列(0385的終止密碼子TAA和0386的起始序列tg aca)之間敲入了D-ldh基因的EE(表達元件Expression Element)-A(核苷酸),從而提高0386的表達量,進而增加了甘露醇的產量(見圖8)。本研究將打破操縱子和重疊基因模式的0385-EE-A-0386稱為mep(甘露醇外排泵)。

圖7 0385-0386基因序列在明串珠菌染色體中的排列Fig.7 The arrangement of 0385-0386 gene sequence in Leuconostoc chromosome

圖8 明串珠菌發酵產甘露醇的產量Fig.8 Yield of mannitol produced by Leuconostoc fermentation1-原始野生菌株、底物-蔗糖為90 g/L;2～3-原始菌打破操縱子和重疊基因模式的菌株(2-蔗糖為90 g/L;3-蔗糖為110 g/L);4-CCTCC M2018815、蔗糖為90 g/L;5-CCTCC M2018815打破操縱子和重疊基因模式的菌株、蔗糖為90 g/L;6～7-原始菌adh位點敲入一個拷貝mep序列的菌株(6-蔗糖為90 g/L;7-蔗糖為110 g/L);8～9-原始菌aldh位點敲入一個拷貝AcrB序列的菌株(8-蔗糖為90 g/L;9-蔗糖為110 g/L);10-原始菌打破操縱子和重疊基因模式并乳酸脫氫酶0373位點敲入一個拷貝mep序列的菌株、蔗糖為110 g/L;11-原始菌aldh和dts(葡聚糖蔗糖酶)2個位點各敲入1個拷貝AcrB序列的菌株、蔗糖為110 g/L;12～13-原始菌打破操縱子和重疊基因模式并乳酸脫氫酶0373位點敲入一個拷貝mep序列的菌株(12-蔗糖為90 g/L;13-110 g/L);14～17-原始菌打破操縱子和重疊基因模式并乳酸脫氫酶0373和0503 2個位點各敲入一個拷貝mep序列的菌株(14-蔗糖為90 g/L;15-蔗糖為110 g/L;16-蔗糖為120 g/L;17-蔗糖為130 g/L);18～20-原始菌打破操縱子和重疊基因模式并乳酸脫氫酶0373、0503和adh 3個位點各敲入一個拷貝mep序列的菌株(18-蔗糖為120 g/L;19-蔗糖為130 g/L;20-蔗糖為135 g/L);21～22-CCTCC M2018815打破操縱子和重疊基因模式的菌株并乳酸脫氫酶0373位點敲入一個拷貝mep序列的(21-蔗糖為90 g/L;22-蔗糖為110 g/L);23～26-CCTCC M2018815打破操縱子和重疊基因模式并乳酸脫氫酶0373和0503兩個位點各敲入一個拷貝mep序列的菌株(23-蔗糖為90 g/L;24-蔗糖為110 g/L;25-蔗糖為120 g/L;26-蔗糖為130 g/L);27～29-CCTCC M2018815打破操縱子和重疊基因模式并乳酸脫氫酶0373、0503和adh 3個位點各敲入一個拷貝mep序列的菌株(27-蔗糖為120 g/L;28-蔗糖為130 g/L;29-蔗糖為135 g/L);30～35-CCTCC M2018815為出發菌(30-蔗糖為120 g/L;31-蔗糖為125 g/L;32-蔗糖為130 g/L;33-蔗糖為135 g/L;34-蔗糖為140 g/L;35-蔗糖為145 g/L);36～41-CCTCC M2020762為出發菌(36-蔗糖為120 g/L;37-蔗糖為125 g/L;38-蔗糖為130 g/L;39- 蔗糖為135 g/L;40-蔗糖為140 g/L;41-蔗糖為145 g/L)

2.5 甘露醇外排泵對產甘露醇的影響

由圖8可知,E.coli的AcrB敲入染色體中[20],在明串珠菌中異源表達時促進甘露醇的外排而提高甘露醇產量的作用,不如明串珠菌本身的mep,故本研究利用mep克服了培養基中添加底物的限制,即沒有AcrB的異源表達或沒有mep的超表達時,培養基中至多加入90 g/L底物-蔗糖。

由圖8可知,以原始菌或為CCTCC M2018815出發菌,在染色體上敲入mep序列,都大幅度地提高了菌株的甘露醇產量,構建的較高產甘露醇的菌株-CCTCC M2020762,以120 g/L蔗糖為底物,達到甘露醇產量為71.58 g/L、轉化率為59.65%。因克服了培養基中添加底物的限制,底物-蔗糖推動著葡萄糖到甘露醇的轉化,從而使CCTCC M2020762比CCTCC M2018815不僅提高了甘露醇產量,還提升了轉化率(CCTCC M2018815為52.51%[9])。

2.6 NADH再生對產甘露醇的影響

用于NADH再生的酶編碼基因有甲酸脫氫酶[21-22]、亞磷酸脫氫酶[22-23]和葡萄糖脫氫酶[24],其中亞磷酸鹽價錢較昂貴而不適合應用于甘露醇的發酵生產中,再生NADH時C6的葡萄糖用量為C1的甲酸6倍之多,故本研究采用甲酸脫氫酶基因。

由圖8可知,不管是以CCTCC M2018815為出發菌,還是以CCTCC M2020762為出發菌,NADH的再生使明串珠菌提高了甘露醇產量,最終構建的高產菌株,底物-蔗糖為145 g/L、甘露醇產量為101.60 g/L、轉化率為70.0%。NADH不僅推動蔗糖中果糖部分轉化為甘露醇,還推動葡萄糖→葡萄糖-6-磷酸→果糖-6-磷酸→甘露醇-1-磷酸→甘露醇途徑的轉化,進而提高轉化率。

2.7 甘露醇外排泵和還原力的協同

以CCTCC M2018815為出發菌,敲入mep序列而構建的菌株轉化率為59.65%,敲入FDH表達盒的菌株最高的轉化率為57.0%,只有同時敲入mep序列和FDH表達盒的菌株轉化率最高提升到70.0%。在胞內底物轉化為甘露醇的過程中蔗糖和NADH都缺一不可,且甘露醇的產量形成過程中甘露醇外排泵蛋白的作用也是非常重要的。

3 討論

3.1 細胞工廠的“源-庫”

“源-庫”學說,是指源和庫在控制綠色植物同化物運輸和分配方面的理論;源是指生產同化物及向其他器官提供營養的器官,而庫是指消耗或積累同化物的接納器官。庫對源有反饋作用,能調動源內有機物向其轉移;源庫之間運輸流暢是指源端物質的不斷輸出和庫端的及時利用與儲備;如果庫端不能充分容納與利用源端的同化物,則同化物不能及時從通道上部輸出,源端同化物的供應及繼續合成過程就會減弱,引起反饋抑制。借鑒植物生理學中的“源-庫”學說,細胞工程中建立細胞工廠的“源-庫”學說,來指導構建高產目標代謝物的細胞菌株。

通過甘露醇脫氫酶的催化將果糖轉化為甘露醇過程中,可以把果糖和NADH當作底物。敲除乙醇脫氫酶基因、乙醛脫氫酶基因[7]、乳酸脫氫酶基因[7]、乙酰磷酸轉移酶基因[7]都能節約NADH而提高果糖的轉化率,敲除葡聚糖蔗糖酶基因[18]、敲除絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因[7]能節約蔗糖而提高果糖的轉化率,敲除果糖激酶基因能節約果糖而提高果糖的轉化率,屬于節流手段;敲入甘露醇脫氫酶基因[7]、利用菊粉產甘露醇[10]、開辟葡萄糖→葡萄糖-6-磷酸→果糖-6-磷酸→甘露醇-1-磷酸→甘露醇的途徑[9]、增強產NADH的能力而提高甘露醇產量等手段都屬于開源;通過開源節流而增強“源”能,最終達到甘露醇高產的目的。

在明串珠菌染色體中定點插入甘露醇外排泵蛋白編碼基因表達盒,將更多的產物排出到胞外,若產物為抗生素,進行自我解毒(將抗生素進行化學修飾、或將抗生素以無/低活性前體形式儲存在體內、或將抗生素在體內區域化隔離、或產生抗生素的抗性蛋白)[25]。在大腸桿菌細胞質內構建超分子支架系統,增加乙醇的產生[26];在酵母菌中通過區室化代謝途徑將代謝途徑分隔在特定的亞細胞區域(過氧化物酶體或線粒體或液泡),可以隔離含毒性化合物,將酶催化反應導向特定底物以及建立不同的化學反應[27];在鹽單胞菌構建PHB生物合成體系時,過表達細胞分裂抑制劑MinCD而使細胞拉長[28]、改變細胞形狀(從桿狀變為纖維狀或者小球體變成大球體)[29]、失活細胞骨架蛋白編碼基因mreB和細胞分裂蛋白編碼基因ftsZ而增加細胞大小和長度并增大細胞容積[30]。細胞工廠生產的化合物溶解性差或毒性高時,通過硫酸化將目的化合物轉化為硫酸鹽結合物[31]或包裹在細菌微室中[32];通過糖基化修飾將柚皮素轉化為柚皮素-7-O-葡萄糖苷,從而降低酵母細胞的毒性并促進胞外分泌和增加水溶性[33]。酵母發酵生產蝦青素時,脂滴成為蝦青素的庫[34],這些都屬于增大“庫”容的手段。

3.2 FDH和mep的作用機理

FDH促進產甘露醇,在明串珠菌細胞中甘露醇脫氫酶以蔗糖中的果糖部分為底物產生甘露醇,這一過程中產生一分子甘露醇就消耗一分子NADH。FDH以甲酸為底物,產生還原型輔酶NADH。本研究中底物甲酸鈉為15 g/L,從而至多產生0.220 5 mol的NADH。FDH提供NADH而直接推動果糖→甘露醇的轉化;CCTCC M2018815(構建有葡萄糖→葡萄糖-6-磷酸→果糖-6-磷酸→甘露醇-1-磷酸→甘露醇的途徑)的果糖-6-磷酸→甘露醇-1-磷酸的轉化過程也消耗NADH,就是說,NADH還推動果糖-6-磷酸→甘露醇-1-磷酸的轉化,最終效果是提高甘露醇產量。簡而言之,NADH是促進底物轉化為產物的直接“源能”,在發酵過程中表現為打破添加底物的限制。

mep促進產甘露醇,將胞內的甘露醇轉運到胞外,從而提高甘露醇產量;從化學平衡角度講,不斷地將胞內目的代謝物泵到胞外,騰出胞內的代謝物“庫容”,進而促進反應物不斷地向產物方向轉化,在發酵過程中表現為打破添加底物的限制。

4 結論

(1)改變原核生物染色體中的操縱子和重疊基因排列模式,可以改善基因表達效率;(2)使細胞工廠具備更強的“源”能和更大的“庫”容,從而達到目標產物超高產的目的。不管“源”能還是“庫”容,最終都歸結到底物轉化為目標產物的化學平衡。