殼三糖和殼五糖對睡眠剝奪小鼠學習記憶障礙的影響

王斌,顧娟,閆華,趙寧靜,劉楠暉,張澎竹,姜啟興,許艷順,夏文水

1(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)2(江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心,江蘇 無錫,214122)

睡眠不足是現代社會普遍存在的一個突出問題。睡眠不足導致白天過度困倦的發生率在9%～24%。睡眠不足被定義為在過去4周內每晚6 h睡眠或更少。睡眠剝奪可能會影響學習能力和形成新記憶的能力,特別是對海馬體依賴性記憶任務的鞏固敏感[1]。越來越多的證據表明,睡眠剝奪可能導致神經炎癥、氧化應激、突觸可塑性、神經遞質、基因表達和蛋白質合成的變化,從而引發認知記憶衰退[2]。

天然產物,例如來自海洋生物的生物活性材料和多糖,被認為是神經保護劑的寶貴來源[3]。殼聚糖低聚糖(chitooligosaccharide, COS)是一種來自殼聚糖的低聚糖,其聚合度(degree of polymerization, DP)<20,Mw<3 900。由于其相對分子質量低、水溶性良好、黏度低、易吸收的特性和其他生物活性,成為了有價值的功能成分。最近研究表明,COS在體外和體內均具有良好的血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)滲透能力[4]。文獻證據顯示,一些相對分子質量<500的疏水性化合物和極性分子可以通過特定的運輸工具穿過BBB進入內皮細胞。因此,COS在體外和體內的良好的神經保護作用,引起了研究人員的興趣。WANG等[5]證明,COS通過減少α-突觸核蛋白的過度表達,減輕神經炎癥,激活PI3K/Akt(phosphotylinosital 3 kinase/protein kinase B)途徑,對帕金森小鼠的神經行為障礙有良好的作用。DAI等[6]證明,COS可以通過抑制β淀粉樣蛋白1-42纖維的形成和分解預先形成的纖維,成為預防和治療阿爾茲海默癥的新型治療劑。ZHANG等[7]證明,COS可以通過調節核因子E2相關因子2/抗氧化反應元件信號通路保護神經元SH-SY5Y細胞免受氧化損傷和凋亡。WU等[8]證明,COS對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷具有較好的神經保護作用,可改善早期神經反射行為,減少氧化應激損傷,減輕炎癥反應。

目前,對殼寡糖的生物活性的研究大多是用混合物進行的。然而,不同MW、DP、脫乙?；潭?degree of deacetylation, DD)和濃度的COS被證明具有各種治療效果。LI等[9]通過使用DP為2～6的COS測試抗氧化活性,發現低DP的COS顯示出更好的羥自由基清除效果,并具有更好的還原能力。前期采用不同DP(2～5)的COS預防干預給藥后,對帕金森病均有顯著性的預防緩解作用,其中殼三糖(chitotriose,COS3)和殼五糖(chitopentaose,COS5)對多巴胺能神經元的保護作用優于殼二糖和殼四糖[10]。

本研究采用改良多平臺水環境法(modified multiple platform method, MMPM)建立小鼠睡眠剝奪模型,通過新物體識別測定小鼠的學習記憶能力,并探究COS3和COS5對睡眠剝奪造成的學習記憶下降的改善作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與試劑

60只SPF級7周齡C57BL/6J雄性小鼠,由北京斯貝福生物技術有限公司提供,實驗動物許可證號為SCXK(京)2019-0010。

COS3、COS5,實驗室自制[10];RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液、苯甲磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)試劑盒、5×上樣緩沖液、電泳膠配制液、脫脂奶粉、一抗稀釋液、磷酸酶抑制劑、β-actin抗體、羊抗鼠免疫球蛋白G(H+L)抗體、羊抗兔免疫球蛋白G(H+L)抗體、蘇木精伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)試劑盒,碧云天生物技術有限公司;丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒,南京建成生物工程研究所;PI3K、p-PI3K(phospho-phosphotylinosital 3 kinase)、Akt、p-Akt(phospho-protein kinase B)抗體,Affinity Biosciences公司;聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜,美國Merck &Millipore公司;增強型化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影液,天能生物公司;其他試劑均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

新物體識別系統,江南大學動物實驗中心;Axio Vert A1 型倒置熒光顯微鏡,德國蔡司公司;ASP 200S型組織脫水機、1150H型石蠟包埋機、RM2245型手動輪轉切片機,德國萊卡公司;SCIENTZ-48型高通量組織研磨器,寧波新芝生物科技股份有限公司;4K15型冷凍離心機,德國Sigma公司;Tanon-1000型凝膠成像儀,上海天能科技有限公司;DYY-8C 型電泳儀,北京市六一儀器廠;UV-1800型紫外-可見分光光度計,日本島津公司;FC全自動酶標儀,美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組和睡眠剝奪模型建立

將60只C57BL/6J小鼠隨機分為4 組,每組15只,分別為空白組、模型組、COS3組、COS5組。實驗動物飼養于江南大學動物實驗中心,按照SPF小鼠飼養標準,給予小鼠以12 h為周期的光照循環,保持飼養溫度為(22±2) ℃,空氣濕度為40%～70%。每籠5只小鼠,并在適應環境7 d后,使用耳標鉗,對每只小鼠進行標記。每7 d更換滅菌墊料,每天稱量小鼠體重。所有動物實驗操作都通過江南大學實驗管理與動物福利委員會的審核,倫理審核的編號為JN.No20220615c0600901[201]。

采用MMPM法建立睡眠剝奪模型。實驗箱均為20 cm×30 cm×40 cm的透明箱,其中模型組的箱子底部安置20個小平臺,直徑3 cm,高5 cm,每個平臺間隔4 cm;空白組的箱底安置15個大平臺,直徑12 cm,高5 cm。把模型組、COS3組和COS5組的小鼠放到小平臺上,小鼠進入睡眠后,由于肌張力降低而接觸水或掉到水中,突然驚醒,利用嚙齒類動物畏水的生活習性,促使小鼠站立在水平臺上;把空白組小鼠放到大平臺上,小鼠可以正常睡眠。在箱內裝入清水,使水面低于平臺約1 cm,箱頂蓋上籠蓋,放置水瓶和飼料,小鼠可在平臺間活動,每天及時更換箱內的水。小鼠每天在箱內活動20 h后,放回小鼠飼養籠內休息4 h。在睡眠剝奪過程(PD8～PD28,共21 d)中,觀察記錄各組小鼠的精神狀態,每天稱量小鼠的體重,連續稱量3周,稱重后根據體重進行灌胃。正式實驗開始前將小鼠置于睡眠剝奪箱適應5 d,每日1次,每次2 h。

1.3.2 COS干預給藥

通過灌胃法對小鼠進行給藥,給藥情況如下:根據國家關于COS作為“食品新原料”的規定[11],COS的每人每日推薦量為≤0.5 g,換算成每只小鼠每日劑量為65 mg/kg(以體重計)。用生理鹽水將COS3和COS5配制成質量濃度為6.5 mg/mL的溶液,給藥體積為0.1 mL/10 g體重,給藥周期為PD8～PD28,共給藥21 d。每天對COS3組和COS5組分別進行灌胃,空白組和模型組灌胃相同劑量生理鹽水。

1.3.3 新物體識別實驗

新物體識別實驗分為學習階段和測試階段,2個階段間隔24 h。1)學習階段:將2個完全相同的物體放在靠近箱體一側壁的兩端,將小鼠從積木對面墻面的中心點背對積木放下,讓小鼠在箱體內自由探索10 min,記錄學習階段小鼠探索2個完全相同物體A1、A2的時間;2)測試階段:間隔24 h后,將其中的一個物體換成新的物體B,讓小鼠在箱體內自由探索10 min,記錄測試階段小鼠探索新物體和舊物體的時間以及辨別指數(discrimination index, DI)。DI的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:t1,新物體探索時間;t2,舊物體探索時間。

1.3.4 小鼠腦組織取材

各組小鼠腹腔注射質量分數為5%的戊巴比妥鈉溶液(10 mL/kg體重),麻醉后脫臼處死,在冰盒上取出全腦,分離出左右海馬體,-80 ℃保存,用于后續蛋白免疫印跡測定。同時每組隨機選擇3只小鼠,腹腔注射質量分數為5%的戊巴比妥鈉溶液(10 mL/kg體重),麻醉后用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L、pH 7.4)進行心臟灌注,灌注結束后脫臼處死小鼠,于冰上分離全腦,置于質量分數為4%的多聚甲醛溶液中,用于后續HE染色實驗。

1.3.5 HE染色

取1.3.4節固定于多聚甲醛溶液中的小鼠全腦,經過脫水、浸蠟包埋、切片、展片、烘片、水化、復水、HE染色、復水、封片處理后,采用倒置熒光顯微鏡觀察小鼠海馬區神經細胞的組織形態。

1.3.6 海馬氧化還原狀態的測定

取1.3.4節凍存在-80 ℃的海馬組織,參考試劑盒說明書測定海馬中SOD、MDA、T-AOC水平,結果以蛋白質含量計。

1.3.7 蛋白質免疫印跡測定海馬蛋白表達

取1.3.4節凍存在-80 ℃的海馬組織,向每10 mg海馬樣本中加入100 μL的RIPA裂解液,勻漿后在冰上裂解30 min,離心后測定上清液的蛋白含量,根據溶液體積加入上樣緩沖液,煮沸使蛋白變性。SDS-PAGE凝膠,每孔上樣20～40 μg,待溴酚藍跑到底,停止電泳,將目標條帶切下,在250 mA恒定電流作用下進行轉膜。轉膜結束后,用TBST(Tris buffered saline with Tween-20)洗滌膜3次,每次5 min。然后用質量分數為5%的脫脂乳封閉2 h,封閉結束后,用TBST洗滌膜3次。采用一抗稀釋液稀釋一抗:PI3K(體積比1∶1 000)、Akt(體積比1∶1 000)、p-PI3K(體積比1∶500)、p-Akt(體積比1∶500),將膜在4 ℃下與一抗孵育過夜。用TBST洗滌膜5次,每次5 min。然后與相應的二抗(體積比1∶1 000)常溫孵育2 h,用TBST洗滌膜5次,每次5 min。采用ECL工作液進行顯影拍照,并用ImageJ進行光密度分析計算,進行顯著性分析。

1.3.8 數據分析與繪圖

采用SPSS 19.0進行單因素(ANOVA)檢驗和方差齊性檢驗,事后檢驗采用Duncan法,P<0.05表示有顯著差異。數據用平均值±標準偏差表示,采用GraphPad Prism 9.0進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 COS3和COS5對睡眠剝奪小鼠體重及精神狀態的影響

體重減輕、精神狀態下降是睡眠剝奪小鼠造模成功的典型性狀之一。如圖1所示,在睡眠剝奪初期(0～6 d),空白組小鼠體重呈現輕微下降的趨勢,而在睡眠剝奪后期,空白組小鼠體重逐漸增長至初始體重。模型組小鼠從睡眠剝奪開始體重顯著降低,與空白組相比,模型組小鼠第21天的體重顯著降低9.16%(P<0.01)。而COS3和COS5均能夠在一定程度上緩解睡眠剝奪小鼠的體重下降,其中COS3組小鼠的體重顯著增加3.52%(P<0.01)。結果表明,COS3和COS5均能夠改善睡眠剝奪小鼠的體重下降,效果為COS3>COS5。同時,模型組小鼠在睡眠剝奪初期出現互相攻擊增多、煩躁不安的表現,隨著造模時間的增加,小鼠出現精神萎靡、行為呆板、落水明顯增加、對外界反應遲鈍等癥狀。與模型組相比,COS3組和COS5組小鼠落水明顯減少,精神狀態得到顯著改善。

圖1 COS3和COS5對睡眠剝奪小鼠體重變化率的影響Fig.1 Effects of COS3 and COS5 on body weight change rate of sleep-deprived mice注:#與空白組比較差異顯著(P<0.05);##與空白組比較差異極顯著(P<0.01);*與模型組比較差異顯著(P<0.05);**與模型組比較差異極顯著(P<0.01)(下同)。

睡眠剝奪對小鼠體重的影響是多方面的,除了內分泌系統的紊亂,也會導致焦慮、消極等情緒變化。實驗初期的體重下降可以部分歸因于小鼠對睡眠剝奪中水環境的不適應。短時間(0～6 d)的睡眠剝奪帶來的焦慮行為導致了小鼠活動量增加,體重呈下降趨勢,而在長時間(9～21 d)的睡眠剝奪后,小鼠的焦慮行為向消極行為轉變,能量消耗減小,因此也帶來體重的回升[12]。LI等[13]發現,患腸應激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)會出現明顯的抑郁癥相關焦慮行為,而COS可以通過穿透BBB改善IBS引發的小鼠抑郁樣行為,這也與本實驗的結果一致。

2.2 COS3和COS5對睡眠剝奪小鼠學習記憶能力的影響

對新物體的偏好降低程度是判斷睡眠剝奪小鼠學習記憶障礙的重要指標之一。由表1可知,在學習階段中,各組小鼠對2個物體A1、A2的探索時間均無顯著差異。由圖2可知,在測試階段中,與空白組相比,模型組的DI值基本為0(P<0.01),說明模型組小鼠經過學習后未對舊物體形成深刻記憶,睡眠剝奪明顯造成了工作記憶能力的缺陷,這與許多研究結果一致[14]。與模型組相比,COS3組和COS5組的DI顯著增加(P<0.01),其中,COS3的DI比COS5高11.49%。

表1 學習階段小鼠對物體A1、A2的探索時間 單位:sTable 1 Exploration time of object A1 and A2 in mice during learning phase

圖2 測試階段COS3和COS5對睡眠剝奪小鼠辨別指數的影響Fig.2 Effects of COS3 and COS5 on discrimination index in sleep-deprived mice during testing phase

新物體識別測試是一種高度驗證海馬相關認知功能的方法。利用小鼠對新穎物體的偏好特性,經過學習后,在自然條件下對新舊物體進行探索。在LIU等[15]的報道中,小鼠由于患肝性腦病導致認知障礙、學習和記憶遲緩等缺陷,在口服COS后得到顯著緩解,100 mg/kg COS干預可以顯著提高肝性腦病小鼠在探索新物體上花費的時間以及DI,與本研究結果一致。結果表明,COS3和COS5干預能夠顯著改善睡眠剝奪導致的小鼠學習記憶能力下降,效果為COS3>COS5。

2.3 COS3和COS5對睡眠剝奪小鼠腦組織病理學的影響

學習記憶能力受大腦中多個部位的影響,而其中聯系最密切的是海馬體。有研究表明,無論是完全性睡眠剝奪還是部分睡眠剝奪,都會不同程度地造成海馬區神經元細胞的損傷[16]。由圖3可知,與空白組相比,模型組腦神經細胞出現明顯固縮變形,細胞間隙變大,且排列不規則,有一部分神經細胞出現壞死,說明睡眠剝奪導致小鼠腦組織形態損傷明顯。與模型組相比,COS3組和COS5組小鼠腦組織形態明顯恢復,神經細胞排列緊密,層次清楚,細胞整體結構完整、細胞核清晰。病理學結果表明COS3和COS5對緩解睡眠剝奪小鼠的腦神經細胞損傷有一定作用。JIANG等[17]研究發現,殼寡糖具有促進周圍神經再生的作用,在5種COS單體中,COS3對于促進背根神經節外植體的神經元生長具有最好的效果。

a-空白組;b-模型組;c-COS3組;d-COS5組圖3 COS3和COS5對睡眠剝奪小鼠腦組織形態的影響(400×)Fig.3 Effects of COS3 and COS5 on brain tissue morphology in sleep-deprived mice(400×)

2.4 COS3和COS5對睡眠剝奪小鼠海馬氧化應激損傷的影響

睡眠缺失會誘導氧化應激,中樞神經系統特別容易受到氧化應激的影響,導致MDA水平上升,SOD和T-AOC水平下降[18]。海馬是最容易受到氧化應激損傷的腦區之一。由圖4-a和圖4-b可知,與空白組相比,模型組海馬SOD和T-AOC水平分別顯著降低30.96%和56.09%(P<0.01)。經過COS3和COS5干預后,與模型組相比,COS3組和COS5組的SOD水平分別顯著上升27.23%、20.97%(P<0.01);COS3組和COS5組的T-AOC水平分別顯著上升92.91%、81.49%(P<0.01)。效果為COS3>COS5。由圖4-c可知,與空白組相比,模型組海馬MDA水平顯著升高67.08%(P<0.01)。經過COS3和COS5干預后,與模型組相比,COS3組和COS5組的MDA水平分別顯著下降24.67%、23.81%(P<0.01)。效果為COS3>COS5。

a-SOD水平;b-T-AOC水平;c-MDA水平圖4 COS3和COS5對睡眠剝奪小鼠海馬氧化損傷的影響Fig.4 Effects of COS3 and COS5 on hippocampal oxidative damage in sleep-deprived mice

神經細胞的氧化應激是導致認知障礙的重要途徑。MDA是脂質過氧化的產物,是氧化應激最敏感的指標之一,小鼠海馬MDA含量變化可以間接反映出細胞氧化損傷程度[19]。SOD是機體內重要的抗氧化劑,異常的SOD活動與神經紊亂有關。而T-AOC是指抗氧化酶和抗氧化物等構成的總抗氧化水平。陳逸倫[20]發現每日45 mg/kg體重COS干預能顯著緩解酒精誘導的抗氧化酶活力的下降,提高新生SD大鼠的清除自由基和抗氧化的能力,改善酒精性神經損傷。KSADERE等[21]研究發現每日200 mg/kg體重COS可以抑制鎘誘導的海馬組織中MDA含量增加,緩解腦組織中由于超氧自由基的過量產生介導的脂質過氧化,并通過提高海馬中抗氧化劑SOD活性,保護Wistar大鼠腦組織神經細胞。李克成[22]研究發現,低聚合度的殼寡糖具有更強的羥自由基清除活性和還原能力,在所有殼寡糖樣品中,COS3的羥自由基清除活性最高,與本實驗研究結果一致。本實驗結果從氧化應激角度印證了COS3和COS5具有較好的神經保護作用,效果為COS3>COS5。

2.5 COS3和COS5對睡眠剝奪小鼠PI3K/Akt相對表達水平的影響

PI3K/Akt通路是胞內信號傳導途徑,與細胞代謝、增殖、存活和生長密切相關[23]。睡眠剝奪可降低海馬體Akt、PI3K的磷酸化水平[24]。由圖5可知,各組小鼠的PI3K和Akt蛋白水平沒有顯著差異。與空白組相比,模型組海馬p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt表達水平分別顯著下降60.24%、46.31%(P<0.01),說明睡眠剝奪抑制了小鼠海馬PI3K/Akt信號通路。經過COS3和COS5干預后,與模型組相比,COS3組和COS5組p-PI3K/PI3K表達水平顯著提升52.20%和50.94%(P<0.01);COS3組和COS5組p-Akt/Akt表達水平顯著提升98.15%和88.08%(P<0.01),說明COS3和COS5干預可能通過上調PI3K和Akt的磷酸化蛋白水平,激活PI3K/Akt信號通路,效果為COS3>COS5。

a-p-PI3K的相對表達量;b-p-Akt的相對表達量圖5 COS3和COS5對睡眠剝奪小鼠海馬PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt表達的影響Fig.5 Effects of COS3 and COS5 on expression of PI3K, p-PI3K, Akt, and p-Akt in hippocampus of sleep-deprived mice

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)能夠激活蛋白激酶B(Akt),并積極參與自噬的調節。Akt是絲氨酸/蘇氨酸激酶,是PI3K信號轉導途徑中的一個主要下游目標。它是促進細胞生存、抑制細胞凋亡和維持正常功能的關鍵信號分子。睡眠剝奪會導致PI3K/Akt信號通路活性降低,引發神經細胞凋亡和記憶認知障礙。激活PI3K/Akt信號通路能夠預防睡眠剝奪誘導的神經細胞凋亡和丟失,發揮神經保護作用,該過程由一系列下游底物的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化介導。LI等[23]發現丹參酮IIA對大鼠急性睡眠剝奪所致認知障礙具有神經保護作用,其作用機制可能是激活海馬區CNR1/PI3K/AKT通路,增加p-PI3K和p-Akt的表達,改善海馬神經元細胞損傷,抑制海馬細胞細胞凋亡。CAO等[24]發現莫達非尼增強了PI3K和Akt的磷酸化,通過激活PI3K/Akt信號通路減輕海馬神經元的過度自噬。另外,Akt的激活與其磷酸化位點Thr308和Ser473密切相關,Akt的激活主要依賴于Ser473的磷酸化[25]。本研究結果表明,磷酸化位點為Ser473的p-Akt在睡眠剝奪小鼠海馬中的表達量顯著降低,而COS3和COS5干預逆轉了這種降低;然而,Akt的蛋白水平無顯著變化,說明Akt是通過其磷酸化途徑發揮作用的。越來越多的研究表明,COS能夠通過刺激PI3K/Akt信號通路保護不同來源的神經元,例如皮層神經細胞、海馬神經細胞和小腦顆粒神經細胞。XU等[26]發現COS可能通過調節PI3K/Akt信號通路對培養的皮層神經元發揮神經保護作用,并且COS的抗細胞凋亡作用可以被PI3K的化學抑制所阻斷。賈鵬[27]發現COS可減緩H2O2誘導的細胞,這種保護作用依賴于胞內PI3K/Akt信號轉導通路活性的增強。因此,本研究結果表明,COS3和COS5可能通過上調p-PI3K和p-Akt的表達,激活PI3K/Akt信號通路來抑制睡眠剝奪誘導的小鼠海馬神經細胞凋亡。YANG等[28]研究發現COS能夠通過PI3K/Akt信號通路激活RAW 264.7細胞,其中α-COS比β-COS更具活性。在帕金森模型中,COS3表現出更好的多巴胺能神經元保護作用[10]。這些研究結果與本研究結果一致,COS3和COS5可能通過上調p-PI3K和p-Akt水平,激活PI3K/Akt信號通路,效果為COS3>COS5。

3 結論

本研究結果表明,COS3和COS5干預對睡眠剝奪小鼠的學習記憶能力均有一定程度的改善作用,在新物體識別實驗中能顯著改善睡眠剝奪小鼠的學習記憶能力,其發揮作用的機制可能是通過降低小鼠海馬氧化應激損傷,激活PI3K/Akt信號通路,從而抑制海馬區神經細胞凋亡,發揮對睡眠剝奪小鼠海馬神經細胞保護的效果。從本文所檢測的指標來分析,與COS5組相比,相同劑量的COS3干預對睡眠剝奪小鼠體重減輕、DI降低、氧化應激和PI3K、Akt的磷酸化水平下降具有更好的抑制作用,這可能是由于COS3的聚合度低于COS5的緣故,具體的原因需要深入探究。COS3和COS5對睡眠剝奪造成的學習記憶下降的改善作用及其潛在機制還有待于進一步研究,后續研究可以圍繞神經炎癥、突觸可塑性等其他方面開展。