環糊精包合三丁酸甘油酯的分子機制研究

董雪,李兆豐,2,顧正彪,2,班宵逢,2,洪雁,2,程力,2,李才明,2*

1(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)2(江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

環糊精(cyclodextrin,CD)是由淀粉通過環糊精轉葡萄糖基酶催化水解產生的一種環狀寡聚糖[1],一般由6、7、8個D-吡喃葡萄糖單元組成,分別為α-CD、β-CD和γ-CD[2],其結構如圖1所示。CD具有“外親水、內疏水”的獨特分子洞腔,可與疏水性客體分子形成包合物,達到提高客體溶解度和穩定性、掩蓋不良氣味、降低刺激性與不良反應的目的[1],并且已有研究表明多種CD協同使用會獲得更好的包合效果[3]。

圖1 α-環糊精、β-環糊精和γ-環糊精的結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of α-, β- and γ-cyclodextrin structures

三丁酸甘油酯(tributyrin,TB)是一種具有多種生理功效的短鏈脂肪酸酯[4],其結構如圖2所示。TB作為丁酸的前體物質,不僅減弱丁酸理化性質方面的缺陷,還具備多種生理功效[6],如維持腸道菌群穩態與減少幼齡動物斷奶應激[7]、調節免疫功能與機體代謝[8]、改善生長性能[9]等。但TB水溶性差、有苦味和異味、易在消化道前段被降解,這些缺點限制了其在各個行業尤其是食品行業中的應用[10]。因此,改進TB的使用性能,對其應用價值的提高和使用范圍的擴大具有重要意義。

圖2 三丁酸甘油酯的結構示意圖[5]Fig.2 Schematic diagram of tributyrin

先前研究報道γ-CD/TB包合物可提高TB的利用率,但通過噴霧干燥制備樣品時,包合物中TB的保留率較低[11],因而猜測γ-CD的空腔尺寸并非與TB具備最佳匹配效應。本課題組前期發明了酶法生產CD過程包合TB的新方法,在酶法生產CD的過程中直接添加TB作為絡合劑,促進3種CD生成,同時制備得到降低TB異味、有效提高其生物利用度的包合物[9, 12-13]。以上研究并未對CD包合TB的機制進行深入研究,因而本文將系統探究3種CD(α-CD、β-CD和γ-CD)包合TB的分子機制,分析復配CD包合的協同效應,以期為CD的應用打下堅實基礎,并為其他功能因子的包合提供理論參考和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

α-CD、β-CD、γ-CD,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氘代二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide-d6,DMSO-d6),美國Cambridge Isotope Laboratories股份有限公司;TB(純度98%),廣東溢多利生物科技股份有限公司;無水乙醇,上海麥克林生化科技股份有限公司;其他試劑均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗設備

Centrifuge 5424型臺式高速離心機,德國Eppendorf公司;RW20 Digital數顯型頂置式攪拌器,德國IKA公司;TW8型恒溫水浴槽,德國JULABO有限公司;VO-53型真空干燥機,上海泰坦科技股份有限公司;UV1900紫外可見光分光光度計,翱藝儀器(上海)有限公司;Avance III-400 MHz型核磁共振波譜儀,德國Bruker AXS公司;MicroCal VP-ITC等溫滴定量熱儀,馬爾文帕納科公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CD/TB包合物的制備

采用共沉淀法[14]制備,將CD(α-CD、β-CD、γ-CD、復配CD)完全溶于去離子水中,然后將溶解在無水乙醇中的TB緩慢加入CD溶液,50 ℃保溫攪拌3 h,冷藏24 h,過濾得到CD/TB包合物,用無水乙醇洗滌2次以除去包合物表面未被包合的TB,真空干燥烘干水分至恒重,獲得CD/TB包合物樣品。(其中復配CD物質的量比例為:α-CD∶β-CD=3∶7,β-CD∶γ-CD=7∶3,α-CD∶β-CD∶γ-CD=2∶7∶1,所得包合物分別命名為:α-、β-CD/TB,β-、γ-CD/TB,α-、β-、γ-CD/TB)。

1.3.21H核磁共振(1H nuclear magnetic resonance,1H NMR)測定

參照李澤西[10]的方法并適當修改,使用核磁共振波譜儀測定樣品化學位移量。CD單體、TB單體以及包合物溶解于DMSO-d6有機溶劑,實驗溫度設置303 K。包合前后CD與TB質子化學位移計算如公式(1)所示:

Δδ=δ(包合物)-δ(單體)

(1)

1.3.3 相溶解度測定

參照李丹等[15]的方法并適當修改。將過量TB(以無水乙醇為溶劑配制2 mol/LTB溶液)分別加入濃度為0、4、8、12、16、20 mmol/LCD溶液中,水浴攪拌24 h,離心取上清液,采用紫外分光光度法測定清液中TB濃度;作TB的含量和CD濃度的關系圖,即為相溶解度曲線,并對數據進行線性擬合;根據公式(2)計算CD與TB的包合穩定常數Ks。

(2)

1.3.4 等溫滴定微量熱測定

參照張翔宇等[16]的方法并適當修改。將濃度分別為2 mmol/LTB溶液與20 mmol/LCD溶液進行脫氣處理。向樣品池中添加TB溶液,進樣針吸取CD溶液后,對樣品進行熱力學分析,空白溶劑為對照組。實驗溫度25 ℃;滴定次數27滴;滴定間隔時間240 s;攪拌速率351 r/min。用Microcal Anslysis Launcher軟件對滴定過程中的熱變化進行記錄和處理。

1.3.5 Autodock分子模擬對接

在Automated Topology Builder and Repository網頁中搜索α-CD、β-CD、γ-CD和TB的結構,通過ChemSpider下載分子結構,根據先前報道方法對分子結構進行優化并用AutoDock 4.2.6組件進行分子模擬對接[9],輸出結果采用Open Babel軟件轉換文件格式,最終使用軟件Discovery Studio進行觀察。

1.3.6 數據處理

通過Excel 2019和Origin 2021對數據進行處理及作圖;采用SPSS 20統計軟件分析實驗數據的差異顯著性(P<0.05),計算平行實驗結果數據的平均值±標準偏差,通過單因素方差分析(AVOVA)中的Duncan程序實現。

2 結果與分析

2.1 核磁共振構象解析

1H NMR是對包合物體系最準確的表征技術[17],已經被廣泛用于主客體化合物的結構確認與構象分析[18]。圖3為TB與CD包合的1H NMR譜圖。

a-三丁酸甘油酯、單一環糊精和包合物的1H NMR譜圖;b-三丁酸甘油酯、復配環糊精和包合物的1H NMR譜圖圖3 三丁酸甘油酯、環糊精和包合物的1H NMR譜圖Fig.3 1H NMR spectra of tributyrin, cyclodextrins and their inclusion complex

由表1可知,CD空腔內的質子H3、H5、H6發生了不同程度的位移變化,這是由于α-、β-和γ-CD與TB發生相互作用后,TB分子會進入CD的疏水空腔,其環電流效應會使空腔內部質子周圍的電子云密度增大,從而導致質子化學位移發生偏移,證實了α-、β-和γ-CD都可包合TB形成包合物[19]。此外,有研究表明質子位移的變化幅度可展現客體分子進入空腔的取向以及主客體的包合模式[20],圖4顯示了CD單體與TB單體的原子標記,由圖4-a可以看出,質子H6位于CD外部的窄口端,并且比較表1中H3、H5、H6的位移變化程度可得知,H3的變化值大于H5,表明TB傾向于從CD寬口端進入疏水空腔,H6的化學位移是由于客體分子深插入空腔造成。此外,相同質子β-CD位移變化值最大,說明盡管TB能與3種CD都發生包合,但β-CD包合TB的能力最強,可能與β-CD空腔尺寸同TB最適配有關[19]。

表1 環糊精單體及與三丁酸甘油酯包合物的1H化學位移(δ)Table 1 1H-chemical shifts (δ) of cyclodextrins in the absence and presence of tributyrin

a-環糊精;b-三丁酸甘油酯圖4 環糊精與三丁酸甘油酯的原子標記[9]Fig.4 Proton labeling of cyclodextrin and tributyrin

表2列出了TB質子的化學位移變化情況。TB外緣鏈狀結構上的氫原子(H2, 7和H1, 8)發生較為明顯的偏移,表明TB由乙基部分進入CD空腔的構象占優勢。相同質子β-CD的化學位移改變值最大,同表1結果一致。

表2 三丁酸甘油酯單體及與環糊精包合物的1H化學位移(δ)Table 2 1H-chemical shifts (δ) of tributyrin in the absence and presence of cyclodextrins

由表3可知,當2種或3種CD同時包合TB時,CD空腔內部質子及外側部分質子都發生較明顯的化學位移,這可能是由于TB分子全部或部分插入CD空腔內引起內部質子位移,TB分子與CD外側質子相互作用引起外側質子位移;進而推測復配CD能以多種方式與TB分子結合。觀察表2、表4中所示數據,以復配CD為壁材時,包合物中TB分子的化學位移最大為0.013 ppm,以單一CD為壁材時,TB的化學位移最大為0.008 ppm,復配CD-TB包合物中TB分子的化學位移變化明顯大于單一CD,所以猜測復配CD存在更適于包合TB的結構,包合TB的能力更強。

表3 環糊精單體及與三丁酸甘油酯包合物的1H化學位移(Δδ)Table 3 1H-chemical shifts (Δδ) of cyclodextrins in the absence and presence of tributyrin

表4 三丁酸甘油酯單體及與環糊精包合物的1H化學位移(δ)Table 4 1H-chemical shifts (δ) of tributyrin in the absence and presence of cyclodextrins

2.2 相溶解度分析

目前,相溶解度法廣泛用于研究CD對難溶性客體溶解度的影響[21]。本文通過相溶解度研究了CD對TB的增溶效應,結果如圖5所示。TB的溶解性隨著CD濃度的增加而成比例增加,這是由于CD可與TB形成包合物[22];分析相溶解度曲線可知,所有線性回歸方程的相關系數(R2)均大于0.95(表5),說明CD與TB的相溶解度曲線為AL型[23],表明CD與TB以1∶1物質的量比進行包合[24]。

表5 在不同溫度條件下3種環糊精與三丁酸甘油酯的包合穩定常數Table 5 Inclusion stability constants of the tributyrin and three typical cyclodextrins under different temperature

圖5 環糊精與三丁酸甘油酯的相溶解度曲線Fig.5 Phase solubility of cyclodextrin and tributyrin

此外,相溶解度法是計算CD和客體物質包合穩定常數Ks的一種常用技術[25],Ks值越大,包合物穩定性越好[26]。為評估不同CD與TB包合物的穩定性,計算了包合穩定常數,結果如表5所示。不同主體包合穩定常數的順序為:α-、β-、γ-CD>α-、β-CD>β-、γ-CD>β-CD>γ-CD>α-CD,表明以單一CD作為壁材時,β-CD與TB的Ks值最大,猜測原因可能是TB可能與β-CD空腔的匹配度較高,形成的包合物更穩定;而γ-CD的空腔尺寸相對較大,TB分子能夠更自由的進出其空腔,導致γ-CD/TB包合物不穩定;相比之下,α-CD的空腔尺寸較小,降低了其有效包合TB的概率,因此α-CD/TB包合物的穩定性最低;復配CD(α-CD∶β-CD∶γ-CD=2∶7∶1)與TB的Ks值相對于β-CD提高了79.21%,表明多種CD同時存在對TB的協同包合效果明顯優于單一CD,復配CD包合TB的能力更強,此結果證實了上文猜測;此外,α-、β-CD及β-、γ-CD與TB的Ks值相對于β-CD分別提高了60.70%、35.60%,可以進一步說明β-CD與α-CD的協同效果較好。

2.3 包合過程熱力學分析

等溫滴定微量熱是近年發展的一項熱分析技術,該技術靈敏度高、測量準確,且可做到實時、定量、在線和動態描述反應過程[27]。為進一步研究CD與TB的熱力學相互作用,測定了二者的等溫滴定量熱曲線,實驗結果如圖6所示。觀察擬合結果可知,除α-CD外,其他CD與TB的擬合結果較好,可判斷數據有效可靠;推測因α-CD空腔過小有效包合TB的概率較低,加之空白溶劑的影響過大,所以α-CD包合TB過程中的等溫滴定量熱曲線無法用One Sites擬合方式擬合。

a-β-CD;b-γ-CD;c-β-、γ-CD;d-α-、β-CD;e-α-、β-、γ-CD圖6 環糊精滴定三丁酸甘油酯的等溫滴定量熱曲線Fig.6 Cyclodextrin titration tributyrin isothermal drops of quantitative thermal curve

在包合物形成過程中,主客體之間沒有化學鍵變化,熱力學上主要由焓或熵驅動,是一種物理過程。觀察圖6中列出的熱力學參數值可以看出,-TΔS、ΔH、ΔG均小于0,表示CD包合TB是一個可自發進行的微放熱過程;且∣-TΔS∣>∣ΔH∣,說明焓熵協同驅動促進CD包合TB,熵驅動在包合過程中占主導地位[28];進而,ΔH<0,ΔS>0,表明促進包合過程發生的主要因素有疏水作用力、氫鍵、離子鍵和范德華力[29],其中疏水作用力起主要作用,CD/TB包合物形成過程中的熱力學參數是上述作用力相互競爭平衡的結果。通常情況下,ΔS>0可能是由于兩部分疏水作用力促成的,第一部分是TB分子周圍的疏水作用力,包括被包合在CD空腔內部的TB分子及包合體系內少量游離的TB分子;第二部分疏水作用力來自CD/TB包合物形成過程中高能量水分子的釋放,包括CD疏水空腔內部的水分子、CD外側親水表面的水分子及TB分子疏水結構周圍的水分子,此部分疏水作用力較強,能夠提高包合過程中的熵驅動[30]。

此外,由圖6可知,以單一CD滴定TB時,β-CD與TB的包合穩定常數大于γ-CD,表明β-CD的疏水空腔更適于包合TB,二者之間的疏水相互作用較強,β-CD/TB包合物更穩定。比較復配CD與TB的包合穩定常數可知,3種CD同時存在時與TB的包合穩定常數最大,說明3種CD協同作用可達到更好的包合效果,并且β-CD與α-CD的協同作用比β-CD與γ-CD的協同作用更好,此結果與相溶解度結果一致。β-CD包合TB過程中的熵變為17.8 cal/mol K,與之相比,α-、β-CD及α-、β-、γ-CD包合TB過程中的熵值分別提高了25.84%、36.52%,表明α-CD和γ-CD以一定比例與β-CD同時存在時可增大熵驅動,推測原因為多種環糊精同時存在可以提供更多與TB分子尺寸相匹配的疏水空腔,使較多量的TB進入空腔形成包合物,增加了TB被有效包合的可能性;包合過程中會有較多高能量水分子從CD空腔內部及外側親水表面釋放,增強了CD與TB之間的疏水相互作用,從而達到更穩定的包合效果。

2.4 分子模擬對接研究

為進一步闡明CD與TB的包合機制,本研究使用分子對接軟件AutoDock 4.2.6對CD和TB的包合物進行了分子對接研究,證實了包合物結構的合理性。由ChemSpider獲得的3種CD和TB的三維構象如圖7所示,α-CD、β-CD和γ-CD為空腔依次增大的環狀結構,而TB為3個分支的鏈狀結構。

a-三丁酸甘油酯;b-α-環糊精;c-β-環糊精;d-γ-環糊精圖7 三丁酸甘油酯、α-環糊精、β-環糊精、γ-環糊精的三維結構圖Fig.7 3D structures of tributyrin,α-CD, β-CD, and γ-CD

據文獻報道,α-、β-和γ-CD的疏水空腔的平均直徑分別為5.7 ?、7.8 ?和9.5 ?[31],TB與3種CD在理論上均能發生包合。圖8顯示了TB和3種CD的最大可能包合構象,TB被包合進CD空腔的基團及其形態不同:α-CD的疏水空腔較小,TB的鏈狀結構只能被部分包合,大部分結構暴露于CD空腔外側,包合構象極不穩定;TB在β-CD的空腔中可適當卷曲,被較完全包合,增加了β-CD包合TB的緊密程度與穩定性;而γ-CD由于其疏水空腔過大,疏水作用力不足導致TB分子與腔體內側還存在較大間隙,TB分子能夠較自由的進出其空腔,導致包合構象極不穩定,從而增加了形成包合物的難度。

a-α-環糊精;b-β-環糊精;c-γ-環糊精圖8 三丁酸甘油酯與α-環糊精、β-環糊精、γ-環糊精的分子對接最優構象Fig.8 Optimal molecular docking conformation of tributyrin with α-CD, β-CD, and γ-CD

由表6可知,TB與3種不同類型CD的refRMS值的順序為:β-CD<α-CD<γ-CD,其中β-CD與TB包合結果的refRMS值最小,表明其對接構象的有效性最大;從結合能方面看,β-CD與TB的結合能最高,遠大于α-CD和γ-CD,說明β-CD與TB的包合結構最為緊密。

表6 分子對接結果相關參數Table 6 Related parameters of molecular docking results

通過進一步分析分子模擬對接結果,得到3種CD包合TB的多種包合構象,如圖9所示。

圖9 三丁酸甘油酯與α-環糊精、β-環糊精、γ-環糊精的分子對接可能構象Fig.9 Possible molecular docking conformation of tributyrin with α-CD, β-CD, and γ-CD

β-CD的空腔最適于包合TB,沒有出現TB分子脫離β-CD空腔的情況,但也會出現僅包合側鏈的對接結果;而α-CD和γ-CD包合TB時,會出現僅包合側鏈或TB分子未被包合進空腔內的結果,此時CD與TB的包合構象便不穩定。

聯系相溶解度和等溫滴定微量熱的實驗結果可知,2種或3種CD復配與TB時的包合穩定常數明顯大于單一CD,說明多種CD協同作用包合TB可能會形成更穩定的包合構象。結合以上實驗結果的分析,最終推測出如圖10所示復配CD包合TB的包合構象,多種CD協同包合TB能夠形成穩定的包合物。

圖10 三丁酸甘油酯與環糊精包合模型圖Fig.10 Simulated inclusion complex conformation of tributyrin with cyclodextrins

3 結論

本研究首先通過核磁共振光譜鑒定出α-CD、β-CD、γ-CD均可能與TB形成包合物,其中β-CD最適于包合TB;根據相溶解度實驗確定CD與TB的包合比為1∶1,復配CD與TB的包合效果優于單一CD;進而通過等溫滴定微量熱實驗可知CD包合TB是可自發進行的微放熱過程,焓熵協同驅動促進包合過程發生,熵驅動在包合過程中占主導地位,疏水作用力為主要作用,并且α-CD和γ-CD以一定比例與β-CD同時存在時可以提供更多與TB分子尺寸相匹配的疏水空腔,增強了CD與TB之間的疏水相互作用,從而達到更穩定的包合效果;最后,通過深入解析單一CD包合TB的分子構象,推測出復配CD協同包合TB的分子模型。本文研究分析了3種常見CD包合TB的分子機制及不同CD包合TB的協同效應,為改善TB的應用效果打下堅實的理論基礎,也有助于完善CD的包合理論與技術,最終促進相關產業的快速發展。