雙峰駝乳功能蛋白及脂肪酸在泌乳期內的變化研究

姚懷兵,王智瑄,趙仲凱,豆智華,劉穎,吳林英,董靜,陳鋼糧,楊潔*

1(新疆大學 生命科學與技術學院,新疆生物資源基因工程重點實驗室,新疆 烏魯木齊,830017)2(新疆駱駝產業工程技術研究中心,新疆 烏魯木齊,830017)3(新疆旺源生物科技集團有限公司,新疆 阿勒泰,836500)

雙峰駝是荒漠地區重要的特種經濟動物,對荒漠植物利用率高且具備忍耐極端環境的適應力及免疫系統,為偏遠地區牧民提供奶、肉、皮及毛等畜產品。駱駝乳具有豐富的優質蛋白及人體必需氨基酸[1],營養價值高且具有低致敏性,適宜各類人群食用,被譽為“沙漠白金”。

雙峰駝產奶量低于單峰駝,但乳中蛋白質含量顯著高于單峰駝,富含乳鐵蛋白、免疫球蛋白、過氧化物酶、溶菌酶等保護性蛋白。駝乳在乳類中營養和藥用價值極高,但其開發利用仍處于初級階段。駝乳中的乳清蛋白營養價值較高,易于消化吸收,對新生仔駝的生長發育至關重要。其中,α-乳白蛋白是色氨酸和半胱氨酸的主要供體,參與免疫調節,并具有極高的抗氧化活性[2]。α-乳白蛋白更易被腸道酶類(糜蛋白酶和胰蛋白酶等)酶解。駝乳中缺少β-乳球蛋白,可作為牛乳的替代品供給過敏患者食用。乳鐵蛋白是乳中重要的非血紅素鐵結合糖蛋白,具有廣泛生物學功能,尤其在新生仔畜免疫系統的發育與完善過程中發揮著重要作用[3-4]。免疫球蛋白(immunoglobulin G, IgG)是母體輸送給仔畜為其提供被動免疫保護[5]。溶菌酶則與乳鐵蛋白間具有協同作用,發揮較強的抗菌活性。α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG和溶菌酶4種功能蛋白的特殊生物學特性及熱敏性與駝乳的開發利用及生產加工息息相關。此外,與牛乳相比,駝乳中長鏈不飽和脂肪酸豐富,如共軛亞油酸,這些脂肪酸對機體具有潛在的生理保護作用,使得駝乳脂肪酸組成及含量成為國內外研究者重點研究內容之一。此外,駝乳因其脂肪酸組成符合人類健康飲食模式,近些年作為功能食品而受到國內外研究者廣泛關注[6]。

目前,國內外研究者對雙峰駝常乳期的駝乳成分變化報道較少。國內僅有關于雙峰駝在不同飼養條件下乳成分的比較[7]、泌乳前期與中期的氨基酸含量變化[8]及脂肪酸種類及含量變化[9-10]的研究,尚未開展集約化養殖條件下的駝乳功能性蛋白的研究。國外研究者僅對單峰駝泌乳期內乳成分(蛋白質、脂肪、固體非脂肪、灰分、乳糖和水分等理化指標)變化規律[11-14]、礦物質含量變化規律[15]、泌乳曲線類型[16]及擠奶機擠奶時的泌乳特性[17]進行過報道。

本研究對雙峰駝泌乳期330 d內的駝乳進行采集,基于課題組前期對多種奶畜乳清蛋白的檢測方法,使用超高效液相色譜法檢測駝乳中α-乳白蛋白、乳鐵蛋白含量,基于酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)對駝乳中IgG含量進行檢測,基于比濁法,使用溶菌酶試劑盒對駝乳中溶菌酶的含量進行測定,使用氣相色譜法對乳中脂肪酸含量進行測定。探究集約化養殖條件下駝乳中4 種功能性蛋白(α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG與溶菌酶)以及脂肪酸含量在泌乳期內變化情況,為深入研究新疆雙峰駝泌乳生理學及駝乳功能性乳制品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 乳樣的采集及處理

駝乳,新疆阿勒泰地區吉木乃縣萬駝園養殖區(海拔539.6 m,經緯度E 87°12′09″, N 47°40′34″)飼養的準噶爾雙峰駝。選取同一飼養環境下,年齡(相差≤1歲)、胎次且產駝羔時間相近(相差天數≤5 d)的20峰泌乳雙峰駝進行追蹤。采用舍飼與放牧相結合飼養管理方式,自由采食飲水,每日分別于5∶00與16∶00(京時)進行擠乳操作,并于每日8∶00與19∶00進行補飼,飼料配比為玉米∶豆粕∶苜蓿=2∶1∶2(質量比),每日8∶00補飼后進行放牧,下午擠奶前趕回至圈舍。采樣時,駝乳樣品置于4 ℃冷藏,迅速運回實驗室進行檢測。初乳期為1～7 d,期間每日1次進行采集檢測;常乳期為30～330 d,每30 d采集并檢測1次。

1.2 實驗材料

Camel IgG ELISA試劑盒,上海江萊實業股份有限公司;AO50-1-1溶菌酶試劑盒,南京建成生物工程研究所;甲醇、乙腈、正庚烷、15%三氟化硼甲醇及37種脂肪酸混標(色譜純),美國sigma公司;磷酸、BaCl2、Na2HPO4、NaOH、Na2SO4、NaCl、冰乙酸及三氟乙酸(分析純),天津富宇精細化工有限公司;焦性沒食子酸(分析純),中國食品藥品檢定研究院;體積分數為95%乙醇(化學純),上海源葉生物科技有限公司;沸程30～60 ℃石油醚(分析純),天津市北聯精細化學品開發有限公司。

1.3 儀器與設備

H-class超高效液相色譜儀,Waters公司;GC-2014氣象色譜儀,美國島津公司;7890B/5977A氣相色譜質譜聯用儀,美國安捷倫科技有限公司;SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵,上?？坪銓崢I發展有限公司;GEAKTA蛋白層析儀,美國通用公司;MULTISKAN Sky全波長掃描酶標儀,賽默飛世爾科技有限公司;Power Pac Basic電泳儀,上海伯樂生命醫學產品有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 駝乳蛋白標準品的制備

將駝乳樣品置于4 ℃恒溫離心機,4 000 r/min離心15 min,去上層脂肪,記錄pH值。使用稀釋后的冰乙酸調節pH值到4.6,40 ℃水浴30 min加速酪蛋白沉淀,在4 ℃冰箱靜置2 h后,4 ℃ 4 000 r/min離心20 min,將脫脂乳中的酪蛋白沉淀除去,使用飽和NaHCO3溶液將駝乳清液調回至原始pH值。

1.4.1.1 駝乳α-乳白蛋白標準品制備

將上一步處理后的駝乳清組分按照(NH4)2SO4分級沉淀表對乳清進行0%～20%、20%～30%、30%～40%、40%～50%、50%～60%、60%～70%、70%～80%、80%～90%、90%～100%的組分分級沉淀。α-乳白蛋白存在于90%～100%的組分中,收集90%～100%組分,加入少量超純水使沉淀重新溶解并至于透析袋中,在4 ℃條件下,置于蒸餾水中透析脫鹽,1 次/h更換蒸餾水。使用飽和BaCl2來檢測透析液中是否殘留(NH4)2SO4,當透析液中無白色沉淀時,透析結束。經50 kDa超濾管透析好的駝乳組分于4 ℃ 2 500 r/min離心10 min,收集超濾管下層的液體。將超濾后的駝乳組分置于培養皿中,密封并在-80 ℃冷凍24 h以上。將冷凍后的樣品置于冷凍干燥機中,-58 ℃冷凍干燥48 h,獲得90%～100%組分的凍干蛋白樣品。將凍干蛋白進行溶解,使用SDS-PAGE檢測。

1.4.1.2 駝乳乳鐵蛋白標準品制備

取分離得到的駝乳清組分,使用AKTA蛋白純化儀進行乳鐵蛋白的純化,選用HiTrapTM Heparin H柱進行分離純化。進樣量1.0 mL,流速2 mL/min;AKTA流動相分別為上樣緩沖液A相:0.2 mol/L Na2HPO4溶液;洗脫緩沖液B相:1 mol/L NaCl+0.05 mol/L Na2HPO4溶液構成。收集純化富集后的乳鐵蛋白于透析袋中,置于蒸餾水中透析脫鹽,1次/h更換蒸餾水,透析時長為24 h。透析后的乳鐵蛋白溶液分置于培養皿中,-80 ℃冷凍過夜。隨后將樣品置于冷凍干燥機中,-58 ℃冷凍干燥48 h,獲得凍干后的駝乳鐵蛋白樣品,將凍干蛋白溶解使用SDS-PAGE檢測。

1.4.2 駝乳功能蛋白含量的測定前處理

將冷凍于-80 ℃冰箱駝乳置于40 ℃水中解凍,渦旋5 min,準確量取10 mL乳樣,加入10 mL超純水,4 ℃ 8 000 r/min離心15 min,去除上層乳脂。使用稀釋后的冰乙酸調節乳清pH值至4.6,4 ℃水浴30 min,加速酪蛋白沉淀。隨后經4 ℃ 8 000 r/min離心15～20 min,除去乳清中剩余的酪蛋白(一式兩份)。將其中一份乳清,使用超純水定容至50 mL,經0.22 μm水系微孔濾膜過濾后上機分析乳白蛋白含量。同時,將另一份乳清液,使用飽和NaHCO3溶液將乳清調回至原來的pH值,以防止蛋白質在酸性溶液中變性失活,使用AKTA對乳清中的乳鐵蛋白進行純化,收集純化好的樣液,使用0.22 μm水系微孔濾膜過濾后上機分析乳鐵蛋白含量。對于駝乳中IgG與溶菌酶含量測定前處理,是將冷凍于-80 ℃冰箱駝乳取出置于4 ℃水中緩慢解凍,渦旋混勻后備用,使用前將駝乳水浴至室溫。

1.4.3 色譜條件

1.4.3.1 駝乳α-乳白蛋白色譜條件

使用ACQUITY UPLC Protein BEH C4柱(300 ?,1.7 μm,21 mm×100 mm,1/pkg)色譜柱;流速0.2 mL/min。流動相:A液為0.1%(體積分數)三氟乙酸水,B液為0.1%(體積分數)三氟乙酸乙腈;檢測波長214 nm;進樣量5 μL;樣品溫度25 ℃;柱溫30 ℃;流動相A的梯度變化為:0～2.08 min(75%～68%),2.08～8.34 min(68%～48%),8.34～10.42 min(48%～75%);流動相B的梯度變化為0～2.08 min(25%～32%),2.08～8.34 min(32%～52%),8.34～10.42 min(52%～25%)。

1.4.3.2 駝乳乳鐵蛋白色譜條件

使用ACQUITY UPLC Protein BEH C4柱(300 ?,1.7 μm,21 mm×100 mm,1/pkg)色譜柱;流速0.2 mL/min。流動相:A液為0.1%三氟乙酸水,B液為乙腈;檢測波長為280 nm;進樣量4 μL;樣品溫度25 ℃;柱溫30 ℃;流動相A的梯度變化為:0～2.08 min(70%～45%),2.08～4.17 min(45%～40%),4.17～5.00 min(40%～70%),5.00～6.67 min(70%);流動相B的梯度變化為0～2.08 min(30%～55%),2.08～4.17 min(55%～60%),4.17～5.00 min(60%～30%),5.00～6.67 min(30%)。

1.4.4 駝乳脂肪酸標準溶液與試樣的配制

配制質量濃度為20 g/L NaOH-甲醇溶液,振蕩混勻。取20 mg脂肪酸甲酯混標至10 mL容量瓶中,用正庚烷(色譜純)定容,配制2 mg/mL的混合脂肪酸甲酯標準溶液,置于-80 ℃冰箱密封保存備用。吸取10 mL解凍后的駝乳,加入100 mg焦性沒食子酸,依次加入3顆沸石、2 mL的體積分數為95%乙醇,4 mL超純水及5 mL氨水,置于75 ℃水浴20 min,振蕩頻率4 min/次。待混勻水解,冷卻至室溫后加入10 mL體積分數為95%乙醇,混勻后轉移至分液漏斗中,使用25 mL石油醚沖洗燒杯,并將沖洗液并入分液漏斗中,充分混勻,靜置15 min,收集醚層置于燒瓶中,重復上述步驟3次。設置旋轉蒸發儀水溫為40 ℃,將石油醚旋蒸至干,燒瓶壁上的半不透明殘留物為脂肪的提取物。加入8 mL質量濃度為20 g/L NaOH-甲醇溶液,連接回流冷凝器,設置水浴鍋溫度為80 ℃,使之充分反應直至油滴消失。加入7 mL的15%三氟化硼甲醇溶液,反應3 min,再加入1 mL超純水沖洗冷凝管,取出燒瓶,迅速冷卻至室溫[18]。加入15 mL正庚烷,振蕩5 min后轉移至25 mL試管中,加入2 mL飽和NaCl溶液,靜置15 min。吸取上層澄清透明的正庚烷提取液10 mL,加入8 g Na2SO4,振蕩2 min,靜置15 min,吸取上層溶液,經0.22 μm有機濾膜過濾至進樣瓶中。

1.4.5 氣相色譜條件

選擇HP-FFAP (50.0 m,0.32 mm ID×0.50 μm)色譜柱,檢測器:氫火焰離子檢測器(FID);進樣器溫度270 ℃;檢測器溫度280 ℃;進樣量10 μL;載氣N2;分流比1∶0;流速0.2 mL/min;總程序時間95.33 min;升溫程序如下:100～180 ℃,速率12 ℃/min,保留時間6.00 min;180～200 ℃,速率3 ℃/min,保留時間20 min;200～230 ℃,速率5 ℃/min,保留時間50 min;230 ℃,速率5 ℃/min,保留時間95.33 min。

1.4.6 氣相色譜-質譜條件

使用GC-MS對標準品進行檢測與驗證,條件為:電子轟擊(EI)電離源;色譜柱:DB-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。色譜條件:進樣口溫度280 ℃;進樣量1.0 μL,不分流進樣;程序升溫:60 ℃(5 min)以2 ℃/min升至280 ℃(10 min),20 ℃/min升溫至300 ℃(53 min);載氣He,流速1.0 mL/min。質譜條件:電離方式,電子轟擊源,電離能量70 eV。離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃,接口溫度280 ℃。掃描方式全掃描,掃描范圍20～500 amu,掃描時間0.45 s,溶劑延遲3 min[19]。

1.4.7 數據處理

對駝乳樣品重復檢測3次。所測數據均采用均值±標準差來表示。采用SPSS 25.0對數據進行統計分析,并使用R語言作圖分析,以P<0.05作為統計學顯著性差異標準。

2 結果與分析

2.1 駝乳α-乳白蛋白和乳鐵蛋白標準品電泳

駝源性α-乳白蛋白分子質量約為14 kDa,乳鐵蛋白分子質量約為80 kDa。如SDS-PAGE結果所示(圖1),制備的α-乳白蛋白與乳鐵蛋白14 kDa和80 kDa預期位置處具有明顯的條帶,且純度較高,可作為后續研究的蛋白標準品。

圖1 駱駝乳α-乳白蛋白與乳鐵蛋白SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE analysis of α-lactalbumin and lactoferrin from camel milk注:M-Marker;1-α-乳白蛋白;2-乳鐵蛋白。

2.2 駝乳α-乳白蛋白、乳鐵蛋白和IgG功能蛋白的標準曲線

駝源α-乳白蛋白對照品色譜圖如圖2-a所示,出峰時間為6.373 min;駝源乳鐵蛋白對照品色譜圖如圖2-b所示,出峰時間為3.763 min。色譜峰峰型均呈對稱性且無明顯拖尾。分別配制質量濃度200、400、600、800、1 000 mg/L的α-乳白蛋白,上機檢測,繪制α-乳白蛋白的標準曲線,如圖2-c所示,計算出對應的回歸方程:y=15 868x+888 315(R2=0.998 9,線性范圍200～1 000 mg/L)。分別配制質量濃度25、50、100、200、1 000 mg/L的乳鐵蛋白溶液,上機檢測,繪制乳鐵蛋白的標準曲線。如圖2-d所示,得到對應回歸方程:y=190.86x-2 122.2(R2=0.998 3,線性范圍25～1 000 mg/L)。在450 nm波長下,檢測質量濃度15、25、75、125、250、500 μg/L的IgG的OD值,繪制IgG的標準曲線,如圖2-e所示,回歸方程為y=0.002 5x+0.083 4(R2=0.999 9,線性范圍25～500 mg/L)。

a-α-乳白蛋白對照品色譜圖;b-乳鐵蛋白對照品色譜圖;c-α-乳白蛋白標準曲線;d-乳鐵蛋白標準曲線;e-IgG標準曲線圖2 功能蛋白色譜圖及標準曲線Fig.2 Functional protein chromatogram and standard curve

2.3 駝乳脂肪酸甲酯標準品的氣相色譜圖

使用氣相色譜分離出脂肪酸甲酯混和標準品中的34 種脂肪酸甲酯,如色譜圖(圖3)所示,以運行時間為橫坐標,以信號值為縱坐標,運行總時間為95.33 min。結果表明,各脂肪酸甲酯出峰較好、峰純度高、無雜峰,可進行后續試驗。

圖3 混合脂肪酸甲酯標準溶液的氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of a standard solution of mixed fatty acid methyl ester

2.4 雙峰駝泌乳期內乳α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG和溶菌酶變化分析

泌乳期內動態追蹤20峰泌乳駝,駝初乳中α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG、溶菌酶4 種功能蛋白含量分別為(6.76±1.80) g/L、(0.91±0.62) g/L、(3.05±0.88) mg/mL及(0.49±0.37) μg/mL均極顯著高于常乳期(2.79±0.72) g/L、(0.6±0.54) g/L、(1.24±0.36) mg/mL及(0.24±0.23) μg/mL(P<0.01),并且常乳期中前期功能蛋白變化趨勢小,中后期功能蛋白含量變化幅度明顯,總體呈現波動遞減(圖4-b),推測其變化與仔駝生長過程中不同時間點的身體機能免疫需求密切相關。其中,α-乳白蛋白的含量處于1.14～10.97 g/L區間;泌乳第1天,駝乳中α-乳白蛋白含量最高為(10.97±0.24) g/L,隨著泌乳天數的增加,α-乳白蛋白整體呈現下降趨勢,與MERIN等[20]對單峰駝的報道結果相符。在泌乳的第330天含量最低為(1.14±0.14) g/L;其中處于90～240 d時,駝乳中α-乳白蛋白相對穩定,含量在3.36 g/L,隨后逐漸降低。α-乳白蛋白約為乳鐵蛋白的6.7倍,駝乳中乳鐵蛋白的含量在0.20～2.26 g/L,當母駝泌乳第2天,駝乳中乳鐵蛋白含量最高為(2.26±0.04) g/L,隨著泌乳天數的增加,乳鐵蛋白呈先下降后上升的趨勢,總體而言,初乳期的駝乳中的乳鐵蛋白的含量顯著高于常乳期。整個泌乳期內免疫球蛋白IgG的含量為0.53～4.66 mg/mL。初乳期IgG的含量很高,泌乳第1天時最高為(4.46±0.20) mg/mL,隨后逐漸降低,是由于泌乳過程中催乳素含量的增加使得乳腺上皮細胞上IgG1特異性受體失活,下調了免疫球蛋白IgG的轉移所致[21];在30～90 d波動較大,可能是由于分娩后母駝的正常消化和代謝功能逐漸恢復;在270～330 d大幅波動,可能是由于泌乳末期雙峰駝泌乳功能逐漸衰退。溶菌酶的含量處于0.08～1.16 μg/mL,泌乳第1天溶菌酶含量最高為(1.16±0.01) μg/mL,隨著泌乳天數的增加溶菌酶整體呈現下降趨勢,150 d后趨于穩定。初乳期以及泌乳前期的溶菌酶含量顯著高于泌乳中后期。綜上結果表明,初乳期α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG及溶菌酶含量均高于常乳期,并伴隨常乳期泌乳天數的增加,4種功能性蛋白質的含量逐漸下降并趨于穩定,這與大多數哺乳動物變化趨勢一致[21-22],由于新生幼犢免疫及消化系統發育不全,免疫功能不足以抵抗外界侵擾,初乳中免疫功能蛋白含量高,能增強仔駝免疫力并促進生長。

a-初乳期;b-常乳期圖4 泌乳期內駝乳中α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG和溶菌酶變化Fig.4 α-Lactalbumin, lactoferrin, IgG, and lysozyme content composition of Bactrian camel milk at different lactation periods

2.5 雙峰駝泌乳期內乳α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG和溶菌酶相關性分析

對泌乳期內駝乳中α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG及溶菌酶4種功能蛋白進行相關性分析(圖5)。結果表明,這些功能蛋白之間具有顯著相關性(P<0.05)。其中α-乳白蛋白與IgG具有強正相關(P<0.05,相關系數0.85);溶菌酶與α-乳白蛋白(P<0.05,相關系數0.59)、溶菌酶與和IgG(P<0.05,相關系數0.54)均呈中等強度正相關;乳鐵蛋白分別與溶菌酶(P<0.05,相關系數0.33)、α-乳白蛋白(P<0.05,相關系數0.30)和IgG(P<0.05,相關系數0.17)間具有弱正相關。結果表明這4種功能蛋白間具有一定的協同作用,為幼駝生長發育提供一種非特異性的防御機制。

圖5 泌乳期內駝乳中α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG和溶菌酶相關性分析Fig.5 Correlation analysis between α-lactalbumin, lactoferrin, IgG and lysozyme content composition of Bactrian camel milk at lactation periods

2.6 雙峰駝泌乳期內乳脂肪酸質量分數變化分析

使用氣相色譜對雙峰駝初乳期和常乳期的駝乳中脂肪酸含量進行檢測,共檢測出32種常規脂肪酸。對不同泌乳階段脂肪酸質量分數變化進行展示分析(圖6),駝乳中脂肪酸含量變化主要集中在初乳期4～7 d與常乳期90～150 d期間,母駝妊娠后開始泌乳哺育幼駝,初乳期4～7 d機體逐漸恢復,初乳期過后脂肪酸含量變化不大,乳腺泌乳逐漸恢復及身體脂肪和激素動員的變化,以滿足維持和哺乳需求;而在常乳期90～150 d期間,伴隨著季節及飼草轉換,母駝產奶量達到高峰期,機體隨之改變,因而造成脂肪酸含量一定程度變化,整體看泌乳期間脂肪酸含量變化不大。與伊麗等[23]報道的駝乳脂肪酸質量分數伴隨季節而變化結果不同,原因在于其采集樣本駝處于自然放牧狀態,不同季節采食植物種類不同造成營養差異對奶中脂肪酸組成與含量具有重要影響[24]。分別以飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)、不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)、多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)、短鏈脂肪酸(short chain fatty acid,SCFA)、中鏈脂肪酸(medium chain fatty acid,MCFA)及長鏈脂肪酸(longchain fatty acid,LCFA)為類別進行分析(圖7)。SFA占總脂肪酸含量的56.06%～83.84%,質量分數最高;在UFA中,MUFA含量相對較高。本次試驗未檢測出SCFA,MCFA質量分數最高,占總脂肪酸含量的95.3%～99.3%。這是由于妊娠后母駝處于能量負平衡狀態,機體將儲備的營養物質用于乳汁合成,增加體脂分解,釋放以長鏈脂肪酸為主的脂肪酸用于乳腺或肝臟代謝[25]。UFA占總脂肪酸含量的25.1%～44.1%;LCFA、PUFA與MCFA在初乳期和常乳期均含量均較為穩定;SFA與UFA在初乳期3～7 d內較為變化明顯,在泌乳高峰期90～150 d波動較為明顯,但變化不顯著(P>0.05),其余時期變化不大。初乳期UFA含量較高,對人體健康更為有益。此外,選取的樣本駝為半集約化人工養殖,養殖條件及飼草纖維素的質量水平基本一致,因此使乳脂肪酸質量分數保持在一定水平,變化幅度小。先前研究表明,駱駝乳脂肪酸的組成受環境、飼養條件和飼料成分等多種因素的影響[23, 26],以上結果進一步驗證了準噶爾雙峰駱駝乳脂肪酸的組成受飼養條件及飼草組成的影響。

圖6 泌乳期內脂肪酸含量的變化Fig.6 Heat maps of fatty acid content during lactation

a-初乳期;b-常乳期圖7 泌乳期內不同類別脂肪酸變化Fig.7 Dynamic changes of different fatty acids during lactation

此外,駝乳中最主要的飽和脂肪酸是C14∶0、C16∶0 和C18∶0,其中C18∶0對人體健康有中性的影響,而C14∶0和C16∶0則對人體有害,與人體低密度脂蛋白濃度相關,而低密度脂蛋白是造成動脈粥樣硬化的因素之一。駝乳中的中鏈脂肪酸水平也更高,MCFA比LCFA更容易消化和代謝。作為特殊的反芻動物,雙峰駝通過發酵纖維素產生SCFA,而駝乳中的濃度低于其他物種,是由于SCFA在進入乳中之前進行快速代謝,與母駝激素水平變化相關。初乳期LCFA含量較高,隨著泌乳天數的增加含量降低,可能與母駝在分娩前胰島素敏感較低,分娩后對胰島素敏感性逐漸恢復[27]有關。初乳期高含量MUFA對幼崽髓鞘的形成與大腦發育起關鍵作用[28-29]。母駝分娩后產生代償性高胰島素血癥,高水平胰島素促進了肝臟脂肪合成,與MUFA的合成相關,因此初乳期MUFA含量也較高[30-31]。雙峰駝的MUFA質量分數稍高于其他哺乳動物可能是由于雙峰駝后腸發酵較為緩慢或脂肪酸去飽和酶活性較強所致[32]。此外,也有研究指出乳中的MUFA和UFA的變化也與母體能量狀態有關[33]。PUFA隨著母駝哺乳期的延長含量略有降低,與牧草中含量及動物吸收能力相關。

2.7 雙峰駝泌乳期內乳脂肪酸含量相關性分析

乳制品可為人體提供所需15%～25%的脂肪酸及25%～35%的飽和脂肪酸。不飽和脂防酸具有降低膽固醇的作用,所以其質量分數越高越好。因此,脂防酸的比例是評估乳的營養價值的重要指標之一。哺乳期駝乳的脂肪酸組成和含量主要受飼草營養水平、乳腺的從頭合成及瘤胃微生物組活性等諸多因素決定。與牛乳相比,駝乳脂肪酸的分布和含量更為合理[34]。對泌乳期駝乳中的32種脂肪酸進行相關性分析(圖8)。多數脂肪酸間具有顯著負相關(P<0.05),其中SFA與MUFA的負相關性極強,少數脂肪酸間具有顯著正相關,尤其MCFA和LCF之間具有顯著正相關,這與泌乳期前90 d的阿拉善雙峰駝23種脂肪酸相關性結果相符[9]。在顯著相關的脂肪酸分析結果中,已酸甲酯C6∶0與二十碳二烯酸乙酯C20∶2,二十二碳二烯酸C22∶2n6與二十碳二烯酸乙酯C20∶2和已酸甲酯C6∶0,十二碳酸乙酯C12∶0與乙酸癸酯C10∶0,肉豆蔻酸C14∶0與乙酸癸酯C10∶0和十二碳酸乙酯C12∶0,肉豆寇油酸C14∶1n5與肉豆蔻酸C14∶0和十二碳酸乙酯C12∶0,正辛酸甲酯C8∶0與肉豆蔻酸C14∶0和肉豆寇油酸C14∶1n5,花生四烯酸甲酯C20∶4n6與順芥子酸甲酯C22∶1n9間具有較強正相關性(P<0.05,相關系數≥0.8)。乙酸癸酯C10∶0與順-9-十八碳一烯酸甲酯C18∶1n9c,十二碳酸乙酯C12∶0與順-9-十八碳一烯酸甲酯C18∶1n9c和棕櫚油酸C16∶1n7,肉豆蔻酸C14∶0與順-9-十八碳一烯酸甲酯C18∶1n9c和棕櫚油酸C16∶1n7,正辛酸甲酯C8∶0與順-9-十八碳一烯酸甲酯C18∶1n9c間具有較強負相關(P<0.05,相關系數≤-0.8)。駝乳中不同的脂肪酸組成及含量維持在一定比例,能夠保持機體健康狀態[32]。

圖8 泌乳期內脂肪酸含量間相關性分析Fig.8 Correlation analysis between fatty acid content of Bactrian camel milk at lactation periods

3 結論與討論

本研究建立了駝乳中4 種功能蛋白及脂肪酸超高效液相色譜檢測方法,對準噶爾雙峰駝在泌乳期330 d的駝乳α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG及溶菌酶及脂肪酸含量進行檢測以探究其變化規律。在駝乳中檢測出32 種脂肪酸,種類多于先前的研究報道,但主要組成基本一致[9, 35-36]。與其他乳用家畜一致,泌乳駝初乳期的α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG及溶菌酶的含量顯著高于常乳期,歸因于新生仔畜免疫系統與消化系統發育尚不完善,合成免疫物質的能力不足難以抵抗外界侵擾,初乳中的免疫蛋白在新生幼犢免疫系統的保護和成熟過程中發揮著重要作用[22, 37]。伴隨常乳期泌乳天數的增加,4 種功能性蛋白質的含量逐漸下降?？傮w而言,初乳期及常乳期駝乳中功能蛋白與脂肪酸的組成及含量具有一定差異。對4 種功能蛋白進行相關性分析,發現它們間具有一定的協同作用,是幼駝生長發育的重要防御機制。此外,準噶爾雙峰駝乳動脈粥樣硬化指數低于牛乳,乳中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比例合理,營養成分與人乳相似且具有低致敏性,營養均衡更有利于人類健康[23]。因此,加強對駱駝乳及其乳制品營養資源的開發利用,尤其是在醫療保健價值方面。本研究為新疆雙峰駝的泌乳生理學及功能性駝乳制品的開發提供科學參考。