乳桿菌對腸內分泌細胞胰高血糖素樣肽1分泌的影響

夏雪娟,陳莉敏,李冠楠

1(上海理工大學 健康科學與工程學院,上海,200093)2(西南大學 蠶桑紡織與生物質科學學院,重慶,400715)3(家蠶基因組生物學國家重點實驗室,重慶,400715)

胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)是一種腸促胰島素激素,可通過調控胰島素和胰高血糖素分泌延緩胃排空、降低食欲,發揮調節血糖的作用[1]。GLP-1及其受體已被開發為新型降糖藥物(例如利拉魯肽、艾塞那肽等),在治療2型糖尿病方面取得良好效果[2-3]。GLP-1主要由遠端回腸和結腸中的腸內分泌細胞分泌。腸內分泌細胞屬于分化型腸上皮細胞的一種,是腸道中的營養感受器,其細胞表面存在糖、蛋白質和脂肪等各種營養成分的感應受體,當接收到了腸腔中營養物質刺激后,能夠釋放相應的腸內分泌激素[1, 3-4]。而腸道中,特別是回腸遠端和結腸中還存在著大量的腸道微生物。近年來,越來越多的研究指出,腸道菌群在包括糖尿病在內的多種慢性疾病的發展過程中發揮重要作用[5-6],且有研究指出腸道菌群是調節GLP-1等腸促激素產生的重要因素[7-9]。因此,靶向腸道菌群調節腸促激素代謝已成為糖尿病等慢性代謝性疾病防治的研究熱點之一。

乳酸菌是腸道微生物的關鍵組成部分[4, 10]。目前,已有部分學者開展了乳酸菌對GLP-1分泌的影響研究。如SIMON等[11]采用隨機臨床對照試驗研究羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)對葡萄糖耐受人群GLP-1分泌的影響,發現與安慰劑相比,每天服用L.reuteri會顯著增加GLP-1的釋放。類似地,WANG等[12]研究表明干酪乳酸菌(L.caseiCCFM419)干預會增加糖尿病小鼠GLP-1水平。上述研究均顯示LAB干預會增加GLP-1水平,但由于人體和動物試驗存在“黑箱效應”,無法準確定位作用途徑。因此,部分學者開展了細菌-細胞體外共培養試驗以期揭示調控機理。如PANWAR等[4]通過將多種乳桿菌(Lactobacillus)與腸內分泌細胞共培養,證實了乳酸菌可增加腸道內分泌細胞GLP-1分泌。WEI等[9]采用LAB與小鼠腸內分泌細胞STC-1共培養模型篩選出可增強GLP-1分泌的兩株乳桿菌L.kefiranofaciensM和L.kefiriK。但細菌直接接觸細胞的培養體系無法有效模擬體內環境,因為體內環境中腸內分泌細胞與細菌間存在著腸道黏液等隔離層;此外,高濃度的細菌對細胞存在毒性作用,因此研究結果可能無法直接類推到體內[13]。對此,一些研究人員構建了復雜的體外模型來研究細胞-微生物互作機理,但此類模型對實驗室基礎設施和人員操作技術要求較高[14]。因此,為規避上述局限性,本研究將采用一種簡單易操作、接近體內環境的體外共培養模型分析乳桿菌對腸道內分泌細胞GLP-1分泌的影響,以期更真實的揭示乳桿菌調控糖尿病代謝的作用途徑。

考慮到腸內分泌細胞的需氧性、乳桿菌的兼性厭氧性、腸道環境的低氧性,本研究將采用體細胞(有氧)-黏液層-細菌(微需氧)共培養體系分析乳桿菌對細胞GLP-1分泌的影響。選取的pGIP/Neo STC-1細胞系可產生高濃度的肽激素,是研究GLP-1分泌的良好腸內分泌細胞模型[4]。同時考慮到前期直接的共培養,發現鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、植物乳桿菌(L.plantarum)和約翰氏乳桿菌(L.johnsonii)可促進腸內分泌細胞GLP-1分泌,此外研究表明上述3種乳桿菌具有調節糖尿病等慢性代謝性疾病和改善腸道穩態的功能[4, 15-18]。因此,研究將選用上述3種菌株,設立不同濃度的乳桿菌菌株共培養體系以分析菌株的劑量效應;設立黏液層缺失組以觀察黏液層的缺失對體系的影響;設立共培養管螺旋蓋輕旋組和緊閉組以考察不同O2暴露情況對體系的影響。采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析體系中GLP-1水平的變化,共培養前后體系pH值、細胞活力以及細菌在細胞周圍的分布情況。同時,驗證了共培養后體系pH值改變對ELISA結果的影響,并結合胞內GLP-1熒光染色確保pH值校正后ELISA結果的可靠性。本研究將為靶向腸道菌群調節宿主GLP-1代謝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosusNCIMB6375)、約翰氏乳桿菌(L.johnsoniiNCIMB8795),英國阿伯丁國家工業、食品和海洋細菌收藏中心。植物乳桿菌(L.plantarumKC491380)從健康嬰兒糞便中分離得到。腸內分泌細胞系pGIP/Neo STC-1由英國貝爾法斯特女王大學B.Green教授提供,該細胞系是異質多能鼠STC-1細胞的亞克隆,可對多種刺激做出反應分泌GLP-1。

乳桿菌MRS培養基(7406A)、瓊脂(7178A),英國Neogen Euope公司;含有4.5 g/LL-谷氨酰胺而不含丙酮酸鈉的DMEM培養基,美國生命技術公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青霉素、鏈霉素、遺傳霉素-G418、Ⅱ型豬黏蛋白、HEPES緩沖鹽(NaCl、KCl、CaCl2和MgCl2)、葡萄糖、HEPES、福爾馬林、甘氨酸、山羊血清、牛血清白蛋白(bull serum albumin,BSA),德國Sigma公司;GLP-1 ELISA試劑盒(EGLP-35K),德國Merck Millipore公司;2 g/L Trypan blue溶液、Hoechst 33342(20 mmol/L)、透化溶液、吐溫20,賽默飛世爾科技公司;GLP-1-FITC抗體,百歐泰生物科技有限公司。其余均為實驗室常用試劑,市售分析純。

1.2 儀器與設備

Hera cells 150 CO2培養箱、Invitrogen細胞計數儀、Savant SPD2010 SpeedVac濃縮儀、Cell Insight NXT High Content篩選平臺,賽默飛世爾科技;ROTINA 380 臺式離心機,德國Andreas Hettich有限責任公司;FE20/EL20型pH計,瑞士梅特勒-托利多有限公司;AxioCam顯微鏡,德國ZEISS公司;其余為實驗室常用設備。

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌菌株預培養

將3株乳桿菌菌株接種至MRS液體培養基中,37 ℃過夜(16～18 h)培養進行復蘇活化。而后涂布于MRS瓊脂平板上,過夜培養后用Parafilm封口膜封口,4 ℃保存備用(限1周內使用)。共培養前一天,挑取單個菌落接種到10 mL MRS培養基中過夜培養。然后使用MRS液體培養基將細菌培養物稀釋至OD600=1.5(相當于細菌濃度為1×109CFU/mL[4])。將稀釋的細菌培養物4 ℃保存,將在同一天用于與pGIP/Neo STC-1細胞共培養。

1.3.2 腸內分泌細胞預培養

將pGIP/Neo STC-1細胞從液氮中復蘇至補充有4.5 g/LL-谷氨酰胺(不含丙酮酸鈉)、100 g/L FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素和400 g/mL遺傳霉素-G418的DMEM培養基中,而后置于37 ℃、5% CO2(體積分數,下同)的培養箱中培養,每周傳代兩次。將采用第20～50代細胞用于共培養。在共培養前一天,將細胞以2×106個/孔的濃度接種于含有蓋玻片(圓形,直徑19 mm)的12孔組織培養板中,并在37 ℃孵育過夜(18～24 h),以使細胞黏附于蓋玻片上。共培養前1 h,吸棄原含抗生素DMEM培養基,然后向每孔加入不含抗生素的新鮮1 mL預熱DMEM培養基。

1.3.3 共培養體系建立

將含有10 g/L瓊脂的1 000 mL MRS培養基高壓滅菌并冷卻至約40 ℃,而后加入1 mL 1.3.1節中已稀釋的乳桿菌培養物,搖晃均勻。將該接種物以40 mL/管轉移到50 mL無菌管中,靜置30 min使其凝固。而后向頂部加入1 mL無菌黏液(50 g/L黏蛋白和8 g/L瓊脂,pH 6.8),靜置10 min使其凝固。再將1.3.2節中制備的帶有pGIP/Neo STC-1細胞的蓋玻片倒置放在黏液層頂部(含有細胞面朝向黏液層),然后加入不含抗生素的預熱DMEM培養基至總體積為50 mL,蓋上試管螺旋蓋。最后,將共培養體系置于37 ℃、5% CO2的培養箱中共培養18 h。共培養體系的制備流程見電子版增強出版附圖1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035891)。

圖1 氧氣暴露和黏液層缺失對GLP-1分泌的影響Fig.1 Effect of oxygen exposure and missing mucus layer on the GLP-1 secretion of cells注:“+”為含有,“-”為不含有。柱狀圖中不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)(下同)。

為研究不同乳桿菌數量對細胞的影響,根據預實驗結果,將L.rhamnosus和L.johnsonii的濃度梯度設置為1×109、1×108、1×107CFU/1 000 mL,將L.plantarum濃度梯度設置為1×109、1×108、1×107、1×106、1×105CFU/1 000 mL。同時,為分析不同氧濃度對共培養體系的影響,分別設置試管螺旋蓋輕旋和緊閉體系以測試O2暴露情況對體系的影響。另外還設有無黏液層的體系,以研究黏液存在與否對體系的影響。設置不含乳桿菌以及同時不含乳桿菌和細胞的體系作為對照。每種條件設置3個重復。

1.3.4 頂部液體培養基收集和pH檢測

共培養結束后,小心收集體系頂部的液體培養基(約10 mL)至15 mL離心管中(置于冰上),而后4 ℃、5 000×g離心5 min以去除細胞和細菌。收集上清液并測量其pH值,然后將上清液于-80 ℃下儲存以備GLP-1含量測定。

1.3.5 GLP-1分泌量檢測

采用ELISA試劑盒測定頂部液體培養基中的GLP-1含量?？紤]到試劑盒的檢測限,將上清液用濃縮器真空濃縮24 h,然后溶解在HEPES緩沖液(pH 7.4)中。本課題組之前的研究經驗提示ELISA測試結果可能會受溶液pH值的影響,為了驗證這一猜想,測定了濃縮溶液調節pH前后(使用1 mol/L HCl溶液或NaOH溶液調節到7.4)GLP-1濃度的不同?；诖蓑炞C試驗結果,后續在GLP-1測定前統一將溶解溶液pH值調節至7.4。

1.3.6 細胞活力測試

去除體系頂部液體培養基后,使用細胞刮刀小心地將黏附在蓋玻片上的細胞刮下并移至1 mL預熱的DMEM培養基中。用2 g/L Trypan blue溶液染色后,使用細胞計數器檢查細胞活力。

1.3.7 革蘭氏染色和細胞內GLP-1成像

為檢查蓋玻片上細菌的分布情況,在去除頂部液體培養基后,對蓋玻片(帶細胞)上的乳桿菌進行革蘭氏染色,100倍油鏡下觀察拍照。

使用Cell Insight NXT High Content篩選平臺對細胞內GLP-1進行可視化成像。共培養后,將黏附在蓋玻片上的細胞小心地移至12孔組織培養板中。向每孔中加入1 mL 100 g/L福爾馬林以固定細胞,之后用1×PBS洗滌細胞4次。加入含有1 g/L Trition X-100的PBS溶液,室溫下透化30 min,用1×PBS洗滌細胞4次。在室溫下加入封閉溶液(PBS含0.1 g/L吐溫20、0.3 mol/L甘氨酸、100 g/L山羊血清和10 g/L BSA)1 h。然后除去封閉溶液,用含有0.1 g/L吐溫和10 g/L BSA的PBS稀釋GLP-1-FITC抗體至1∶200(U∶mL),并在4 ℃暗處孵育過夜以染色GLP-1。除去上清液,用1×PBS洗滌細胞3次,每次5 min。加入Hoechst溶液,并在室溫下在暗處孵育10 min以染色細胞核。用1×PBS洗滌兩次,而后重新加入1×PBS,采集細胞在350～461 nm(Hoechst)和485～520 nm(GLP-1-FITC抗體)處的顯微圖像和熒光強度。

1.4 數據處理

數據采用均值±標準偏差表示,采用SPSS 20.0統計軟件組間one-way ANOVA檢測,檢驗的顯著性水平設定為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 pH值對GLP-1測試結果的影響

由于乳桿菌發酵產酸會改變體系pH,因此首先研究了pH對GLP-1濃度ELISA測定結果的影響,結果如電子版增強出版附圖2所示。共測試6組樣本(Groups 1～6),每組3份平行樣品,其中一份樣品的pH值未調節,另外兩份調節至pH為7.4(同ELISA試劑盒緩沖液pH值)。共培養后,未調節樣品的pH值高于7.4(第1、2、5組)或低于7.4(第3、4、6組)。來自同一組的3個樣品具有相同的培養條件。然而,當pH值不同時,與其他兩個樣品(調節pH)相比,pH值未調節的樣品的GLP-1濃度結果呈現不規則的明顯變化。而同一組中pH值相同的兩個樣品則擁有相似的GLP-1結果。這些結果表明溶液pH值會影響GLP-1的ELISA檢測結果。

圖2 L.rhamnosus對細胞分泌GLP-1的影響Fig.2 Effect of L.rhamnosus on the GLP-1 secretion of pGIP/Neo STC-1 cells注:L.rhamnosus行數值為體系中初始細菌濃度,單位為CFU/1 000 mL(下同)。

2.2 O2暴露和黏液層對細胞GLP-1分泌的影響

通過設置試管螺旋蓋緊閉(Tube-closed)組和無黏液層(No-mucus)組,經與不含細菌的對照(Control)組和不含乳桿菌和細胞的空白對照(Blank)組比較,分析O2暴露情況和黏液存在與否對體系的影響。共培養體系的實拍圖見電子版增強出版附圖3。各組GLP-1濃度見圖1,結果表明,No-mucus組的GLP-1濃度(15.13 pmol/L)顯著低于Control組(26.01 pmol/L)(P<0.05),說明黏液層缺失會降低GLP-1分泌。類似地,Tube-closed組的GLP-1濃度(14.58 pmol/L)明顯低于Control組(P<0.05),說明限制O2量會降低GLP-1分泌。

圖3 L.plantarum對細胞分泌GLP-1的影響Fig.3 Effect of L.plantarum on the GLP-1 secretion of pGIP/Neo STC-1 cells

2.3 乳桿菌對pGIP/Neo STC-1細胞GLP-1分泌的影響

2.3.1L.rhamnosus

圖2展示了與L.rhamnosus共同培養后pGIP/Neo STC-1細胞GLP-1的分泌情況。各組的條件設置見圖下方標注。Lr-1組的GLP-1分泌明顯高于Lr-C組(P<0.05),而Lr-1、Lr-4和Lr-5組間差異無統計學意義。這些結果表明,L.rhamnosus會增加PGIP/Neo STC-1細胞的GLP-1分泌,且菌株初始濃度為1×109、1×108、1×107CFU/1 000 mL時促進效果是相似的。Lr-2組的GLP-1分泌量明顯低于Lr-C組(P<0.05),說明與L.rhamnosus共培養時缺少黏液層會降低細胞GLP-1分泌量。另外,Lr-3組的GLP-1濃度與Lr-1組相比沒有顯著差異,說明限制O2條件并不影響該體系內GLP-1分泌。

2.3.2L.plantarum

與L.plantarum共同培養后pGIP/Neo STC-1細胞分泌GLP-1的情況見圖3,各組的條件設置見圖下方標注。Lp-1和Lp-4組的GLP-1濃度明顯低于Lp-C組(P<0.05),Lp-5、Lp-6和Lp-7組間無顯著差異,表明L.plantarum初始濃度為1×105、1×106、1×107CFU/1 000 mL時,不影響細胞GLP-1的分泌。然而當初始濃度為1×109CFU/1 000 mL或1×108CFU/1 000 mL,L.plantarum會減少細胞的GLP-1分泌量。Lp-2組的GLP-1濃度顯著低于Lp-1組(P<0.05),Lp-1與Lp-3組間差異無統計學意義,說明在沒有黏液層的情況下,細胞的GLP-1分泌減少,而O2條件對于與L.plantarum共培養的細胞沒有顯著影響。

2.3.3L.johnsonii

圖4顯示了與L.johnsonii共同培養后pGIP/Neo STC-1細胞GLP-1的分泌情況,各組的條件設置見圖下方標注。Lj-1組的GLP-1濃度顯著低于Lj-C組(P<0.05),Lj-C、Lj-4和Lj-5組間無顯著差異,說明當L.johnsonii的初始濃度為1×107、1×108CFU/1 000 mL時,與其共培養不影響pGIP/Neo STC-1細胞的GLP-1分泌。而當初始濃度為1×109CFU/1 000 mL時,會降低細胞的GLP-1分泌。Lj-2和Lj-3組的GLP-1濃度顯著低于Lj-1組(P<0.05),說明與L.johnsonii共培養時黏液層缺失或O2受限會減少細胞GLP-1分泌。

圖4 L.johnsonii對細胞分泌GLP-1的影響Fig.4 Effect of L.johnsonii on the GLP-1 secretion of pGIP/Neo STC-1 cells

2.4 體系pH值和細胞活力

共培養前后各組pH值變化見表1。Blank、Control和No-mucus組的pH值無顯著差異,而Tube-closed組的pH顯著低于上述3組(P<0.05),但仍高于7.4。Lr-C、Lp-C和Lj-C組的pH值分別顯著高于Lr-1～Lr-5、Lp-1～Lp-7和Lj-1～Lj-5組(P<0.05),說明L.rhamnosus、L.plantarum和L.johnsonii的存在降低了共培養體系的pH值。

表1 共培養后頂部液體培養基的pH值和細胞活力Table 1 pH of the top liquid medium and viability of cells after co-culture

Control、No-mucus和Tube-closed組的細胞活力無顯著差異(表1),表明在沒有乳桿菌存在時,黏液層缺失或限氧條件并不會影響pGIP/Neo STC-1細胞的活力。Lr-1、Lr-3、Lr-4和Lr-5組的細胞活力顯著低于Lr-C組(P<0.05),表明鼠李糖乳桿菌降低了共培養體系中的細胞活力。Lp-1、Lp-3和Lp-4組的細胞活力顯著低于Lp-C組(P<0.05),而Lp-C與Lp-5、Lp-6和Lp-7組差異無統計學意義,說明植物乳桿菌在其起始濃度高于1×108CFU/1 000 mL時會降低細胞活力,當濃度低于1×107CFU/1 000 mL時不影響細胞活力。約翰氏乳桿菌組也觀察到了相同的趨勢,因為Lj-1、Lj-3和Lj-4組的細胞活力顯著低于Lj-C和Lj-5組(P<0.05)。這些數據表明不同乳桿菌菌株對pGIP/Neo STC-1細胞活力影響不同,且不同起始濃度的同一種乳酸菌濃度對細胞活力的影響也有差異。

2.5 革蘭氏染色和胞內GLP-1熒光成像

革蘭氏染色的結果直觀顯示了蓋玻片上乳桿菌和細胞的分布情況(圖5)。在不含黏液層時,乳桿菌與細胞直接接觸(圖5-c),且部分細菌深入細胞內部。在有黏液層的體系中,黏液層隔絕了部分細菌。然而,仍有部分細菌穿過黏液層,遷移至細胞表面(圖5-b、圖5-d)。說明在該體系中黏液層具有一定的屏障作用,但并不能隔絕所有細菌。為了驗證上清液中GLP-1水平是否真實反映GLP-1細胞內生成情況,進行了細胞內GLP-1成像分析(電子版增強出版附圖4)。結果顯示GLP-1強度與ELISA結果高度一致。說明ELISA結果具有較好的可靠性。

a-無細菌;b-常規共培養體系;c-無黏液層;d-管口緊閉圖5 共培養體系的革蘭氏染色結果Fig.5 Gram staining images of bacteria after co-culture with pGIP/Neo STC-1 cells

3 結論與討論

目前腸道微生物與宿主間的相互作用分析多依賴于動物模型[19-20],但該方法存在物種差異;此外,部分學者開展了細菌和體細胞直接共培養試驗[4, 9],但在體內微生物與細胞之間存在黏液層,因此該方法無法準確反映細菌細胞的互作情況。因此,構建模擬體內環境的體外共培養體系對細菌細胞互作研究具有重要意義。學者們已構建出類器官培養技術[21]、生物反應器模型[22]、微流控器官芯片裝置[23]等技術方法體系,但上述方法體系操作復雜,技術和設備要求高。本文采用的共培養體系改良自“Human oxygen-bacteria anaerobic”體系,該體系由SADAGHIAN SADABAD等[24]構建,他們使用該系統研究了糞桿菌(Faecalibacteriumprausnitzii,專性厭氧菌)對人體細胞的影響。該方法構建了簡單而獨特的體細胞-腸道微生物共生體系。在腸道微生物與宿主相互作用關系研究中具有良好的應用潛力。然而,腸腔是低氧環境,細菌在不同的O2條件下的表現可能不同[25-26]。因此,考慮到乳桿菌的生長條件,本研究使用普通MRS培養基代替厭氧培養基,將細菌的厭氧條件改為低氧狀態。該體系的建立為研究體細胞與乳桿菌的互作提供了良好的方法模型。

研究分析了不同濃度L.rhamnosus、L.plantarum和L.johnsonii對pGIP/Neo STC-1細胞GLP-1分泌的影響。結果表明,L.rhamnosus會增加細胞的GLP-1分泌,而無濃度效應。然而,當L.plantarum和L.johnsonii的起始濃度分別低于1×107、1×108CFU/1 000 mL時,GLP-1的分泌不受影響。值得注意的是,當L.plantarum和L.johnsonii的起始濃度分別高于1×108CFU/1 000 mL和1×109CFU/1 000 mL時,GLP-1的分泌量降低。與WEI等[9]的結果類似,本研究結果證實了不同的乳酸菌菌株對STC-1細胞具有不同的影響。然而,PANWAR等[4]通過直接將菌株與細胞共培養發現所選的3種菌株都可刺激GLP-1分泌。這說明不同共培養條件會獲得不同的研究結果,而本研究的共培養體系更接近于真實的體內條件。

進一步研究了O2暴露對細胞GLP-1分泌的影響。當沒有細菌存在時,細胞在低氧條件下表現出顯著降低的GLP-1分泌水平(P<0.05)。當與L.rhamnosus和L.plantarum共培養時,有限的O2條件并不影響細胞的GLP-1分泌,而與L.johnsonii共培養時,GLP-1分泌顯著降低(P<0.05)。本研究試圖通過測量細胞活力來解釋這種現象,然而,結果與GLP-1分泌的變化不符,因為有限的O2條件不會影響細胞的活力,無論是否有細菌存在。此外,由于無黏液層存在時細菌直接與細胞接觸,但細胞GLP-1分泌量降低,說明細菌是通過產生代謝產物,而非直接接觸影響細胞GLP-1代謝。因此,假設GLP-1分泌的不同變化趨勢可能是由于菌株的不同代謝物引起的,但該假設有待進一步驗證。

綜上所述,不同的乳桿菌菌株對pGIP/Neo STC-1細胞GLP-1分泌的影響不同。而且,當濃度不同時,同一菌株表現出不同的效果。在進行體外研究以探討腸道微生物與宿主之間的相互作用時,應考慮腸腔環境,例如O2濃度和黏液層的存在。在進一步的研究中應收集頂部液體培養基開展代謝組學分析,以篩選L.rhamnosus產生的刺激GLP-1分泌的功能成分。