高光學純度乳酸菌株的篩選及發酵性能研究

劉蘭,李鵬,王通,黃筱萍

(江西省科學院微生物研究所,江西 南昌,330096)

乳酸又名2-羥基丙酸(2-hydroxy propanoic acid),作為生物基大宗化學品,在化工、醫藥、食品等領域有著廣泛的應用。根據乳酸的旋光性質可分為L-乳酸、DL-乳酸和D-乳酸[1-4]。目前全球乳酸行業主要是以生產DL-乳酸和L-乳酸為主,僅有少數幾家企業能生產D-乳酸,且產量很低。隨著可生物降解的綠色環保塑料聚乳酸(polylactic acid,PLA)的興起,對高光學純度L-乳酸、D-乳酸的需求量急劇增加[5-6]。以L-乳酸為原料制成的聚L-乳酸(PLLA)存在多種性能不穩定的缺點,通過在PLLA中加入一定量的聚D-乳酸(PDLA)進行共混,形成的聚乳酸(scPLA)具有更高的溶解溫度和更好的機械性能[7],可用于高附加值工程塑料領域和改善PLA性能拓展等領域,但對制備PLA的原料L-乳酸和D-乳酸的光學純度有很高的要求[8-10]。微生物利用淀粉質原料發酵生產乳酸,大多數乳酸菌只產生DL-乳酸[11-12],只有極少數的菌株和一些工程改造菌能生產高光學純度的L-乳酸或D-乳酸[13-14]。尤其是D-乳酸在發酵菌種的多樣性及發酵水平方面存在較大的差距,光學純度難以達到生產聚合級乳酸標準,遠遠不能滿足PLA工業市場的需要。盡管國內外眾多學者多年來已經在發酵法生產L-或D-乳酸取得了很多的研究成果,但仍存在光學純度低、產酸低或發酵周期長等問題[15-19]。孫家奪等[20]報道了利用Sporolactobacillussp.YBS1-5發酵90 h,D-乳酸產量為111.8 g/L,產酸速率為1.24 g/(L·h),光學純度為98.0%。胡中華等[21]采用凝結芽孢桿菌JD-DFT011發酵生產L-乳酸,在套接菌種量為28%時,L-乳酸最高光學純度和回收率分別達99.80%和98.57%。通過基因改造在獲得高光學純度L-乳酸和D-乳酸菌方面取得了較大的進展。但由于工程菌的穩定性及生產上的適用性等原因,菌株在工業化生產中的應用亦很困難[22]。因此篩選高光學純度的L-乳酸或D-乳酸生產菌成為乳酸行業發展首要解決的問題,而通過從自然界中分離高光學純度的L-乳酸或D-乳酸產生菌,是獲得高光學純度乳酸生產菌的有效方法。

基于自然界產乳酸的菌株十分豐富,本研究旨在通過建立高效的篩選方法,分離獲得高光學純度的L-乳酸或D-乳酸產生菌,作為后續菌種改良和發酵調控的出發菌株。為工業化生產提供高產酸量、高光學純度的優良菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣本采集

從江西省安義縣鳳凰山桃園、南豐縣羅里石蜜桔種植基地、贛州信豐縣裕和臍橙種植基地、九江市葡萄種植基地、福建莆田和龍巖的龍眼、荔枝種植基地的果園土壤、腐爛果實和樹皮中采集樣品,以及在市售的酸菜、泡菜中采集樣品,裝入無菌的采樣袋中,置4 ℃冰箱保存。

1.1.2 儀器與試劑

BX43相差生物顯微鏡,美國OLYMPUS公司;D30分光光度計,德國Eppendorf股份公司;Arktik多功能PCR儀,賽默飛世爾科技有限公司;2695e高壓液相色譜儀、2414示差檢測器、2489紫外檢測器,美國Waters公司;Practum 224-ICN分析天平,德國Sartorius公司;H1650-W高速離心機,湖南湘儀離心機儀器有限公司;ZWY-2102C恒溫培養振蕩器,上海智城分析儀器制造有限公司;SPX-250B-Z生化培養箱,上海博迅儀器有限公司;SW-CJ-1CU潔凈工作臺,蘇州安泰空氣設備有限公司。

厭氧產氣袋(規格350 mL和2.5 L)、培養袋(規格15 cm×30 cm和2.5 L)、氧氣指示劑,日本三菱株式會社;DL-乳酸鈉標準品,美國SIGMA公司;輕質碳酸鈣,廣西西隴化工有限公司;葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉等試劑,生工生物工程(上海)股份有限公司;其他試劑均為分析純或化學純。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基

MRS培養基(g/L):葡萄糖10、酵母粉10、蛋白胨5、KH2PO40.25、K2HPO40.25、MgSO4·7H2O 0.4、MnSO4·5H2O 0.02、FeSO4·7H2O 0.02、NaCl 0.02,pH 6.8。

產酸分離培養基(g/L):在MRS液體培養基中加入CaCO35,瓊脂粉18。

種子培養基(g/L):在MRS液體培養基中加入CaCO35。

基礎發酵培養基(g/L):葡萄糖120、酵母粉5、蛋白胨5、KH2PO40.25、K2HPO40.25、MgSO4·7H2O 0.4、MnSO4·5H2O 0.02、NaCl 0.02、CaCO355。

1.2.2 樣品的分離與純化

取0.25 g樣品加入5 mL的MRS液體培養基中,置于放有厭氧產氣袋和O2指示劑的培養袋中,密封后于37 ℃厭氧靜置培養48 h,富集厭氧菌。定量量取15 mL產酸分離培養基倒入φ9 cm無菌平皿中,取0.1 mL富集后的菌液進行梯度稀釋度,稀釋液涂布于平皿中,稀釋液菌濃度以每平皿中長10～100個菌落為宜,平皿置于放有厭氧產氣袋的培養袋中,密封后于37 ℃厭氧靜置培養48 h后進行觀察,挑選透明圈大的單菌落進行劃線純化培養,連續純化3次后,接種于MRS斜面培養基中,同樣條件下厭氧培養48～72 h,置4 ℃冰箱保存。

1.2.3 高光學純度產乳酸菌株的搖瓶篩選

保存的斜面菌株分別用2 mL的生理鹽水洗脫,全部菌液接入裝有30 mL種子培養液的三角瓶中,置于裝有350 mL厭氧產氣袋和O2指示劑的培養袋,密封后固定在搖床中,于37 ℃、150 r/min厭氧培養16 h。種子液按6%的接種量接種至100 mL發酵液中,搖瓶發酵厭氧培養方式同種子液,于37 ℃、180 r/min厭氧培養48 h,取發酵液按1.2.6節分析方法檢測乳酸濃度及光學純度。篩選產高光學純度的L型或D型乳酸菌株進行菌種鑒定和進一步發酵試驗。

1.2.4 高光學純度產乳酸菌株的鑒定

1.2.4.1 形態學觀察

將不同菌株分別涂布于產酸分離培養基中37 ℃、厭氧培養48 h后,觀察菌落形態,同時進行革蘭氏染色,于顯微鏡下觀察菌體形態。

1.2.4.2 生理生化鑒定

將純化的產酸菌分別接種于不同的生理生化培養基中,參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[23]和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[24]對菌株進行生理生化鑒定。

1.2.4.3 菌株16S rDNA序列擴增與分析

提取待測菌株的基因組DNA,以引物7F(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和1540R(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGRECA-3′)擴增16S rDNA。PCR反應條件:95 ℃、5 min預變性;94 ℃、30 s變性,57 ℃、30 s退火,72 ℃、90 s延伸,30個循環;72 ℃、10 min延伸,PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳,在生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序及全基因序列分析。

系統進化樹的構建和分析:將測序獲得16S rDNA序列在NCBI核酸數據庫中進行BLAST搜索比對,結果采用MEGA8.0中的鄰接法(neihbor-joining tree)進行系統樹的構建,并用Bootstrap對進化樹進行1 000次可信度分析。

1.2.5 高光學純度產乳酸菌株發酵性能研究

1.2.5.1 生長曲線的測定

將待測菌株按5%接種量接種于MRS培養液中,于37 ℃、150 r/min厭氧培養24 h,每隔2 h取樣,用分光光度計測定波長600 nm處的OD值,獲得生長曲線。

1.2.5.2 種子液培養和發酵產酸試驗

菌株分別接種于種子培養液中,依據不同菌株的最佳種齡于37 ℃、150 r/min厭氧培養12～18 h,按6%的接種量接種于搖瓶發酵培養液中,于37 ℃、180 r/min厭氧培養72 h,每12 h取樣測定乳酸含量和殘糖,發酵結束時測定光學純度。

1.2.6 檢測方法

1.2.6.1 乳酸和葡萄糖含量測定

發酵液于10 000 r/min離心10 min,取上清液,稀釋,用0.22 μm聚醚水性濾膜過濾,采用Waters e2695 Alliance高效液相色譜分離單元和Waters 2414示差檢測器進行分析。色譜條件:色譜柱TOSOH Tskgel OApak-P+OApak-A(300 mm×7.8 mm,5 μm);柱溫30 ℃;進樣量10 μL;流速1.0 mL/min;流動相0.75 mmol/L H2SO4;根據標準校正曲線計算發酵液中乳酸和糖含量。

1.2.6.2 乳酸光學純度測定

將發酵液中乳酸含量稀釋至1 g/L左右,采用Waters e2695 Alliance高效液相色譜分離單元和Waters 2489UV/Vis紫外檢測器進行分析。色譜條件:色譜柱 SUMICHIRAL OA-5000(4.6 mm×150 mm);柱溫40 ℃;進樣量5 μL;流速1.0 mL/min;流動相1 mmol/L CuSO4。根據面積歸一法計算乳酸L體或D體含量,如公式(1)、公式(2)所示。

L體光學純度/%(ee)=(SL-SD)/(SL+SD)×100

(1)

D體光學純度/%(ee)=(SD-SL)/(SL+SD)×100

(2)

式中:SL,L體峰面積;SD,D體峰面積。

2 結果與分析

2.1 產乳酸菌株的初篩、產酸水平及光學純度初步分析

將采集的100多份樣品通過產酸平皿的篩選純化,獲得77株產酸菌株,通過搖瓶對產乳酸能力和光學純度的初步分析,其中2株為產高光學純度D-乳酸菌株,2株產高光學純度L-乳酸菌株,其光學純度均達99.80%(ee)以上;另外有58株產DL-乳酸菌株,有些菌株產乳酸較高。表1為具有工業應用潛力的4株產高光學純度乳酸菌株和部分高產DL-乳酸菌株的初篩結果,圖1為4株產高光學純度乳酸菌株的光學純度色譜圖。

圖1 四株高光學純度乳酸菌株的光學純度色譜圖Fig.1 Optical purity chromatograms of four high optical purity lactic acid bacteria strains

表1 有潛在應用價值的乳酸菌初篩結果Table 1 Preliminary screening results of potential lactic acid bacteria

菌株HA7-5和HJ57為高光學純度L-乳酸生產菌,L-乳酸光學純度分別達到100%和99.88%,菌株HB49-2和HL64-1為高光學純度D-乳酸生產菌,D-乳酸光學純度分別達到100%和99.90%,這4株菌株光學純度均很高,但乳酸產量偏低,不及大部分DL-乳酸產生菌,可通過進一步優化發酵條件和培養基組成以及誘變技術和基因定向改造以提高產量。其他6株菌株均為DL-乳酸生產菌,它們在基礎發酵培養基中乳酸產量很高,其中有4株菌株在發酵48 h產量均達到了90 g/L以上,具有潛在的工業化應用價值。

2.2 四株產高光學乳酸菌株的鑒定

2.2.1 菌株形態學觀察

4株產高光學純度乳酸菌株在固體平板培養基上培養48 h,觀察各菌株菌落形態,以及菌體革蘭氏染色后于100×顯微鏡觀察下菌體形態,見表2及圖2、圖3。

圖2 四株高光學純度乳酸菌株的菌落形態Fig.2 Colony morphology of four high optical purity lactic acid bacteria strains

圖3 四株高光學純度乳酸菌株的菌體細胞形態Fig.3 Cell morphology of four high optical purity lactic acid bacteria strains

表2 菌落及菌體細胞的形態特征Table 2 Morphological characteristics of colonies and cells

2.2.2 菌株生理生化鑒定

將4株產高光學純度乳酸的菌株分別接種于相應的生理生化培養基,與未接菌的空白組作對比,通過檢測各菌株的生理生化特性,根據革蘭氏染色及生理生化反應結果(表3),參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》,菌株HA7-5、HJ57、HB49-2和HL64-1的主要生理生化特征分別與屎腸球菌、格氏乳球菌、德氏乳桿菌和假腸膜明串株菌的生理生化特征相符。

表3 四株高光學純度乳酸菌株的主要生理生化特征Table 3 Main physiological and biochemical characteristics of four high optical purity lactic acid bacteria strains

2.2.3 菌株16S rDNA序列分析

為了進一步鑒定菌株HA7-5、HJ57、HB49-2及HL64-1,對其16S rDNA序列分別進行了測定。BLAST比對結果顯示菌株HA7-5、HJ57、HB49-2及HL64-1分別屬于屎腸球菌、格氏乳球菌、德氏乳桿菌及假腸膜明串珠菌,其中菌株HA7-5與E.faeciumVVEswe-R同源性為100%,菌株HJ57與L.garvieaeNBRC100934同源性為100%,菌株HB49-2與L.delbrueckiiATTC9649同源性為99.8%,菌株HL64-1與L.pseudomesenteroidesG29同源性為100%。此外,利用MEGA 8.0中的鄰接法(NJ)構建了這些菌株的系統發育進化樹(圖4)。結合形態學、生理生化鑒定結果,推測菌株HA7-5、HJ57、HB49-2及HL64-1分別屬于屎腸球菌亞種、格氏乳球菌亞種、德氏乳桿菌亞種及假腸膜明串珠菌亞種,分別命名為屎腸球菌HA7-5、格氏乳球菌HJ57、德氏乳桿菌HB49-2及假腸膜明串珠菌HL64-1。

a-屎腸球菌HA7-5;b-格氏乳球菌HJ57;c-假腸膜明串株菌HL64-1;d-德氏乳桿菌HB49-2圖4 基于16S rDNA序列BLAST結果4株高光學純度乳酸菌株的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic trees of four high optical purity lactic acid bacteria strains based on 16S rDNA sequence BLAST results

自然界中能產乳酸的微生物很多,但大多數乳酸菌只產生DL-乳酸,產高光學純度L-乳酸和D-乳酸的乳酸菌極少。相較于L-乳酸,無論在研發還是實際生產應用中,高光學純度D-乳酸的發酵菌種屬種多樣性和發酵水平亦遠低于L-乳酸。產L-乳酸的乳酸菌相對分布較廣,產D-乳酸的菌株主要分布在4個菌屬中:乳桿菌屬(Lactobacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、芽孢乳桿菌屬(Sporolactobacillus)和明串株菌屬(Leuconostoc)[25]。通常野生菌株L-乳酸和D-乳酸產量和光學純度均較低,通過菌株誘變可以大幅度提高產量,但光學純度很難得到提高。如DEMRIC等[26]用甲基磺酸乙酯(ethyl methylsulfone,EMS)誘變D-乳酸產生菌L.delbrueckiiATCC 9649,D-乳酸產量從67 g/L增長到117 g/L,但光學純度未有變化,均在97.5%左右。于培星[27]利用鈷60γ-射線輻照凝結芽孢桿菌JD-063D,使得D-乳酸產量由出發菌株的61 g/L提高至145 g/L,光學純度略有增加,達98.7%。本研究的目的是從自然界中獲得光學純度高于99.5%(ee)的D型和L型的野生菌株。共篩選獲得了4株高光學菌株并進行了形態學、生理生化和16S rDNA鑒定,其中2株D-乳酸菌L.PseudomesenteroidesHL64-1和L.DelbrueckiiHB49-2的光學純度(ee值)分別達到99.90%和100%,發酵48 h產量分別達60.39 g/L和52.85 g/L;2株L-乳酸菌E.faeciumHA7-5和L.garvieaeHJ57的光學純度(ee值)分別達到100%和99.88%,發酵48 h產量分別達48.69 g/L和34.13 g/L。除德氏乳桿菌外,目前還未見到產高光學純度和高產乳酸的假腸膜明串珠菌、屎腸球菌和格氏乳桿菌的報道,雖然所分離的高光學純度乳酸菌乳酸的發酵水平較低,但光學純度均非常高,通過基因突變育種、改良培養基組成和優化發酵條件等,有望在產量、發酵速率及原料多樣性等方面得到較大的提升空間,不僅拓展了高光學純度生產菌株的多樣性,亦具有潛在工業應用價值。

2.3 產高光學純度乳酸菌株發酵性能的初步研究

對4株產高光學純度乳酸的菌株進行了生長曲線測定和發酵試驗。圖5-a為4株菌株的生長曲線,從中可看出,菌株HA7-5、HJ57和HL64-1在6 h左右進入對數生長期,10～12 h進入穩定生長期,而菌株HB49-2在12 h進入對數生長期,16 h進入穩定期,確定了菌株HA7-5、HJ57、HL64-1和HB49-2種子液種齡分別為12、10、12、16 h。

a-生長曲線;b-葡萄糖含量;c-乳酸含量圖5 4株高光學純度乳酸菌株發酵性能Fig.5 Fermentation properties of 4 high optical purity lactic acid bacteria strains

圖5-b和圖5-c為4株菌株在搖瓶發酵過程中的葡萄糖和乳酸分析結果。代謝曲線表明菌株HJ57和HL64-1前期產酸速率非?？?發酵24 h產酸分別達到30.56 g/L和62.03 g/L,隨后產酸無明顯增長,葡萄糖消耗亦非常緩慢,菌株HL64-1在24 h即可結束發酵,其平均產酸速率高達2.58 g/(L·h)。菌株HA7-5和HB49-2在發酵前48 h產酸速率和葡萄糖消耗均較快,隨后產酸速率變緩,發酵72 h乳酸產量分別達到71.83 g/L和73.14 g/L。4株菌株的光學純度分析和發酵結果見表4,光學純度均在99.8%(ee)以上。

表4 四株高光學純度菌株發酵結果Table 4 Fermentation results of 4 high optical purity lactic acid bacteria strains

對4株產高光純度乳酸菌株進行的初步搖瓶試驗表明,假腸膜明串珠菌HL64-1具有產酸速度快[2.58 g/(L· h)]、D-乳酸光學純度高99.88%(ee)的優點,在初始葡萄糖為100 g/L的條件下,發酵周期僅為24 h,延長發酵時間和補加葡萄糖,乳酸產量提高不顯著。德氏乳桿菌HB49-2產D-乳酸光學純度更高,達到99.97%(ee),雖然在產酸速率上無明顯優勢,但其持續產酸能力較強,通過延長發酵周期,可獲得較高的產量。屎腸球菌作為一種飼料中常用的益生菌,在畜牧生產中得到廣泛的應用,目前有關屎腸球菌生產L-乳酸的報道很少,且產量和光學純度均較低。屎腸球菌HA7-5的發酵特征與德氏乳桿菌HB49-2很相似,且具有光學純度高99.93%(ee)、產量高和生長速率較快的特點,可作為替代的益生菌株應用于飼料中,亦可為乳酸生產提供具有潛在工業化應用價值的優良菌株。格氏乳桿菌產高光學純度L-乳酸的研究亦鮮有報道。針對不同菌株的代謝特性,進一步改進發酵工藝條件,或通過誘變技術提高野生株的產量,為工業化生產提供高產量及高光學純度的菌株。

3 結論

自然界中含有豐富的產乳酸菌株資源,鑒于國內外可用于生產高光學純度L-乳酸和D-乳酸細菌較少,尤其是用于生產高光學純度D-乳酸菌種資源的稀缺,從自然界獲得目標菌株是一種有效途徑。本研究依據乳酸菌的生長特性,探索了一條從不同地區土壤、不同腐爛果實和腌漬酸菜中快速篩選、分離具有產高光學純度L體或D體乳酸菌株的方法,成功分離獲得了4株產高光學純度的乳酸菌株并進行了菌株鑒定。其中2株產L-乳酸菌株分別屬于屎腸球菌(Enterococcusfaecium)HA7-5和格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)HJ57,所產L-乳酸光學純度均達99.8%(ee)以上。另2株為產D-乳酸菌株,分別屬于假腸膜明串株菌(Leuconostocpseudomesenteroides)HL64-1和德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)HB49-2,D-乳酸光學純度亦達到99.8%(ee)以上。此外,假腸膜明串株菌HL64-1還具有產酸速率非?？斓奶攸c,其發酵周期僅24 h;德氏乳桿菌HB49-2菌株產酸較高,發酵72 h產酸達73.14 g/L。野生菌株通過培養基、發酵條件優化以及菌種改造或基因定向改造有望進一步提高產量,極具潛在的工業化應用價值。隨著高光學純度的L-乳酸、D-乳酸在PLA材料領域中的開發和應用,全球乳酸的需求量急劇增加。要滿足工業上制備PLA所需高光學純度的要求,篩選產高光學純度L-乳酸、D-乳酸及提高產量至關重要。其中利用基因工程手段構建的基因工程菌是一種有效手段,基因工程菌大多具有光學純度高的特點,但其培養營養條件較為苛刻,且底物利用范圍比較窄,相對于野生菌株粗獷的發酵條件,目前還難以形成產業化的競爭優勢。因此從自然界中篩選光學純度高、產量高、發酵周期短及底物利用范圍廣的乳酸菌株,以期為工業化生產提供更多的優良菌株來源。