4 ℃誘導解離對山羊乳酪蛋白膠束結構的影響

張杰龍,潘麗娜,彭小雨,李威,劉大松,周鵬*

1(江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇 無錫,214122)2(澳優乳業(中國)有限公司,湖南 長沙,410200)

羊乳具有易消化、低致敏的特點,常被加工為配方奶粉。近年來,隨著羊乳相關研究的深入,我國羊乳產業也迅速發展[1-2]。酪蛋白是羊乳中主要的蛋白組分,含量占總蛋白的70%,包含β-、αs1-、αs2-和κ-酪蛋白,比例依次為55%、6%、19%和20%[3]。αs-和β-酪蛋白是高度磷酸化的蛋白,可結合大量的Ca2+,使得山羊乳的鈣含量約高達134 mg/mL[4]。因此,酪蛋白除了能提供人體所需要的氨基酸,還可以協助提供Ca2+。相比易于消化的乳清蛋白,食用酪蛋白能為嬰兒提供一定的飽腹感。

乳中的酪蛋白主要以膠束的形式存在,還有少部分在乳清中以游離的形式存在。在膠束結構中,αs-和β-酪蛋白主要位于膠束內部,通過與膠體磷酸鈣相連接,形成膠束的骨架,而κ-酪蛋白位于膠束的表面,呈現柔韌的“毛發”,阻礙膠束之間的聚集。維持膠束結構的主要作用力是酪蛋白之間的疏水作用、以及酪蛋白磷酸絲氨酸與膠體磷酸鈣之間的離子相互作用[5]。酪蛋白和Ca2+在膠束與乳清中的分布處于動態平衡,受溫度和離子環境等因素影響,進而影響酪蛋白膠束的加工和應用特性[6]。

將牛乳冷卻并存儲在4 ℃,一部分膠體磷酸鈣會從酪蛋白膠束中解離;另外,由于低溫下酪蛋白之間疏水作用力的降低,一部分β-酪蛋白會從膠束中解離,剩余的β-酪蛋白與αs-酪蛋白通過磷酸絲氨酸殘基與膠體磷酸鈣緊密結合,維持膠束的骨架[7]。低溫下酪蛋白膠束的部分解離是可逆的,當溫度恢復至室溫,解離的組分可再次與膠束結合[8]。利用低溫下β-酪蛋白的解離特性,李珺珂等[9]在4 ℃使用30 nm孔徑的陶瓷膜對脫脂牛乳進行微濾處理,制備了富含β-酪蛋白和乳清蛋白的乳蛋白配料。目前,少有研究關注低溫誘導解離對酪蛋白膠束結構的影響,尤其未見羊乳酪蛋白膠束在低溫解離后結構變化的相關報道。

本研究以脫脂山羊乳為原料,采用液相色譜-質譜聯用、多角度靜態/動態光散射、冷凍透射電鏡、小角X射線散射等手段,研究4 ℃下膠束態酪蛋白和膠束鈣的解離、游離酪蛋白的磷酸化水平及解離后酪蛋白膠束的結構變化。本研究有助于進一步揭示羊乳酪蛋白膠束的結構特征,并為羊乳酪蛋白的分離提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山羊乳,杭州牧羊谷;PELLICON XL超濾膜包BIOMAX 10KDA,西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;300SB C8色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),美國安捷倫公司。

二硫蘇糖醇、三氟乙酸,美國Sigma公司;乙腈、甲醇,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、四甲基乙二胺、過硫酸銨、尿素、β-巰基乙醇、1,3-二[三(羥甲基)甲氨基]丙烷,上海生物工程股份有限公司;溴酚藍、NaOH、HCl、HNO3、高氯酸、乙醇、冰乙酸、三氯乙酸,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Optima L-100XP超速離心機,美國Beckman Coulter公司;Millipore LabscaleTFF超濾系統,德國Millipore公司;LYNX4000離心機、Talos F200C冷凍透射電鏡,美國Thermo Fisher公司;Protean Ⅱ xi Cell電泳儀、GelDox XR凝膠成像儀,美國Bio-rad公司;Waters Alliance e2695 Separations Module高效液相色譜分析儀、MALDI SYNAPT MS超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜聯用儀,美國Waters公司;AA-240原子吸收分光光度計,美國VARIAN公司;BI-200SM廣角動靜態激光散射儀、Dimension FastScan原子力顯微鏡,美國Buluke公司;F-2700熒光分光光度計,日本日立公司;SAXSpoint2.0小角X射線散射儀,奧地利Anton Paar公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 4 ℃下膠束態酪蛋白的逐次誘導解離及分離

樣品的制備流程如圖1所示,新鮮羊乳經離心脫脂后,在25 ℃、100 000×g離心1 h;取沉淀(即膠束)于羊乳在25 ℃的超濾液中剪切復溶,在4 ℃平衡24 h,然后在4 ℃、100 000×g離心1 h;取沉淀于羊乳在4 ℃的超濾液中進行剪切復溶,在4 ℃平衡24 h,然后在4 ℃、100 000×g離心1 h;重復上述4 ℃復溶、平衡和離心的操作步驟2次;收集上清液、復溶液和沉淀用于后續分析。

圖1 4 ℃下膠束態酪蛋白的逐次誘導解離及分離流程圖Fig.1 Flow chart for the sequential dissociation and separation of micellar casein at 4 ℃注:n值為1、2、3,分別對應4 ℃下膠束態酪蛋白解離及分離的次數。

1.3.2 SDS-PAGE分析

取山羊脫脂乳和1.3.1節中制備的上清液樣品,分別與樣品緩沖液按1∶1(體積比)混合,樣品緩沖液含0.125 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液,40 g/L十二烷基硫酸鈉和20%(體積分數)甘油,并加入5%(體積分數)β-巰基乙醇和0.5 g/L的溴酚藍,沸水浴5 min,待其冷卻后,取10 μL進行電泳上樣。電泳的分離膠和濃縮膠質量分數分別是4%和12%,每塊膠板的運行電流分別為15 mA和30 mA,膠板的染色和脫色參考LAEMMLI[10]的方法。

1.3.3 反相高效液相色譜分析

參考YUAN等[11]的方法,取山羊脫脂乳和1.3.1節中制備的上清液樣品,分別與pH 7緩沖液按1∶1(體積比)混合,緩沖液含0.1 mol/L 1,3-二[三(羥甲基)甲氨基]丙烷, 8 mol/L尿素,20 mmol/L二硫蘇糖醇和13 g/L二水合檸檬酸三鈉,混合均勻后過0.45 μm的有機膜。選用C8色譜柱,柱溫40 ℃,流速0.8 mL/min,流動相A和流動相B為乙腈、水、三氟乙酸的混合,體積比分別為50∶950∶1和800∶200∶1,檢測波長220 nm,色譜積分采用Empower軟件。

1.3.4 電感耦合等離子體質譜分析(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)

參考YANG等[12]的方法,取山羊脫脂乳、及1.3.1節中制備的上清液和復溶液樣品各1 mL,置于消解管中,加入10 mL的HNO3溶液和2 mL的高氯酸,進行微波消解,消解結束后將消解液定容至50 mL, 然后用ICP-MS測量。脫脂乳或復溶液中的鈣減去對應上清液中的鈣,即為膠束鈣含量。

1.3.5 尿素電泳(Urea-PAGE)分析

參考BANSAL等[13]的方法,取山羊脫脂乳及1.3.1節中制備的上清液,采用1 mol/L HCl溶液調節pH值至4.3,然后在5 000×g下離心30 min。離心的沉淀用1.3.3節中的緩沖液溶解,然后與pH 7.6樣品緩沖液按1∶1(體積比)混合,樣品緩沖液含0.06 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液,8 mol/L尿素溶液,加入體積分數5% β-巰基乙醇和0.5 g/L溴酚藍。濃縮膠為40 g/L丙烯酰胺,分離膠為100 g/L丙烯酰胺,運行電壓分別為280 V和300 V,上樣量30 μL。

1.3.6 液相色譜-質譜聯用分析(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)

為檢測解離β-酪蛋白的磷酸基團數,參考MIRANDA等[14]的方法,將1.3.5節中酸沉后的溶解液過0.45 μm有機膜, 采用LC-MS進行分析。采用BEH C4色譜柱(100 mm×2.1 mm),流動相A和B分別是0.1%(體積分數)的甲酸和純乙腈。采用陽離子模式, 掃描范圍為500～300m/z, 掃描時間1 s,間隔0.02 s,錐孔電壓40 V,碰撞能量6 eV。

1.3.7 多角度靜態/動態光散射分析

參考YANG等[12]的方法,光散射測量在25 ℃進行。取1.3.1節中制備的復溶液樣品,用水稀釋成4個濃度,之后進行靜態光測量, 檢測角度范圍為30°～120°, 間隔10°, 折光指數增量0.189 mg/mL, 靜態光的數據使用ALV-Static Fit軟件進行Berry擬合, 由曲線中濃度和角度外推至0的斜率和截距獲得膠束的均方回轉半徑(Rg)和重均分子質量(Mw)。動態光測量在90°進行, 顆粒折射率為1.57,獲得流體力學半徑(Rh)。Rg是從分子的核心到分子中每個質量元素的質量加權平均距離,Rh等于與被觀察粒子以相同速度擴散的等效硬球的半徑。

1.3.8 膠束水合率測定

參考YANG等[12]的方法,取1.3.1節中制備的沉淀,置于105 ℃干燥7 h, 記錄烘干前后樣品的質量,兩者質量之差除以烘干后樣品的質量即為膠束水合率。

1.3.9 內源熒光光譜分析

參考WU等[15]的方法,取1.3.1節中制備的復溶液樣品,采用常溫超濾液稀釋10倍后置于石英池中進行熒光光譜分析,溫度控制25 ℃,激發發射狹縫控制在5 nm,激發波長280 nm,發射波長290～450 nm,掃描速度60 nm/min。

1.3.10 冷凍透射電鏡(cryo-transmission electron microscopy,Cryo-TEM)分析

參考ZHANG等[16]的方法,用鑷子將已親水化的銅網置入冷凍制樣機FEI Vitrobot裝置中,取1.3.1節中制備的復溶液3 μL,置于銅網上,用濾紙吸走多余樣品溶液后,將銅網迅速投入至液態乙烷中進行速凍,然后在Talos F200C透射電鏡下進行觀察。

1.3.11 原子力顯微鏡(atomic force microscope,AFM)分析

參考FREITAS等[17]的方法,取1.3.1節中制備的復溶液,滴加到干凈的云母片上,待其干燥后,在接觸模式下觀察膠束的表面形貌,掃描面積為3 μm×3 μm。

1.3.12 小角X射線散射(small angle X-ray scattering,SAXS)分析

參考MOITZI等[18]的方法,取1.3.1節中制備的復溶液凍干成粉末,將復溶液或其凍干粉置于帶有矩形孔(20 mm×4 mm×2 mm)的樣品臺中,兩側以膠帶密封,之后進行SAXS分析,設置樣品與檢測器的距離600 mm,在真空條件進行1 h的散射分析,采用SAXS analysis 4.00.046軟件將獲得的二維數據轉化為一維數據。

1.4 數據分析

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析,采用Duncan檢驗,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 25 ℃和4 ℃下游離酪蛋白的含量

在乳中,酪蛋白和鈣在乳清與膠束之間的分布處于動態平衡,且受溫度的影響。山羊脫脂乳于25 ℃超速離心,將游離和膠束部分分開;取膠束部分復溶于脫脂乳在25 ℃的超濾液,使膠束所處的離子環境保持不變,于4 ℃平衡后超速離心,將游離和膠束部分分開;取膠束部分復溶于脫脂乳在4 ℃的超濾液,使膠束所處的離子環境保持不變,于4 ℃平衡后超速離心,將游離和膠束部分分開;重復上述4 ℃復溶、平衡和離心的操作步驟2次,以實現4 ℃膠束態酪蛋白最大程度的解離。

脫脂乳在25 ℃和4 ℃下游離酪蛋白的組成如圖2-a所示。25 ℃游離蛋白組分主要包括β-酪蛋白、κ-酪蛋白以及乳清蛋白,β-酪蛋白的條帶強度略高于κ-酪蛋白,乳清蛋白的條帶強度與脫脂乳相比無顯著差異,表明常溫超速離心實現了乳清蛋白與膠束相酪蛋白的分離。在第1次沉淀復溶、4 ℃平衡后超離心的上清液中,β-酪蛋白是主要的游離蛋白,β-酪蛋白的條帶強度顯著高于其余蛋白的條帶, 也高于常溫下游離的β-酪蛋白條帶, 同時還存在少量的κ-酪蛋白和乳清蛋白, 但相對于25 ℃超離心上清液中的κ-酪蛋白和乳清蛋白,條帶強度顯著降低。第2次沉淀復溶、4 ℃平衡后超離心的上清液中, β-酪蛋白仍是游離酪蛋白中的主要組分,相比于第1次超離心的上清液,各游離蛋白組分的條帶強度均顯著降低。第3次沉淀復溶、4 ℃平衡后超離心的上清液中, 幾乎沒有蛋白再解離出。

a-游離酪蛋白的組成;b-總酪蛋白;c-αs-酪蛋白;d-β-酪蛋白;e-κ-酪蛋白圖2 25 ℃和4 ℃下游離蛋白的SDS-PAGE圖與含量Fig.2 SDS-PAGE patterns and contents of free caseins at 25 and 4 ℃注:SM-脫脂乳;不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)(下同)。

25 ℃和4 ℃下游離酪蛋白的相對含量如圖2-b～圖2-d所示。與25 ℃下乳中的游離酪蛋白相比,第1次沉淀復溶液處于4 ℃下游離的αs和κ-酪蛋白含量更低,而游離的總酪蛋白和β-酪蛋白的含量更高。隨著沉淀(即膠束)復溶次數的增加,4 ℃下游離的總酪蛋白、αs、β、κ-酪蛋白含量均顯著地逐漸降低,游離的總酪蛋含量從17.0%降低至0.4%,其中αs-酪蛋白含量從3.1%降低至0.2%,β-酪蛋白含量從31.5%降低至0.5%,κ-酪蛋白含量從9.9%降低至0.2%。山羊膠束態酪蛋白最多能解離出36.5%的總酪蛋白,其中αs-酪蛋白解離11.8%,β-酪蛋白解離60.4%,κ-酪蛋白解離31.4%。邵言蹊等[19]將山羊乳直接置于4 ℃平衡120 min,發現10.1%的αs-酪蛋白、36.5%的β-酪蛋白、25.5%的κ-酪蛋白從膠束中解離,也表明β-酪蛋白具有最大的解離率。山羊酪蛋白膠束中各蛋白解離的難易程度依次為β-酪蛋白>κ-酪蛋白>αs-酪蛋白。由于低溫導致的疏水作用力的減弱,β-酪蛋白大部分從膠束中解離,而αS-酪蛋白的磷酸基團更多,有更高的鈣結合能力,能與膠束中的磷酸鈣維持更強的離子相互作用力,與膠束結合地更加緊密,因此更難從膠束中解離出[5]。

2次低溫解離基本實現了膠束中β-酪蛋白最大程度的解離,膠束達到該溫度下的穩定狀態。因此,本研究選用膠束M-25的復溶液和膠束M-4-2的復溶液,以研究膠束態酪蛋白解離前后的結構變化。

2.2 25 ℃和4 ℃下游離鈣的含量

25 ℃和4 ℃下游離鈣含量如圖3所示。山羊脫脂乳25 ℃游離鈣的含量為38.7 mg/100 mL,占總鈣含量的28%,而第1次復溶的沉淀在4 ℃下游離鈣的含量為51.0 mg/100 mL,高于25 ℃下游離鈣的含量,反映了低溫下鈣的解離。LAW[20]也報道了脫脂牛乳4 ℃和20 ℃下游離鈣含量,20 ℃牛乳的游離鈣含量為44.8 mg/100 mL,占總鈣含量的33%,4 ℃牛乳的游離鈣含量為52.0 mg/100 mL。膠束的存在使得牛羊乳能夠攜帶較多的鈣,滿足嬰兒對鈣的需求,多數鈣以無定形納米簇的膠體磷酸鈣形式分布在膠束基質中。低溫會導致鈣的飽和溶解度的增加,使鈣在膠束和上清液中的分配發生改變,更多的膠束鈣轉變成游離鈣的形式。邵言蹊等[19]比較了不同平衡溫度對山羊乳中膠束鈣解離的影響,隨著平衡溫度從25 ℃降低至4 ℃,膠束鈣的占比呈現出線性降低的趨勢,因此推測溫度進一步降低,膠束鈣占比將進一步降低,鑒于4 ℃是乳品加工和貯藏中常用的低溫溫度以及工業上進一步降低溫度所帶來的高成本,本研究采用了4 ℃作為代表性的低溫溫度。LIU等[21]將牛乳從40 ℃冷卻到10 ℃,發現pH對溫度的響應在短時間內即可完成,表明礦物鹽在膠束和乳清中的分布快速達到了平衡。另一項研究將牛乳從4 ℃加熱至90 ℃,同樣發現可溶性鈣在不同溫度下的分布可快速(<2 min)達到平衡[22]。在膠束結構中,一部分β-酪蛋白參與膠束骨架結構形成,通過其所帶的磷酸基團與膠體磷酸鈣相互結合,膠體磷酸鈣的增溶會導致部分參與骨架結構形成的β-酪蛋白從膠束中解離出[20]。隨著沉淀復溶次數的增加,游離鈣含量逐漸降低至40.2 mg/100 mL。

圖3 25 ℃和4 ℃下游離鈣的含量Fig.3 Contents of free calcium at 25 and 4 ℃

2.3 25 ℃和4 ℃下游離酪蛋白的磷酸化水平

脫脂乳, 25 ℃和4 ℃下游離酪蛋白的Urea-PAGE如圖4-a所示。尿素的添加使得蛋白分子變性,蛋白在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速率受電荷量和分子質量的影響。酪蛋白所攜帶的磷酸基團越多,其電泳遷移率越大,αs-酪蛋白比β-酪蛋白有更高的電泳遷移率[23]。相比于脫脂乳,25 ℃和4 ℃游離β-酪蛋白對應的條帶整體電泳遷移率更低,且4 ℃游離β-酪蛋白對應的條帶整體電泳遷移率高于25 ℃下游離的β-酪蛋白,4 ℃下游離β-酪蛋白對應的主要條帶與脫脂乳一致,為高電泳遷移率的條帶。

a-Urea-PAGE;b、c、d-脫脂乳,25 ℃和4 ℃下游離酪蛋白的去卷積質譜圖圖4 25 ℃和4 ℃下游離酪蛋白的Urea-PAGE圖與去卷積質譜圖Fig.4 Urea-PAGE patterns and deconvoluted mass spectrums of free caseins at 25 and 4 ℃

通過LC-MS可以進一步鑒定游離β-酪蛋白的磷酸基團個數(圖4-b～圖4-d)。β-酪蛋白每減少一個磷酸基團,即減少一個HPO3-,質量數會減少80 Da, 通過比對Uniprot數據庫,可以鑒定出β-酪蛋白的磷酸基團數。在山羊脫脂乳中,β-酪蛋白的分子質量為23 793、23 873 Da,分別對應含有5P和6P的β-酪蛋白,另外,還存在變異體β-酪蛋白,分子質量為23 661、23 741、23 820 Da,分別對應含有3P、4P和5P的變異體β-酪蛋白。在25 ℃上清液中,新鑒定到含有1P和2P的變異體β-酪蛋白,對應的分子質量為23 500、23 580 Da,β-酪蛋白的磷酸化形式以2P、3P和4P的變異體β-酪蛋白為主。4 ℃上清液中鑒定到的β-酪蛋白及變異體的分子質量與25 ℃一致,但磷酸化形式以2P和4P的變異體β-酪蛋白為主。

Urea-Page及LC-MS的結果表明,常溫下低磷酸化程度的β-酪蛋白,主要是含有2P、3P和4P的變異體β-酪蛋白,更難維持在膠束內部,而主要是以游離的單體存在。磷酸化程度較低的β-酪蛋白可能與膠體磷酸鈣形成較少的鈣橋,因而與膠束的相互作用力較弱,更易移動至乳清相中。低溫下,膠體磷酸鈣的解離,導致了更多的高磷酸化程度的、攜帶5P和6P的β-酪蛋白從膠束中解離出。

2.4 4 ℃誘導解離對酪蛋白膠束鈣含量的影響

4 ℃誘導解離對膠束鈣相對含量、膠束中鈣與酪蛋白摩爾比的影響如圖5所示。4 ℃下膠體磷酸鈣的增溶導致了酪蛋白膠束鈣含量的減小,膠束鈣相對含量從72.0%減少至50.2%,膠束中鈣與酪蛋白摩爾比從21.8減少至19.4。邵言蹊等[19]將山羊乳直接置于4 ℃下平衡120 min,發現膠束鈣相對含量從71.1%降低至63.2%,本研究結果基本相符。鈣在膠束的形成、結構完整性維持方面具有重要作用,能通過離子相互作用將酪蛋白分子相連接,同時中和酪蛋白分子上磷酸絲氨酸基團的負電荷,使酪蛋白能在疏水相互作用下相互連接[24]。低溫導致了膠束鈣含量的減小,從而打破膠束內部作用力的平衡。

圖5 25 ℃下及4 ℃誘導解離后酪蛋白膠束的鈣含量Fig.5 Calcium contents of casein micelles at 25 ℃ and after the dissociation at 4 ℃注:同種柱子上不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)(下同)。

2.5 4 ℃誘導解離對酪蛋膠束粒徑的影響

4 ℃誘導解離前后膠束的粒徑和摩爾質量如圖6所示,低溫誘導解離導致了山羊酪蛋白膠束的均方回轉半徑從145.5 nm減小到133.5 nm,流體力學半徑從105.7 nm減小到85.8 nm,Mw從10.8×108g/mol減小到6.6×108g/mol。在高分子在溶液中的構象研究方面,形狀因子Rg/Rh常用于判斷高分子鏈的構象,酪蛋白膠束屬于線性柔性的高斯線團[25]。膠束形狀因子值的改變側面反映了膠束的蓬松狀態。4 ℃誘導解離導致了山羊酪蛋白膠束形狀因子的增加,表明膠束在低溫解離之后變得更加蓬松。YANG等[12]研究了4 ℃誘導解離對人乳酪蛋白膠束結構的影響,在均方回轉半徑、重均分子質量和Rg/Rh上與羊乳酪蛋白膠束表現相同,都是呈下降趨勢,而流體力學半徑呈現增加趨勢,這可能是由于人乳膠束與羊乳膠束組成和酪蛋白磷酸化程度不同,導致膠束內部離子相互作用、組分分布不同所導致的。

a、b-25、4 ℃誘導解離后酪蛋白膠束的Berry擬合曲線;c-方回轉半徑和重均分子量;d-流體力學半徑;e-平均流體力學半徑;f-形狀因子圖6 25 ℃下及4 ℃誘導解離后酪蛋白膠束的粒徑,Berry擬合曲線,均方回轉半徑和重均分子質量,流體力學半徑分布,平均流體力學半徑,形狀因子Fig.6 Particle size of casein micelles at 25 ℃ and after the dissociation at 4 ℃ Berry plots, mean-square radius of gyration and weight-average molecular weight, hydrodynamic radius distribution, average hydrodynamic radius, shape factor

2.6 4 ℃誘導解離對酪蛋膠束水合狀態的影響

酪蛋白膠束是高度水合、海綿狀的膠體顆粒,只有15%的水與蛋白質結合,其余的水被物理截留在膠束中[26]。4 ℃誘導解離導致了山羊酪蛋白膠束的水合率從2.0 g/g干膠束增加到2.9 g/g干膠束(圖7-a)。圖7-b顯示了4 ℃解離前后膠束內源熒光光譜的改變。低溫誘導解離導致了膠束內源熒光強度的增加,而最大發射波長未發生變化。水合率和內源熒光強度的增加都反映了膠束在低溫誘導解離后發生溶脹,結構變得更加蓬松,與光散射測得的形狀因子一致,因此,物理空間上可以束縛更多的水。楊同香等[27]研究了離子強度對水牛乳酪蛋白膠束內源熒光強度的影響,當離子強度從0.01 mol/L增加到0.05 mol/L時,同樣觀察到膠束內源熒光強度增加,而熒光的最大發射波長未變化,表明膠束內部結構發生了溶脹。

a-水合率;b-熒光光譜圖7 25 ℃下及4 ℃誘導解離后酪蛋白膠束的水合率與熒光光譜Fig.7 Hydration rate and fluorescence spectra of casein micelles at 25 ℃ and after the dissociation at 4 ℃

2.7 4 ℃誘導解離對酪蛋膠束微觀形貌和內部結構的影響

4 ℃誘導解離前后膠束的微觀形貌如圖8所示,冷凍透射電鏡和原子力顯微鏡的圖像表明膠束在4 ℃誘導解離前后均是完整的光滑球形,同時觀察到酪蛋白膠束在解離之后尺寸變小,與光散射的數據一致,另外還能在冷凍透射電鏡的圖像上,觀察到膠束的電子密度減弱,進一步表明膠束在低溫誘導解離后呈現更加蓬松的狀態。

a-Cryo-TEM圖;b-AFM圖圖8 25 ℃下及4 ℃誘導解離后酪蛋白膠束Cryo-TEM圖與AFM圖Fig.8 Cryo-TEM and AFM micrographs of casein micelles at 25 ℃ and after the dissociation at 4 ℃

4 ℃誘導解離前后羊乳膠束的復溶液和粉體SAXS曲線如圖9所示。復溶液SAXS曲線在0.035 ?-1和0.07 ?-1附近觀察到2個微弱的肩峰,將曲線分為3個特征區域。小于0.01 ?-1的低Q區,對應于酪蛋白膠束的界面散射;中Q區0.03 ?-1附近的肩峰對應于膠束內部膠體磷酸鈣之間的距離;高Q區0.07 ?-1左右的肩峰,對應于膠束內部的酪蛋白局部非均一性分布[11]。4 ℃誘導解離后山羊膠束低Q區的散射無顯著變化,這與電鏡觀測到的膠束低溫解離前后均呈現為球形的結果相一致;4 ℃誘導解離導致了中Q區的肩峰變小,這與低溫解離后膠束鈣含量減少的結果相一致;4 ℃誘導解離還導致了高Q區的肩峰變小,表面低溫誘導解離后膠束內部組分的分布發生了重排,酪蛋白空間分布的局部非均一性降低。粉體SAXS曲線中Q區0.035 ?-1的肩峰更加明顯,這是因為相比液體基質,氣體基質使得散射對比度增加,還因為單位體積的粉體中有效的散射粒子數更多。相比復溶液,粉體SAXS曲線中Q區的肩峰出峰位置向右發生了偏移,這是因為干燥導致了基質的收縮,使得膠體磷酸鈣之間的距離縮短。同樣4 ℃誘導解離導致了粉體SAXS曲線中Q區的肩峰變小。

a-復溶液;b-粉體圖9 25 ℃下及4 ℃誘導解離后酪蛋白膠束的SAXS曲線Fig.9 SAXS profiles of casein micelles at 25 ℃ and after the dissociation at 4 ℃

3 結論

低溫下酪蛋白之間疏水作用的減弱以及乳清中鈣溶解度的增加,使得山羊乳酪蛋白膠束中酪蛋白(主要為β-酪蛋白)和鈣發生部分解離,超速離心和超濾液復溶2次后,膠束態酪蛋白的解離達到平衡,總酪蛋白的解離率達36.5%,其中αs-酪蛋白解離11.8%,β-酪蛋白解離60.4%,κ-酪蛋解離31.4%。由于磷酸化程度較低的β-酪蛋白與膠束鈣的相互作用力較弱,常溫下游離的β-酪蛋白以低磷酸化程度的變異體β-酪蛋白為主;低溫下由于膠束鈣的解離、鈣離子橋連作用的破壞,導致更多的高磷酸化程度的β-酪蛋白從膠束中解離。低溫誘導解離后膠束尺寸變小,但膠束仍然保持初始的完整球狀外貌。低溫誘導解離后膠束鈣含量減小,導致膠束內部酪蛋白分布的不均勻性減小,膠束變得更加松散,能束縛更多的水,并且在TEM下觀測到內部的電子密度降低。本研究結果有助于推進對羊乳酪蛋白膠束結構特征的認識,為羊乳酪蛋白配料的分離提供理論參考。