蘋果果膠的理化特性、抗氧化及降血脂作用研究

盧泳強,周朝曦,張麗麗,俞永婷,娜迪熱木·肖克拉提,王新玲,叢媛媛

(新疆醫科大學 藥學院,新疆 烏魯木齊,830011)

果膠是廣泛存在于植物細胞壁中重要的水溶性膳食多糖,通常是以聚半乳糖醛酸(galacturonic acid,GalA)結構為主的復雜天然生物大分子,同時具有高度結構多樣性[1],其結構的差異性主要體現在糖醛酸含量、酯化度(degree of esterfication,DE)及中性糖的組成上。蘋果(Maluspumila)為薔薇科蘋果屬落葉喬木的果實,因營養豐富而利于食用和保健。中醫認為蘋果有生津、潤肺、醒酒、止瀉等功效,現代研究還表明蘋果具有抗癌作用[2]。蘋果果膠(Maluspumilapectin,MP)作為蘋果中重要的營養物質之一,作為凝膠劑、穩定劑、乳化劑及增稠劑等廣泛應用于食品生產中[3],還具有抗氧化、抗菌等生理活性[4]。

目前,有關MP的研究大多是基于實驗室條件下的酸提醇沉提取物,其制備工藝和質量控制尚不及商品化MP,而商品化MP亦缺乏理化特性的表征,除作為食品添加劑應用外,是否具有其他生物活性還有待于進一步研究?；诖?本文以商品化MP為研究對象,分析其理化特性,通過體外抗氧化實驗評價MP的抗氧化能力;并利用高脂飲食誘導建立高脂血癥大鼠模型,從生化指標和肝臟病理變化初步探討MP降血脂作用,以期發掘MP結構與其功能活性的關系,拓展MP在生物醫藥方面的應用范圍,為開發調節機體血脂平衡的天然功能性產品提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MP購于上海源葉生物科技有限公司,批號:Z27F8X29788,含量≥65.8%,樣品純度滿足本研究需求。

36只雄性SD大鼠,SPF級,6～8周齡,體重180～220 g,購于新疆醫科大學動物實驗中心,生產許可證號:SCXK(新)2018-0002。本研究過程中涉及實驗動物的處理均符合新疆醫科大學倫理委員會要求(批準文號:IACUC-20210405-1)。PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮),上海麥克林生化科技有限公司;單糖標準品甘露糖(mannose,Man)、鼠李糖(rhamnose,Rha)、葡萄糖(glucose,Glu)、半乳糖(galactose,Gal)、半乳糖醛酸(galacturonic acid,GalA)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GluA)、阿拉伯糖(arabinose,Ara),北京博奧拓達科技有限公司;乙腈(色譜純),美國sigma公司;甲醇(色譜純),美國Fisher公司;辛伐他汀片,山東鑫齊藥業有限公司(批號:20230214);甘油三酯(total triglyceride,TG)測定試劑盒、總膽固醇(total cholesterol,TC)測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)測定試劑盒,南京建成生物工程研究所;還原性谷胱甘肽(glutathione,GSH)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)檢測試劑盒,北京索萊寶;其他化學試劑均為分析純。

高脂飼料[維持底料49%(質量分數,下同)、膽固醇1.5%、膽酸鈉0.5%、果糖20%、維生素混合物2%、磷酸氫鈣2%、酪蛋白12%、豬油10%、麻油3%],北京博愛港生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

XPR分析天平,上海梅特勒-托利多儀器有限公司;UV2700紫外-可見分光光度計、IR-Prestige21紅外光譜儀,日本島津;Multiskan GO全波長酶標儀,賽默飛世爾(上海)儀器有限公司;Waters2695- 2998高效液相色譜儀,沃特世科技(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分子質量測定

采用高效凝膠滲透色譜法測定果膠樣品分子質量分布[5]。色譜條件:RI示差折光檢測器;TSK-gel G-5000 PWXL色譜柱(7.5 mm×30 cm);流動相:超純水;流速0.6 mL/min;柱溫30 ℃,進樣量10 μL。精密稱取MP樣品4.0 mg加入2 mL去離子水溶解,經0.45 μm水系微孔濾膜過濾后注入高效凝膠滲透色譜柱分析。同時,利用系列不同分子質量(5、10、40、150、410、2 000 kDa)的Dextran T按上述方法處理,以保留時間為縱坐標,分子質量的對數為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.2 酯化度測定

精密稱取MP 100 mg,乙醇潤濕后定容至100 mL。充分溶解后滴加1%酚酞指示劑2滴,用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至粉紅色,30 s內不變色,記錄消耗NaOH的體積V1;然后向溶液中加入20 mL 0.5 mol/L NaOH溶液,室溫下攪拌靜置15 min后加入20 mL 0.5 mol/L HCl溶液,再繼續用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至粉紅色,30 s內不變色,并記錄消耗NaOH溶液的體積V2[6]。按公式(1)計算酯化度:

(1)

1.3.3 糖醛酸含量測定

糖醛酸含量測定采用間羥基聯苯法[7]。分別取標準半乳糖醛酸液(100 μg/mL)0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL于具塞試管中,去離子水補加至0.25 mL。在冰水浴中預冷后加入1.5 mL四硼酸鈉-硫酸試液。振搖混勻,沸水浴加熱5 min,冰水浴冷卻至室溫后,加入25 μL 1.5 g/L間羥基聯苯試液?；靹蚝?在520 nm處測定其吸光度,并繪制標準曲線;另取100 μg/mL的樣品0.25 mL按上述方法測定,平行測定3次,根據標準曲線,計算糖醛酸的含量,結果取平均值。按公式(2)計算糖醛酸含量:

(2)

式中:W,樣品中糖醛酸含量,%;m,樣品中半乳糖醛酸質量,μg;M,樣品的質量,μg。

1.3.4 紅外光譜分析

精密稱取1.0 mg MP與100 mg KBr混合研磨壓片,在4 000～400 cm-1進行紅外光譜掃描,觀察峰譜情況[8]。

1.3.5 單糖組成分析

采用PMP柱前衍生法測定MP樣品中的單糖組成[9]。精密稱取MP樣品4.0 mg于安瓿瓶中,加入2 mL三氟乙酸(2 mol/L),充N2后封管,在110 ℃下水解6 h。冷卻至室溫,反復加入無水乙醇,70 ℃水浴蒸除三氟乙酸,加入去離子水1 mL并定容至10 mL。取果膠水解液200 μL加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液和0.3 mol/L NaOH溶液各200 μL,混勻,在70 ℃水浴鍋中反應1.0 h,再加入200 μL 0.3 mol/L HCl溶液,混勻,用CHCl3萃取3次,每次1 mL,棄去下層有機相,保留上層水相,經0.22 μm水系微孔濾膜過濾后注入進樣小瓶,得供試品溶液。移取混合單糖標準品200 μL,衍生化操作,HPLC分析。

色譜條件:YMC-Pack ODS-A柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈(A)-0.1 mol/L乙酸銨溶液(B),檢測波長250 nm;流速1.0 mL/min;進樣量10 μL;柱溫30 ℃;梯度洗脫,洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.3.6 體外抗氧化能力測定

將MP溶于去離子水,配制不同濃度的溶液備用。以相同濃度的維生素C作陽性對照,測定MP對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基的清除能力,并測定總抗氧化能力和還原能力[10-12]。

1.3.7 動物分組及給藥

36只雄性SD大鼠,適應性喂養1周。將大鼠隨機分為6組,每組6只,分別為正常組(NFD)、高脂飲食組(HFD)、辛伐他汀陽性組(PG)、低劑量MP(L-MP)、中劑量MP(M-MP)、高劑量MP(H-MP)。NFD組喂食基礎飼料,HFD、PG、L-MP、M-MP、H-MP組喂食高脂飼料,自由進食、飲水。高脂飲食2周后開始給藥(辛伐他汀于第8周開始給藥),連續喂養13 周。實驗動物分組設計見表2。

表2 實驗動物分組設計Table 2 Experimental design and animal grouping

表3 蘋果果膠的相對分子質量及分布Table 3 Relative molecular weight and distribution of MP

1.3.8 大鼠體重、肝重及附睪脂肪質量的測定

末次給藥后,禁食12 h,稱量各組大鼠體質量,腹腔注射5%水合氯醛麻醉大鼠,經腹主動脈取血,分離各組大鼠肝臟和附睪脂肪組織,并準確稱量大鼠肝濕重變化和附睪脂肪組織質量。

1.3.9 大鼠血清血脂含量的測定

大鼠麻醉后,經腹主動脈取血,3 500 r/min離心15 min,收集血清。參照試劑盒說明書測定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量。

1.3.10 大鼠肝組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色

大鼠肝臟于10%中性福爾馬林中固定1周后,采用HE染色觀察[13]。

1.3.11 大鼠血清中抗氧化指標的測定

大鼠血清中GSH、SOD、MDA、T-AOC水平依據試劑盒說明書測定。

1.4 數據處理

采用Excel 2019、SPSS 26.0、GraphPad Prism 8軟件進行數據處理和繪圖,采用ANOVA進行差異顯著性分析,數據以平均值±標準差表示,P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 果膠分子質量分布

由圖1可知,MP分子質量分布不均勻,呈現寬分布現象。MP由一個弱峰、一個寬峰和一個尖峰組成,說明本實驗用MP分子質量主要集中在2～45 kDa,主要由分子質量為1.44×107、4.21×104、2.14×103Da的3個組分組成,分別占MP總分子的4.15%、47.46%和48.39%。有研究表明,低分子果膠更容易被吸收和利用[14],本實驗所用MP的生物利用度與分子質量的相關性有待后續深入研究。

圖1 蘋果果膠分子質量分布Fig.1 Molecular weight distribution of MP注:1～3為MP組分形成峰。

2.2 酯化度和糖醛酸含量

通常將酯化度<50%的果膠劃分為低酯果膠,本研究實際測得MP的酯化度為13.43%,與商品說明書標注的低酯化度一致。LUO等[15]發現通過金屬離子沉淀法獲取的MP表現出低酯化度(12.5%),與本文研究結果一致。由圖2可知,半乳糖醛酸質量濃度在20～100 μg/mL線性關系良好,測得MP中糖醛酸含量為66.51%,同時測得其pH值為4.81,也說明MP為酸性多糖。

圖2 半乳糖醛酸標準曲線Fig.2 Standard curve of galacturonic acid

2.3 紅外光譜分析

MP紅外光譜如圖3所示,在3 406.47 cm-1處較寬的吸收峰和2 917.91 cm-1處相對較弱的吸收峰分別是O—H和C—H的伸縮振動峰。1 625.73 cm-1存在糖醛酸COO—的不對稱振動峰,再次證明MP中含有糖醛酸。有人將1 740 cm-1處的峰面積與1 740 cm-1和1 625 cm-1總面積之比定義為酯化度[16],在1 740 cm-1處吸收峰較弱,表明其酯化度較小,這與之前酯化度的滴定結果相一致。1 373.63 cm-1處吸收峰由C—H變形振動所引起。1 153.24 cm-1和1 115.37 cm-1吸收峰為C—O—C的伸縮振動峰,表明樣品中存在吡喃糖環。在930.57 cm-1的吸收峰涉及D-吡喃糖基的吸收。

圖3 蘋果果膠紅外光譜圖Fig.3 Infrared radiation spectra of MP

2.4 單糖組成分析

圖4為單糖標準品和MP的HPLC圖。根據標準單糖的保留時間確定MP多糖中的單糖種類,MP由5種單糖組成,分別是Rha、GalA、Glu、Gal、Ara,通過計算,各單糖的含量為44.04、673.80、37.96、81.94、57.49 μg/mg(表4),摩爾比為0.60∶9.35∶0.58∶1.14∶0.96。從單糖組成來看,GalA含量最高(≥65%),與2.2節測定結果一致,而Rha、Gal、Glu、Ara是MP中主要的中性糖。通常認為果膠主要由HG和RG-Ⅰ區域構成,HG區主要由GalA組成,而RG-Ⅰ區的主鏈由Rha和Gal組成[17]。因此,Rha/GalA的比值(0.05～1)可以用來反映果膠中RG-Ⅰ區結構的多少,比值越接近于1,果膠中RG-Ⅰ區結構占比越多[18]。(Ara+Gal)/Rha的比值則反映了RG-Ⅰ區分支度的情況[19]。本實驗中Rha/GalA與(Ara+Gal)/Rha比值分別為0.06和3.72,說明MP中含有較多的RG-Ⅰ結構,并具有較好的分支度。

1-甘露糖;2-鼠李糖;3-葡萄糖醛酸;4-半乳糖醛酸;5-葡萄糖;6-半乳糖;7-阿拉伯糖a-標準品;b-MP圖4 蘋果果膠多糖單糖組成Fig.4 Composition of monosaccharides from the MP

表4 蘋果果膠對大鼠體重、肝重及附睪脂肪質量的影響(n=6) 單位:gTable 4 Effects of MP on body weight, liver weight and epididymal fat weight in rats (n=6)

2.5 體外抗氧化能力分析

2.5.1 DPPH自由基清除能力

圖5顯示不同濃度的MP對DPPH自由基的清除率,并以維生素C作陽性對照。MP對DPPH自由基具有良好的清除作用,隨著MP溶液濃度的增加,清除自由基的作用越強。當質量濃度達到10 mg/mL時,MP對DPPH自由基清除效果為70.05%,仍低于維生素C(95.05%)。據報道,具有更多的HG型結構和高GalA含量具有更高的抗氧化能力,其原因可能是較高的GalA含量增加了羥基和羧基的比例,同時又表明果膠中的RG-Ⅰ區比例越高,其抗氧化活性隨之會相對降低[20]。

圖5 蘋果果膠對DPPH自由基的清除率Fig.5 DPPH radicals scavenging rate on MP

2.5.2 ABTS陽離子自由基清除

圖6顯示不同濃度的MP溶液對ABTS陽離子自由基的清除率,維生素C為陽性對照。在1～10 mg/mL,其清除效果與濃度呈正相關,具有濃度依賴性。當質量濃度達到10 mg/mL時,MP對ABTS陽離子自由基清除效果為76.89%,低于維生素C(98.09%)。

圖6 蘋果果膠對ABTS自由基的清除率Fig.6 ABTS cationic radical scavenging rate on MP

2.5.3 羥自由基的清除

圖7顯示不同濃度的MP溶液對羥自由基的清除率,陽性對照維生素C。MP溶液對羥自由基具有一定的清除作用。隨著MP溶液濃度增大,羥自由基清除率呈持續上升的趨勢。當MP質量濃度為10 mg/mL時,其清除率為49.96%,但清除效果不如維生素C(99.5%)。

圖7 蘋果果膠對羥自由基的清除率Fig.7 ·OH scavenging rate on MP

如圖8所示,為不同濃度的MP溶液的總抗氧化能力和還原能力。隨著MP溶液濃度的增加,其吸光度也隨之增大;當MP質量濃度為10 mg/mL時,表征總抗氧化能力和還原能力的OD值分別為0.46和0.32,表明MP的抗氧化能力較低,但具有一定的還原能力。

圖8 蘋果果膠的總抗氧化能力和還原能力Fig.8 Total antioxidant capacity and reducing capacity on MP

2.6 大鼠體重、肝重和附睪脂肪質量的變化

由表4可知,各組大鼠的初始體重無顯著差異。與NFD組相比,HFD組的最終體重和增加體重顯著升高(P<0.05),且肝重也隨之顯著升高(P<0.05);此外,附睪脂肪組織質量顯著增加。與NFD組相比,PG組與各劑量組的最終體重和肝重均顯著低于NFD組(P<0.05),同時,附睪脂肪組織質量也低于模型組(P<0.05),由此說明,MP能夠有效的抑制高脂飲食大鼠的體重增長,抑制脂肪在體內堆積。

2.7 蘋果果膠對高脂飲食大鼠血清脂質水平的影響

MP對高脂飲食大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影響如表5所示。與NFD組相比,HFD組大鼠血清TC、TG和LDL-C水平顯著上升(P<0.05),HDL-C水平顯著下降(P<0.05),說明高脂血癥大鼠模型建立成功;與HFD組相比,PG組和各劑量MP組大鼠血清TC、TG和LDL-C水平均顯著降低(P<0.05),M-MP組、H-MP組HDL-C水平顯著升高(P<0.05),說明MP能夠顯著降低高脂血癥大鼠血脂水平。

表5 蘋果果膠對大鼠血清的TG、TC、LDL-C、HDL-C水平的影響(n=6) 單位:mmol/LTable 5 Effects of MP on the levels of TG, TC, LDL-C,and HDL-C in serum of rats (n=6)

2.8 大鼠肝臟病理學觀察

圖9為大鼠肝組織HE染色結果,NFD組大鼠肝細胞形態大小正常,肝索排列整齊,細胞核清晰可見,未見脂肪空泡出現。HFD組大鼠肝臟呈現彌漫性脂肪變性,肝索排列紊亂,細胞內出現大量大小不等的脂滴,甚至出現大面積空泡,部分細胞的細胞核被擠在邊緣,伴隨有肝臟組織的氣球樣變性,細胞排列不緊密,細胞邊界模糊[21]。經藥物或MP干預后,肝臟病變得到明顯的改善,PG組大鼠肝臟結構完整、清晰,肝組織較為緊密,肝細胞脂肪變性程度明顯減輕,未見細胞氣球樣變性。MP組大鼠肝臟結構完整、清晰,L-MP組與H-MP組相比,細胞間隙較大;H-MP組肝組織狀態最好,雖偶有脂滴,但無脂肪泡大面積出現,脂肪變性得到極大的改善,狀態甚至接近NFD組。

a-NFD組;b-HFD組;c-PG組;d-L-MP組;e-M-MP組;f-H-MP組圖9 大鼠肝臟組織HE染色(×200)Fig.9 HE staining of rat liver tissue (×200)

2.9 蘋果果膠對高脂飲食大鼠血清中抗氧化指標的影響

脂質過氧化反應在高脂飲食過程中會異常增加,并伴隨氧化應激反應增加,這使得機體抗氧化體系紊亂,對抗氧化酶的消耗增加[22],MDA是脂質過氧化反應的最終產物,而MDA在機體內的堆積會加速生物膜的損傷[23]。因此,測定大鼠血清中抗氧化指標來評估大鼠體內的抗氧化體系(圖10)。

a-SOD;b-MDA;c-GSH;d-T-AOC圖10 蘋果果膠對大鼠血清SOD、MDA、GSH、T-AOC水平的影響Fig.10 Effects of MP on rat serum SOD, MDA, GSH, and T-AOC levels注:與正常組比較,#P<0.05,與模型組比較,*P<0.05。

由圖10-a、圖10-c、圖10-d可知,與NFD組相比,HFD組血清中SOD活力顯著減弱(P<0.05),血清GSH含量顯著降低(P<0.05),血清T-AOC水平顯著降低(P<0.05)。說明高脂飲食引發高脂血癥的同時,脂質在體內過度蓄積,導致大鼠的抗氧化體系失衡。不同劑量MP干預后,各劑量組的血清SOD活力顯著高于HFD組(P<0.05),血清GSH含量和血清T-AOC水平均顯著升高(P<0.05)。說明MP可以通過增強體內抗氧化物質的活性來調節大鼠抗氧化體系,使大鼠抗氧化能力增強。圖10-b為各組大鼠血清MDA濃度的變化,HFD組MDA濃度較NFD組升高238%(P<0.05),說明高脂飲食致使體內脂質過氧化反應增加,降低了機體的抗氧化能力。與HFD組相比,L-MP、M-MP和H-MP組MDA濃度顯著降低(P<0.05),分別下降了43.08%、51.15%和60.05%。

3 討論與結論

本文以商品化的MP為研究對象,初步探究其分子質量、酯化度、糖醛酸含量、單糖組成和體外抗氧化能力,以及體內降血脂作用。結果表明,MP分子質量主要集中在2～45 kDa,糖醛酸含量為66.51%,酯化度為13.43%,說明本實驗用MP是一種低酯化度的酸性多糖。體外抗氧化實驗結果顯示,MP對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基均有一定的清除活性,并具有一定的總抗氧化和還原能力;在1～10 mg/mL DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基清除與總抗氧化和還原能力均與樣品濃度呈正比,具有濃度依賴性。

飲食與能量消耗之間的失衡被認為是引發脂代謝紊亂的主要原因。本研究利用高脂飲食誘導建立高脂血癥大鼠模型,HFD組大鼠肝重和附睪脂肪組織質量顯著增加,血清TC、TG和LDL-C水平顯著上升,HDL-C水平顯著下降,提示高脂血癥大鼠模型建立成功。經MP干預后,大鼠血清TC、TG和LDL-C水平顯著降低,HDL-C水平顯著升高,表明MP具有良好的降脂作用,并且H-MP組降血脂效果優于L-MP組和M-MP組。大鼠長期攝入高脂飼料可引起脂質在肝臟蓄積并發生病變,肝臟HE染色顯示,HFD組發生了較嚴重的脂肪病變,并出現氣球樣變化。而經MP干預后,肝臟脂肪變性得到明顯改善,病變逐步恢復。

高脂飲食會誘導自由基的產生,在自由基無法被及時清除時,過度自由基反過來加速高脂血的發生,將會進一步破壞生物膜的結構與功能[24]。MDA作為脂質過氧化反應的應激產物,其血清含量被認為是反映脂質過氧化程度的重要指標[25]。在本研究中,HFD組的SOD活力、GSH與T-AOC水平均顯著低于NFD,同時MDA含量顯著升高,這表明大鼠體內氧化還原系統失衡。經MP干預后,可以顯著上調血清中SOD活力,增加血清中GSH和T-AOC水平以清除過量的自由基,使機體免受氧化應激反應造成持續性損傷,同時MP能降低MDA含量,降低脂質過氧化反應帶來的損傷。

綜上所述,本實驗用MP是一類低酯化度的酸性果膠多糖,本MP具有體外抗氧化能力和降低高脂血癥大鼠血脂作用,能抑制脂肪在體內堆積,同時增強機體抗氧化能力,降低脂質過氧化物的含量,并能明顯改善因脂質過度攝入而受損的肝臟,推測MP可能通過提高機體抗氧化能力來改善血脂代謝異常,其具體的作用機制還需進一步深入的研究。