固態發酵制備黃精多糖的工藝優化、理化特性及抗氧化活性

楊壯,劉怡琳,李隆熙,劉菡,劉旭,馬艷莉*,王頡*

1(河北農業大學 食品科技學院,河北 保定,071000)2(南陽理工學院 張仲景國醫國藥學院,河南 南陽,473000)

黃精(PolygonatumMill)是一種藥食同源的食物資源,已成為我國首批列入《按照傳統既是食品又是中藥材物質目錄》的天然資源之一[1]。黃精根莖具有補中益氣、滋陰養肺等功效,其主要化學成分包括多糖、黃酮、甾體皂苷、三萜、生物堿、植物甾醇及揮發油和微量元素等[2]。多糖是黃精中含量最高(≥7%)的活性物質,具有抗氧化、抗炎、降血糖血脂、抗癌和調節免疫力等功效[3-6]。目前,多糖提取的方法主要有溶劑提取法、酶提取法、超聲波提取法和微生物發酵法等。其中,微生物發酵法不僅可以提高黃精多糖的得率,還可以增強黃精多糖的抗氧化活性和降血糖降血脂功能[7-8]。固態發酵相比于液態發酵成本更低、產物更易分離、多糖轉化率更高、發酵過程不容易造成污染[9]。當前微生物發酵法中對多糖的提取多聚焦在液態發酵,固態發酵提取多糖的研究較少。經研究,適宜的菌種是固態發酵提取多糖的關鍵。常用的發酵菌種包括乳桿菌、酵母菌和芽孢桿菌等,其中使用最廣泛的菌種為乳桿菌,乳桿菌是一類多功能益生菌,具有抗氧化、增強免疫力和調節宿主腸道菌群平衡等功效[10]。

本研究以黃精為原料,利用7株乳桿菌進行固態發酵,篩選出最佳發酵菌種,然后通過單因素試驗和響應面試驗優化發酵條件,最后對比研究固態發酵黃精多糖(solid state fermentationPolygonatumsibiricumpolysaccharide, SF-PSP)和相同條件下未經發酵黃精多糖(P.sibiricumpolysaccharide, PSP)的理化特性和抗氧化活性,以期為發酵黃精提取多糖的結構及活性研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

黃精(一蒸一制:經一次蒸制一次晾曬處理),河南聯源生物科技股份有限公司。

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)GDMCC 1.380、植物乳桿菌ATCC 14917、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)ATCC 334、L.plantarumACCC 11095、L.paracaseiCICC 20109、L.paracaseiCICC 20245、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)CMCC 1.288,北京生物保藏中心。

1.2 主要試劑

乙二胺四乙酸二鈉、十二烷基硫酸鈉、FeSO4、無水乙醇(均為分析純),天津市科密歐化學試劑有限公司;菲啰嗪(分析純),上海麥克林生化科技有限公司;MRS液體培養基、MRS固體培養基(生物試劑),北京奧博星生物技術有限公司;DPPH、ABTS(均為標準品),上海源葉生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備

HH-2型數顯恒溫水浴鍋,金壇市晶玻實驗儀器廠;UV-752 N紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;ME-204E電子分析天平,奧斯豪儀器(上海)有限公司;LC-20A高效液相色譜儀,島津儀器有限公司;Xtimate C18柱,月旭科技(上海)股份有限公司;JSM-7900F場發射掃描電子顯微鏡,日本電子株式會社。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種活化及篩選

將7株菌種分別接種到MRS液體培養基中活化,根據菌種最適溫度搖床培養48 h[11]。將干燥的黃精粉碎,粉末過60目篩。采用固態發酵的方式,分別將活化后的菌種(1.0×108～1.5×108CFU/mL)以接種量10%、液料比1∶1(mL∶g)接入滅菌的黃精粉末中,依據各菌種最適的培養溫度發酵48 h。以黃精多糖的得率為指標,確定最佳發酵菌種。

1.4.2 固態發酵黃精的單因素優化試驗

取滅菌后黃精粉末,培養溫度37 ℃,固定條件為:接菌量10%,液料比1∶1(mL∶g),發酵時間48 h。設置各因素梯度分別為:接菌量(5%、10%、15%、20%、25%),液料比(0.75∶1、1∶1、1.25∶1、1.5∶1、1.75∶1,mL∶g),發酵時間(12、24、36、48、60 h)。改變以上某種因素,其他條件不發生改變,考察不同因素對多糖得率的影響,確定最佳因素水平[12]。

1.4.3 固態發酵黃精的響應面優化試驗

基于上述單因素結果,進行響應面優化試驗。以液料比(A)、接菌量(B)、發酵時間(C)為自變量,多糖得率為響應值,以得到最佳的提取工藝。響應面實驗因素水平設計如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4.4 黃精多糖得率和純度的測定

黃精多糖得率參考包智影[13]的方法,采用水提醇沉法提取,苯酚-硫酸法測定;黃精多糖純度參考房雷雷等[14]的方法,采用苯酚-硫酸法測定吸光度,結果以葡萄糖含量表示。

1.4.5 柱前衍生法測定單糖組分

采用柱前衍生法[7],精密稱取3 mg黃精多糖樣品,加入3 mL 2 mol/L三氟乙酸,充氮封管,于120 ℃下酸解4 h。取出后加入甲醇,氮吹干后加3 mL水復溶,搖勻備用。精確吸取250 μL樣品溶液,加入250 μL 0.6 mol/L NaOH溶液,500 μL 0.4 mol/L PMP-甲醇,70 ℃反應1 h。在冷水中冷卻10 min;加入500 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和,再加入1 mL氯仿漩渦1 min,3 000 r/min離心10 min,取上清液,萃取3次。色譜條件為:Xtimate C18色譜柱(4.6 mm×200 mm,5 μm),柱溫30 ℃,檢測波長250 nm。流動相A為乙腈,B為0.05 mol/L KH2PO4溶液(pH 6.70),流速為1.0 mL/min,進樣量為20 μL;采用等度洗脫方式。

1.4.6 微觀分析

取適量干燥后SF-PSP和PSP,黏著于附有導電膠帶的樣品臺上,置于離子濺射儀中鍍一層導電金粉,之后安放在掃描電鏡下觀察,加速電壓2.00 kV,在1 500×和3 000×下進行觀察[15]。

1.4.7 熱重分析

稱取SF-PSP和PSP各4 mg,適當處理后,使用熱分析儀進行熱重掃描,比較兩者結構穩定性的變化。升溫速率10 ℃/min,升溫范圍25～600 ℃,氣氛為N2[16]。

1.4.8 抗氧化活性測定

1.5 數據處理與統計分析

采用SPSS 23軟件分析處理數據,Design-Expert 12進行響應面設計及分析,Origin 2022繪圖,其中P<0.05表示顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 固態發酵黃精菌種的篩選

由圖1可知,與CON組相比,E組多糖得率降低,其他發酵組多糖得率均顯著提高(P<0.05)。多糖得率低于CON組可能是黃精發酵體系中代謝產物或其他成分對菌種的數量及胞內發生的生化反應產生影響,從而出現多糖得率降低的現象[21];多糖得率高于CON組是由于黃精經微生物發酵處理后,使黃精細胞結構被破壞,胞內多糖可以有效溶出,從而提高多糖得率[22]。C組多糖得率最高為6.24%,顯著高于其他組(P<0.05),可能是由于L.paracaseiATCC 334菌種可以很好地適應黃精發酵體系,更適合在發酵黃精體系中提取多糖。因此,選用L.paracaseiATCC 334作為最佳發酵菌種,進一步探究其發酵工藝。

圖1 不同菌種發酵黃精的多糖得率Fig.1 The yield of polysaccharides from P. sibiricum fermented by different strains注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.2 固態發酵黃精單因素試驗結果

由圖2-a可知,當接菌量達到5%時,多糖得率為6.32%,顯著高于其他組(P<0.05),接菌量超過5%后,多糖得率逐漸下降,可能是由于接菌量過高,營養物質消耗快,不利于菌種生長繁殖及產生代謝產物;接菌量過低,菌種生長緩慢,發酵時間延長,易被雜菌污染[23],從而影響多糖得率。由圖2-b可知,液料比為1∶1(mL∶g)時,多糖得率顯著高于其他組(P<0.05),液料比高于1∶1(mL∶g)后,多糖得率開始降低,可能是過多的水分使體系變得黏稠,不利于空氣流通,導致菌種生長和代謝產物合成緩慢;水分較少,影響菌種的生長和代謝,影響多糖物質溶出[24]。由圖2-c可知,發酵時間在12～60 h時,多糖得率先增加后降低,可能是菌種的生長速率提高,使得合成代謝產物的量也增多;當發酵時間超過48 h,推測是隨著發酵時間的延長,營養物質被消耗,無法維持菌種的正常生長代謝,導致產物合成速率下降[25]。因此本研究選擇接菌量1%～10%、液料比0.75∶1～1.25∶1(mL∶g)、36～60 h進行后續固態發酵工藝參數的優化。

a-接菌量;b-料液比;c-發酵時間圖2 不同發酵因素對SF-PSP得率的影響Fig.2 Effect of different fermentation factors on the yield of SF-PSP

2.3 固態發酵黃精響應面優化試驗結果

2.3.1 響應面模型回歸分析

以液料比(A)、接菌量(B)、發酵時間(C)為變量,黃精多糖得率為響應值,使用Design Expert軟件,Box-Behnken實驗設計結果如表2所示。

表2 工藝優化Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Process optimization Box-Behnken experimental design and results

試驗數據進行回歸分析后,得出回歸方程為:Y=10.69-0.24A-0.96B+0.65C+0.28AB+0.11AC-0.24BC-1.61A2-3.17B2-1.25C2。

表3 工藝優化回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for process optimization regression model

2.3.2 驗證實驗

根據響應面預測的最優參數為液料比0.98∶1(mL∶g),接菌量4.76%,發酵時間51.28 h,考慮到實驗的可操作性,所以將最優條件調整為液料比0.98∶1(mL∶g),接菌量4.80%,發酵時間51.30 h,重復3次實驗,得率平均值為(11.14±0.89)%,與預測值10.87%相差不大,說明通過該響應面優化得到的固態發酵黃精提取多糖的最佳工藝條件可靠。

2.4 黃精多糖的單糖組成和純度分析

PSP和SF-PSP中單糖變化如圖3所示。

a-PSP單糖組成;b-SF-PSP單糖組成圖3 單糖分析結果Fig.3 Results of monosaccharide composition

由圖3和表4中可知,PSP和SF-PSP的單糖種類沒有變化,但單糖含量發生了較大變化,且SF-PSP中總糖含量增加到(10.225±0.007)%,高于PSP含量[7]。PSP和SF-PSP中甘露糖、半乳糖醛酸、半乳糖和葡萄糖含量較多,核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖含量較少。相比于PSP,SF-PSP中核糖、巖藻糖、木糖及葡萄糖含量降低,而鼠李糖、半乳糖醛酸和半乳糖含量分別為(0.119±0.001)%、(0.708±0.001)%、(1.859±0.05)%,均高于PSP含量的4倍。已有研究表明,植物多糖經微生物發酵后,單糖含量會發生變化[26]。發酵后黃精的主要單糖含量變化可能是由于在微生物發酵的作用下,黃精的葡萄糖和其他含碳物質被微生物的生長代謝所利用,產生其他種類的單糖物質[27]。

表4 PSP和SF-PSP中單糖成分含量 單位:%Table 4 Content of monosaccharide components in PSP and SF-PSP

黃精多糖純度采用苯酚-硫酸法測定,以葡萄糖的質量為橫坐標,以吸光度為縱坐標繪制標準曲線,得標準曲線方程y=0.112x+0.006 4,R2=0.991 8,由此計算得SF-PSP和PSP純度分別為(85.50±0.99)%和(88.20±0.99)%。

2.5 掃描電子顯微鏡分析

由圖4中可知,PSP和SF-PSP的微觀形態不均勻,這可能歸因于多糖較強的交聯聚集。PSP具有清晰可見的聚集塊,表面凹凸不平,結構較為緊密,孔徑不規則且稀疏。而SF-PSP呈細碎顆粒狀,表面粗糙不光滑,分布著致密的小孔,結構疏松,該結構使得SF-PSP吸水能力更強。兩種多糖形貌存在差異,推測是由于發酵后改變了多糖物質的結構分布,這種差異可能會使多糖的理化特性發生改變[15]。

a-PSP(1 500×);b-PSP(3 000×);c-SF-PSP(1 500×);d-SF-PSP(3 000×)圖4 多糖的掃描電鏡圖譜Fig.4 Scanning electron microscopy atlas of polysaccharides

2.6 熱重分析

如圖5所示,根據熱重分析曲線,PSP的熱重曲線分為3個階段。第一階段從25～172 ℃,樣品損失的質量百分比為7.2%,在這一階段中,發生脫水,去除組分中自由水的含量。從DTG曲線可以看出,多糖的含水量和雜質含量較低[28]。該階段損失越少,說明多糖保水性能越好[29]。第二階段在172～249 ℃,失重率為28.6%。第三階段在249～600 ℃,失重率為44.3%。后兩個階段失重是由于多糖組分結構的解聚和熱分解[16]。

a-PSP熱重分析圖;b-SF-PSP熱重分析圖圖5 多糖的熱特性Fig.5 Thermal properties of polysaccharides

SF-PSP與PSP整體趨勢基本一致,除溫度節點不同外,可分為4個階段。第一階段在25～124 ℃,失重率為5.4%,主要是自由水的消失,損失少于PSP,保水性能較好。第二階段和第三階段的溫度分別為124～248 ℃和248～400 ℃,失重率分別為24.76%和34.84%,第四階段溫度為400～600 ℃,失重率在8.06%呈平緩下降趨勢。后3個階段失重都是與多糖組分結構的解聚和熱分解有關[30]。與PSP不同的是,SF-PSP失重率的快速下降分為2個階段,可能與發酵后結構的改變有關。

2.7 體外抗氧化活性

如表5所示,陽性對照品質量濃度為2～6 mg/mL時,DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率和亞鐵離子螯合能力均顯著高于兩種多糖的抗氧化效果。SF-PSP的DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率、亞鐵離子螯合能力、總抗氧化性均高于PSP。在2～6 mg/mL時,兩種多糖的抗氧化能力與多糖濃度均呈劑量依賴性?？梢钥闯?SF-PSP在4 mg/mL時,DPPH自由基清除率、亞鐵離子螯合能力及總抗氧化性均高于PSP在6 mg/mL時,SF-PSP的抗氧化效果在濃度較低條件下可以達到PSP在較高濃度時候的效果。通過SPSS 23計算,PSP對DPPH自由基和亞鐵離子螯合能力的IC50值分別為15.29 mg/mL和10.55 mg/mL,而SF-PSP的值分別為7.65 mg/mL和4.61 mg/mL,均低于PSP,說明SF-PSP在這兩種抗氧化試驗之中顯著性高于PSP(P<0.05)。發酵后多糖的抗氧化能力得到提高,與王若男等[8]研究結果一致。

表5 不同濃度PSP和SF-PSP的抗氧化能力Table 5 Antioxidant capacity of different concentrations of PSP and SF-PSP

3 結論

本研究利用7株乳桿菌對黃精進行固態發酵,篩選出最佳發酵菌種為L.paracaseiATCC 334。最佳發酵工藝為:液料比0.98∶1(mL∶g)、接菌量4.80%、發酵時間51.30 h,此條件下多糖得率為(11.14±0.89)%。單糖組成分析發現,PSP和SF-PSP中甘露糖、半乳糖醛酸、半乳糖和葡萄糖含量均較多,發酵前后單糖組分占比發生改變。掃描電鏡結果表明,SF-PSP相比于PSP結構更加疏松,小孔更加致密。熱重分析結果表明,SF-PSP相比于PSP保水能力更強。體外抗氧化活性表明,SF-PSP抗氧化性能顯著高于PSP。本試驗對微生物固態發酵法提取黃精多糖進行了工藝優化,對黃精多糖的理化特性表征以及抗氧化活性進行分析,以期為黃精資源的綜合開發利用提供理論參考。