蛋清蛋白/黃油復合凝膠的特性研究

張川,李倩文,王曉楠,陳樹興*

1(河南科技大學 食品與生物工程學院,河南 洛陽,471000)2(中原食品實驗室,河南 漯河,462000)

蛋清蛋白(egg white protein, EWP),一種營養豐富的優質蛋白,具有較高的消化率及人體所必需的8種氨基酸,因其具有乳化性、起泡性、凝膠性等優良特性,常作為功能性原料應用于食品、農業中[1]。其乳化性和凝膠性不僅有利于食品的質地、形態及持水性,同時可改善食品風味和口感等[2],因此被廣泛應用于肉制品、焙烤等食品中。食品工業中為提高蛋清粉凝膠性、乳化性等加工特性,通常使用的3種改性方法有物理[3]、化學[4]和酶法改性[5],其中物理改性中的熱誘導因能耗低、效率高、產品品質高且安全等優點被廣泛應用[6]。其機理為將蛋白質加熱至變性后部分蛋白質結構展開和聚集,一定量的蛋白質之間或與蛋白質包裹的脂肪滴形成三維網絡結構[7]。研究表明,脂質和蛋白質間的相互反應對凝膠體系的性質和結構具有較大影響[8]。CHANG等[4]研究發現熱改性能可有效提高蛋白質油水界面的吸附力,從而提升EWP的起泡性、乳化性、熱穩定性及凝膠特性。方艾虎等[9]制備了不同油相質量分數下的卵清分離蛋白-亞麻籽油乳液體系,并研究其流變特性、粒徑分布、微觀結構等特性,結果表明在高油相質量分數下凝膠體系穩定性增強,黏度提高,粒徑減小,證明了高油相乳液體系具有良好的可行性。

黃油具有易消化吸收、較好的溶化性及加熱融化后的獨特乳香等優勢[10],是乳制品焙烤食品的必備原料之一。此外黃油含有維他命、短鏈脂肪酸、礦物質(如鈣、磷、鉀)等營養物質[11-12],并具有提高免疫力、改善貧血和胃腸道疾病等作用[13],適量食用可改善因食用不飽和脂肪酸或人造奶油造成的貧血癥狀,且與蛋白結合應用到食品中可改善產品質地、乳化性及質構特性。EWP具有與乳化鹽相似的乳化特性,黃油又因其營養價值及質地和口感成為制備乳制品的必備原料。目前,通過添加油脂改善凝膠品質的研究有較多報道,但關于EWP和黃油制作復合凝膠并探討其性質的研究鮮少報道。

本研究以EWP和黃油為原料,通過熱誘導的處理方法制備含有不同濃度黃油的EWP/黃油復合凝膠,并研究其質構特性、持水性、乳化性、乳化穩定性、流變特性及微觀結構的變化,以利用其乳化性及凝膠特性,為后續部分替代乳化鹽,減少食品中乳化鹽的用量,制備低鈉食品提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

EWP粉(蛋白含量78%,食品級),山東碩豐生物科技有限公司;黃油(食品級),淶水縣金谷糧油食品有限公司;檸檬酸(食品級),河南萬邦化工科技有限公司;十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、Na2HPO4、NaH2PO4(分析純),天津市德恩化學試劑有限公司;Nile Red、Nile Blue(分析純),上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高速均質乳化機,常州越新儀器制造有限公司;TG16-WS臺式高速離心機,湖南湘儀實驗室儀器有限公司;Instron Universal 5544 型食品物性分析儀,美國Instron公司;TA DHR-2流變儀,美國TA儀器有限公司;TM3030plus SEM臺式掃描電鏡,日本日立高新技術公司;LGJ-10D型冷凍干燥機,北京四環科技儀器有限公司;T6新世紀紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;LSM 900激光掃描共聚焦顯微鏡,蔡司光學有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 EWP/黃油復合凝膠的制備

用去離子水制備140 g/L的EWP粉溶液,置燒杯中磁力攪拌1 h后,9 000 r/min均質EWP溶液3 min,55 ℃水浴加熱1 h水合,以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的質量比倒入融化后的黃油(55 ℃乳化10 min),10 000 r/min均質5 min使其完全均質化,調pH值至6.0,隨后90 ℃熱處理變性30 min,流水冷卻后即得EWP/黃油復合凝膠,取部分樣品于4 ℃保存24 h后測定質構特性及持水性,部分樣品真空凍干后用以乳化性、乳化穩定性及掃描電鏡檢測,其中未添加黃油的EWP凝膠作為空白對照。

1.3.2 質構特性測定

參照ZHENG等[14]方法,稍作改動。取1.3.1節所制樣品置于燒杯中(樣品直徑5.0 cm、高度1.5 cm)待測。物性分析儀參數設定:測試前速率5 mm/s,測試速率2 mm/s,測試后速率5 mm/s,測試形變30%;探頭為P/36 R,測定樣品的硬度、彈性、膠黏性及內聚性,每個樣品平行測定3次。

1.3.3 持水性測定

參照ZHAO等[15]方法,以10 mL離心管質量記為m0(g),將1.3.1節制備好的凝膠樣品轉至離心管中,樣品與離心管總質量記為m1(g),室溫下10 000 r/min離心10 min,濾紙將上層及表面水分吸干后稱質量記為m2(g),重復3次,按公式(1)計算復合凝膠樣品的持水性(water holding capacity,WHC)。

(1)

式中:m0,離心管的質量,g;m1,離心管和樣品總質量,g;m2,離心后離心管和樣品總質量,g。

1.3.4 乳化性及乳化穩定性測定

參照劉麗莉等[16]檢測方法,將1.3.1節所制凍干樣品溶解于pH 6.0,100 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液中(1 mg/mL),取18 mL樣品加入6 mL大豆油于室溫下10 000 r/min均質1 min以形成乳化液。分別在均質后0 min和10 min時從乳化液底部吸取100 μL,使用4.9 mL的0.1%(體積分數)的SDS稀釋混勻后,于500 nm測定吸光值,以0.1%的SDS溶液為空白。根據公式(2)、公式(3)計算乳化性(emulsifying activity index,EAI)及乳化穩定性(ESI)。

(2)

式中:N,稀釋倍數;A0,均質0 min的吸光度值;ρ,蛋白質的質量濃度,g/mL;φ,溶液中加入油的體積比。

(3)

式中:A0,均質0 min的吸光度值;A10,均質10 min的吸光度值。

1.3.5 流變特性測定

根據PEYRANO等[17]的測定方法并略作改動。取1 mL變性前樣品溶液置于流變儀的40 mm平行板夾具上,除去氣泡,于樣品邊緣滴加硅油后進行動態溫度測定。掃描條件:掃描頻率1 Hz,應變幅度1%,溫度以5 ℃/min從25 ℃升至90 ℃保持30 min后,再降至25 ℃,記錄樣品的儲存模量G′和損耗角tanδ隨溫度變化的趨勢。

1.3.6 掃描電鏡測定

參照張詩佳等[18]方法,將1.3.1節所制凍干樣品置于已固定導電膠的樣品臺上,進行離子濺射噴金處理后,移至掃描電鏡樣品倉進行觀察,于10 kV電壓下對其進行觀察(200倍)。

1.3.7 激光共聚焦測定

根據LI等[19]的測定方法并略作改動。通過1%的Nile Red和1% Nile Blue[1∶1(體積比)]進行染色,1 mL樣品滴加20 μL染液,混勻后取10 μL到載玻片上,并覆蓋蓋玻片,除去氣泡后置于載物臺上,使用20×目鏡在488 nm與633 nm激發光波長下采集圖像。

1.3.8 統計分析

試驗數據采用SPSS statistics 25進行顯著性分析,運用Excel 2019進行統計分析,利用Origin 8.5軟件作圖,每組試驗平行3次。

2 結果與分析

2.1 質構特性分析

質構檢測中的硬度、彈性、膠黏性及內聚性通常是凝膠網絡結構的表現,在一定程度上反應了凝膠網絡結構的完整性和強度[20]。不同EWP/黃油比例下復合凝膠的質構分析如表1所示,隨著黃油濃度的增加,復合凝膠的硬度及膠黏性逐漸增大,彈性及內聚性均呈現先增大后減小的趨勢,且在EWP/黃油質量比為1∶3時復合凝膠的彈性及內聚性均達到了最大值(P<0.05),此時混合凝膠的組織狀態細膩無氣孔;當EWP/黃油質量比達到1∶4及1∶5時,復合凝膠彈性及內聚性下降(P<0.05),這表明在熱處理過程中蛋白受熱聚集,乳化后的油脂分子填補至蛋白凝膠網絡的孔隙中,使其網絡結構更加緊密,從而影響復合凝膠的質構特性。此外經熱變性后蛋白質分子充分暴露,導致疏水基團暴露,氫鍵和疏水鍵發生相互作用促進凝膠網絡結構的增強,其彈性和內聚性也隨之增強。但當黃油達到一定量時,部分黃油填充復合凝膠的孔隙提高了凝膠強度,剩余部分乳化后的黃油會破壞蛋白質的結構導致彈性及內聚性減弱,相關研究也表明,添加預乳化后的油脂更有助于凝膠結構的形成[21]。

表1 不同比例EWP/黃油對復合凝膠質構的影響Table 1 Effects of different proportions of EWP/butter on the texture of the composite gel

2.2 持水性分析

持水性作為凝膠的重要指標之一,在一定程度上反映了復合凝膠的水合程度。在凝膠化過程中,蛋白質的高級結構因熱變性松動,分子交聯形成三維網絡結構,從而捕獲復合凝膠中的自由水,使其具有一定的持水性[22]。不同比例下EWP/黃油復合凝膠的持水性如圖1所示。隨著黃油濃度的增加,復合凝膠的持水性呈現先逐漸增大后趨于平緩的趨勢(P<0.05)。EWP/黃油復合凝膠相較未添加黃油的蛋清蛋白凝膠而言,因蛋白質與脂質經均質剪切作用被束縛在凝膠網絡結構中,持水性得到顯著增高(P<0.05),當EWP/黃油質量比為1∶3時,與對照組相比,持水性增至(67.84±1.73)%,這是因為隨著黃油濃度的增加,更多油滴排列在復合凝膠網絡中,兩親性的蛋白吸附在油水界面的同時暴露了疏水區域并與油滴和蛋白分子反應,這一過程使蛋白質的極性氨基酸殘基被暴露,并通過氫鍵與蛋白質分子和水分子水合,因此持水性增大,其凝膠硬度也隨之增加。當EWP/黃油質量比為1∶4及1∶5時差異不顯著(P>0.05),此外當EWP/黃油質量比設置為1∶6時,因油脂過多未能形成凝膠狀外觀及形態,故后續試驗不以其作為研究對象。

圖1 不同EWP/黃油比例的復合凝膠持水性Fig.1 WHC of blended gels with different EWP/butter ratios

2.3 乳化性及乳化穩定性分析

蛋白質分子具有乳化劑的特征結構,即“兩親”結構,是食品的重要表面活性物質,其乳化特性表征了蛋白質吸收至油水界面的能力[23]。圖2為復合凝膠的EAI及ESI情況,與未處理組相比,復合凝膠的EAI和ESI均得到顯著提高(P<0.05),同時隨著二者比例的增加呈現先增加后下降的趨勢,此結果與質構特性結果趨于一致,且當EWP/黃油質量比為1∶3時,EAI和ESI達到了最大值,分別從(40.74±1.66) m2/g增加至(89.87±2.36) m2/g,從(36.85±1.99)%增加至(65.97±1.51)%,表明適量油脂的添加顯著改善復合凝膠的乳化特性。其原因為熱處理后被包埋在蛋白質內部的疏水性殘基暴露,蛋白質在油水界面的吸附能力增加,從而形成致密且具有黏彈性的蛋白質膜,防止油滴聚集及其乳化狀態被破壞,有效截留了水分,形成了更穩定的乳化液。此外黃油和EWP均具有乳化特性,二者結合復配制得的復合凝膠也具有乳化特性,楊淼等[24]研究表明適當的油相比例可以改善大豆分離蛋白的凝膠持水性和乳化特性,這與本研究結果相似。

圖2 不同EWP/黃油比例的復合凝膠EAI及ESIFig.2 Composite gel emulsification and emulsification stability with different EWP/EG ratios

2.4 流變特性分析

凝膠形成過程可以通過動態流變學中的參數儲存模量(G′)及損耗因子(tanδ)了解,G′表示凝膠網絡結構的彈性性能,也代表其凝膠強度,tanδ反映復合凝膠加熱過程中的整體網絡結構。EWP/黃油復合凝膠的G′溫度掃描結果如圖3-a所示?？瞻捉M及不同比例下的復合凝膠變化趨勢一致,在升溫階段前期,蛋白質分子未完全變性,G′隨著溫度升高而降低;隨著加熱溫度到達凝膠點,G′急劇升高,這是因為蛋白質受熱變性形成凝膠網絡結構,凝膠體系由液體轉向固體,此時凝膠體系蛋白質結構充分展開,疏水基團暴露且蛋白質分子間相互作用發生交聯聚集從而形成凝膠[25]。在恒溫階段,G′隨溫度掃描穩步上升,尤其是EWP-黃油質量比為1∶1、1∶3、1∶4時較為明顯,可能是由于未變性蛋白開始變性,即隨著溫度升高,蛋白質和油脂作為活性填充劑的作用強化了凝膠網絡結構。隨著掃描溫度降低,復合凝膠的G′持續增大,尤其是質量比為1∶3時的G′最大,質量比為1∶5時次之,此時蛋白分子間的氫鍵導致凝膠網絡分子運動性下降,且形成的凝膠網絡愈加穩定,蛋白質交聯趨向完成狀態。

a-G′;b-tanδ圖3 不同EWP/黃油比例對復合凝膠G′和tanδ流變特性的影響Fig.3 Effect of different EWP/butter ratios on the rheological properties of mixed gels, G′ and tanδ

EWP/黃油復合凝膠的損耗因子(tanδ)溫度掃描結果如圖3-b所示,空白組及不同比例下的復合凝膠變化趨勢一致。在升溫階段,tanδ先隨溫度升高小幅度降低,隨后急劇下降,表明蛋白在升溫過程中構象發生轉變,固體性質增強,流體性質減弱;恒溫階段的凝膠體系由溶膠轉變為彈性半固體;降溫過程中,EWP/黃油質量比為1∶3時的tanδ(0.165)最低,表明復合體系具有較好的凝膠結構,可能是因為油脂和蛋白的相互交聯導致凝膠網絡結構的增強。

2.5 掃描電鏡分析

為能夠更直觀地表征復合凝膠的結構,使用掃描電鏡對其進行觀察。圖4為掃描電鏡在200倍下的掃描結果。圖4-a為未添加黃油的EWP凝膠,其凝膠結構孔洞多且不均勻,圖4-b～圖4-f為添加黃油后的復合凝膠,其網絡結構相對致密均勻,說明乳化后的油脂充當活性填充物的作用被包裹在蛋白質中,增強了復合凝膠的網絡結構,結合持水性及凝膠強度結果分析,乳化后的油脂還促進了EWP分子間的交聯和聚集及與蛋白質之間的相互促進作用。當EWP/黃油質量比為1∶3時,復合凝膠的網絡結構最為均勻緊湊,基本看不到孔洞,這是因為在熱變性過程中EWP分子疏水基團暴露,蛋白質和油脂間相互作用力增強,形成致密的蛋白質膜,顯著改變且形成較致密的凝膠網絡結構,凝膠強度和持水性也因此得到改善。當EWP/黃油質量比為1∶4和1∶5時導致復合凝膠結構開始出現孔隙,主要是過量的油脂不能完全被蛋白質包裹,增大了空間位阻,導致凝膠網絡孔隙變大,致密程度減小。此結果與凝膠強度、乳化特性及持水性一致,在一定程度上與XU等[26]的研究相符。因此添加適當黃油能顯著改變蛋清蛋白的網絡結構,且影響其凝膠特性。

a-1∶0;b-1∶1;c-1∶2;d-1∶3;e-1∶4;f-1∶5圖4 不同EWP/黃油比例的掃描電鏡圖Fig.4 SEM plots of different EWP/butter ratios

2.6 激光共聚焦分析

采用激光共聚掃描顯微鏡對其結構進行表征。EWP凝膠及不同EWP/黃油比例下經熱誘導制得的復合凝膠激光共聚焦結構如圖5所示。

a-1∶0;b-1∶1;c-1∶2;d-1∶3;e-1∶4;f-1∶5圖5 不同EWP/黃油比例的激光共聚焦圖Fig.5 Laser confocal plots of different EWP/butter ratios

紅色代表被Nile Red染色的蛋白,綠色代表被Nile Blue染色的油脂。隨著黃油比例的增加,復合凝膠的顆粒及孔徑逐漸增大且更均勻,當EWP/黃油質量比為1∶3時,形成了較致密均勻的網絡結構,且無析水無孔隙,此結果與掃描電鏡結果趨于一致,質量比為1∶4及1∶5時,過多的黃油出現了擠壓變形的不規則現象,結合凝膠強度結果進一步說明添加黃油一定程度上有利于提高復配EWP形成致密均勻的凝膠網絡結構。這與BEMER等[27]關于蛋白結合油脂凝膠化有利于形成致密網絡結構的研究結果一致。

3 結論

本研究通過熱誘導利用不同比例的EWP和黃油制備EWP/黃油復合凝膠,并探究其特性。研究結果表明EWP/黃油質量比為1∶3時,EWP/黃油復合凝膠的持水性、質構特性、乳化特性、流變特性得到顯著提高,通過掃描電鏡和激光共聚焦結果顯示添加黃油的復合凝膠網絡結構更致密均勻。綜上所述,黃油在一定程度上改善了EWP的凝膠特性及乳化特性,也賦予其良好的質構特性,本文研究結果將為EWP/黃油復合凝膠在乳制品和烘焙等食品領域中的實際應用提供理論依據。