高負載姜黃脂質體粉的構建及生物利用度的研究

方素瓊,陳文榮*,梁珊,鄒立強,李倩

1(仙樂健康科技股份有限公司,廣東 汕頭,515041)2(南昌大學 食品科學與資源挖掘全國重點實驗室,江西 南昌,330047)3(湖北工業大學 生命科學與健康工程學院,湖北 武漢,430000)

姜黃(CurcumalongaL.)是姜科姜黃屬植物,姜黃素是從姜黃中提取的疏水性多酚化合物[1]。姜黃素是世界上銷售最廣泛的天然食品色素。同時,姜黃素在食品工業中常被用作食品香料和膳食補充劑。姜黃素被認為是一種安全物質。研究表明,高劑量口服(6 g/d)對人類和動物無毒性[2]。隨著研究的深入,發現姜黃素具有廣泛的生理活性功能,包括抗氧化[3]、抗炎[4]、抗菌[5]、抗病毒[6]和抗糖尿病[7]等,姜黃素類化合物的體內代謝途徑包括Ⅰ相還原代謝、Ⅱ相結合代謝以及自身氧化和細胞內的催化氧化代謝[8]。姜黃素Ⅰ相還原代謝的產物主要為四氫姜黃素和六氫姜黃素以及少量的阿魏酸,是逐級加氫的過程。在Ⅰ相還原代謝中,肝臟和小腸細胞質內的乙醇脫氫酶參與了反應[9]。由于Ⅰ相代謝產物都具有酚羥基和醇羥基的結構,所以在Ⅱ相代謝中發生了葡萄糖醛酸化和硫酸化的結合反應。姜黃素的最終代謝產物絕大部分是以葡萄糖醛酸化的形式存在的,硫酸化產物相對較少。然而,姜黃素具有低水溶性、低化學穩定性、在胃腸道吸收差以及在胃腸道和肝臟中代謝快的特點,這極大地限制了其應用[10]。近年來,很多研究人員通過構建不同的運載體系包埋并遞送姜黃素來提高其溶解度及生物利用度。

脂質體是由兩親性分子定向自組裝形成的球形囊泡[11]。作為廣泛研究的藥物遞送載體,脂質體無毒、可生物降解,并能有效地封裝各種生物分子[12-14]。目前,常用的脂質體制備方法包括薄膜分散法和乙醇注入法。薄膜分散法存在制備效率不高、脂質體大小不均、有機試劑殘留及難以工業化等缺陷[15-16]。乙醇注入法由于脂溶性活性成分在乙醇中的溶解度有限導致負載量較低,且有一定的安全隱患,使其在食品行業中的應用也受到限制。另一種具有高效、安全及穩定的制備方法——高壓均質法,可利用物料在均質管道中產生剪切、碰撞和空穴等作用,獲得更小粒徑及更高穩定性的脂質體[17]。

本研究采用高壓均質結合噴霧干燥技術制備基于磷脂包埋的高負載姜黃脂質體粉,對其粒徑、電位、微觀結構等理化性質及貯藏穩定性進行表征,并以姜黃原料和市售中高吸收姜黃行業標桿品牌物料(簡稱商業高吸收姜黃)作為對照組比較姜黃素的體外和體內吸收性能。闡明高壓均質技術作為高負載姜黃脂質體粉制備新技術的潛力,為其相關產品的開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃原料(食品級),河南中大恒源生物科技有限公司;磷脂(食品級),北京美業生物科技有限公司;商業高吸收姜黃(為姜黃磷脂復合物產品),市售;姜黃素標品(純度>98% HPLC)、口腔黏膜蛋白、胃蛋白酶、脂肪酶、胰酶,阿拉丁生化科技股份有限公司;姜黃素葡萄糖醛酸(純度>95%),湖北楊信醫藥科技有限公司;乙酸乙酯(色譜純),廣州化學試劑廠;羧甲基纖維素鈉(分析純),阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇(色譜純)、甲酸(色譜純),上海安譜實驗科技股份有限公司。

SD大鼠15只(5只雌性、10只雄性),體重300～350 g,試驗動物來自三峽大學,許可證號:SCXK(鄂)2022-0012。試驗設計通過倫理審核,獲得湖北工業大學科研倫理與科技安全委員會審批(審批編號:HBUT20220036)。

1.2 儀器與設備

AH-Pilot高壓均質機,安拓思納米技術(蘇州)有限公司;Mastersizer3000激光衍射儀、Zetasizer Nano ZSP納米粒度分析儀,英國Malvern儀器有限公司;ZEISS sigma 300掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM),德國蔡司;HT7800透射電鏡(transmission electron microscope, TEM),日本日立株式會社;U3000-Q-Exactive超高效液相串聯質譜,賽默飛;高速冷凍離心機、漩渦振蕩混合儀、電子天平、pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;噴霧干燥塔(MDR-離心式噴霧干燥機),常州通干干燥工程有限公司;BT-1001智能粉體特性測試儀,丹東百特儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 姜黃脂質體粉的制備

將特定比例磷脂與姜黃、水混合,采用高壓均質技術制備得到姜黃脂質體液體,再加入壁材利用噴霧干燥塔制備成高負載姜黃脂質體粉(簡稱姜黃脂質體粉)。

1.3.2 粒徑、電位與微觀結構

用激光衍射儀測量姜黃脂質體粉的粒徑,粒徑結果用表面加權平均直徑(d3,2) 表示;稱取一定量的姜黃脂質體粉樣品并加水稀釋,平衡約30 min后,利用納米粒度儀測定其電位;利用SEM觀察姜黃脂質體粉的微觀結構。將脂質體粉劑按1∶100復水后,并用TEM觀察姜黃素脂質體的微觀結構。

1.3.3 包封率(encapsulation efficiency,EE)

精密稱取混合均勻的姜黃脂質體粉1 g于50 mL離心管中,準確加入4 mL水,渦旋分散5 min,如有樣品出現結團無法完全分散,用玻璃棒碾壓至無團塊。放置1 h,精密吸取0.1 mL溶液至25 mL容量瓶中,作為樣品a(總含量)。2 000 r/min離心5 min,精密吸取上層溶液0.1 mL至25 mL容量瓶中,作為樣品b(包埋部分)。將樣品a和樣品b分別加無水乙醇15 mL渦旋分散后,超聲3 min,再用無水乙醇定容至刻度,過濾。再分別吸取樣品a和樣品b濾液各0.5 mL,加無水乙醇稀釋至10 mL,采用HPLC進行測定,姜黃脂質體粉的包封率按公式(1)計算:

(1)

式中:a,包埋的姜黃素質量,mg;b,總姜黃素質量,mg。

1.3.4 貯藏穩定性

將姜黃脂質體粉樣品置于40 ℃條件下加速貯藏3個月,記錄其表觀、含量、包封率、休止角、崩潰角、松密度及實密度等性質的變化。其中姜黃素含量測定采用HPLC法,首先要制作姜黃素標準曲線,準確稱取10.0 mg的姜黃素標品并置于10 mL棕色容量瓶中,加入甲醇至容量瓶刻度線即得1 mg/mL 姜黃素標準溶液。再將此標準溶液依次稀釋成1、2、4、6、8 μg/mL,作為儲備液進行HPLC測定(Y=0.147 2X-0.004 5,R2=0.999 9)。其中色譜條件同1.3.3節。姜黃脂質體粉樣品經過同樣的處理后進行HPLC測定。休止角、崩潰角、松密度及實密度用智能粉體特性測試儀進行測定,包封率用1.3.3節方法進行測定。

1.3.5 模擬體外消化特征

基于先前研究中描述的模擬胃腸道模型[18],確定了姜黃脂質體粉的潛在胃腸道命運,并以姜黃原料和商業高吸收姜黃作為對照。模擬唾液(simulated saliva fluid,SSF)、模擬胃液(simulated gastric fluid,SGF)和模擬腸液(simulated intestinal fluid,SIF)的配制參考本課題組先前的研究[17]。所有溶液在實驗前預熱至37 ℃,并在實驗過程中保持在37 ℃。

口腔階段:黏液蛋白(3.0 mg/mL)在約1 h前溶解在SSF中。將該溶液(7.5 mL)加入到初始樣品(7.5 mL)中并將pH值調整為6.8,然后以100 r/min攪拌10 min。

胃階段:胃蛋白酶(3.2 mg/mL)也提前在SGF中溶解。將該溶液(15 mL)與來自口腔階段的樣品(15 mL)混合并調pH值為2.5,并以100 r/min攪拌2 h以模擬胃部消化條件。

小腸階段:膽鹽和酶提前溶解在磷酸鹽緩沖溶液中(5 mmol/L,pH 7.0)。先將胃階段后的消化物(30 mL)的pH值調整為7.0。然后向樣品中加入SIF(1.5 mL)、膽鹽溶液(3.5 mL)、脂肪酶溶液(2.5 mL)和胰蛋白酶溶液(2.5 mL)。通過向容器中滴加0.1 mol/L NaOH標準溶液,監測并保持該溶液的pH值在7.0,持續2 h。

消化結束后立刻將消化瓶置于冰水浴中15 min,然后置于攪拌器上取一定質量的原始消化物在4 ℃下離心(15 000×g)30 min并收集中間膠束相。姜黃素含量用紫外可見分光光度計(419 nm)進行測定[19]。

1.3.6 動物實驗

1.3.6.1 動物實驗分組及生物利用度研究

采用HPLC-MS/MS(orbitrap檢測器)方法檢測大鼠血漿中姜黃素及其代謝產物的濃度。15只SD 大鼠隨機分為3組,每組 5 只(雌雄隨機),實驗前12 h禁食。姜黃原料均勻分散于0.5%(質量分數)的羧甲基纖維素鈉溶液中,商業高吸收姜黃和姜黃脂質體粉分散于超純水中[20]。所有灌胃樣品現配現用,配制時避光。單次喂養以100 mg/kg姜黃素進行生物利用度評價。

1.3.6.2 血漿的采集及檢測

對各組大鼠灌胃前(0 h)及灌胃后 0.17 h(約10 min)、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、11 h各時間點連續采血。每個采血點從老鼠尾部靜脈采取全血 0.5 mL,放置于準備好的肝素鈉管中,輕輕振搖使血液與抗凝劑充分混勻。血樣置冰盒中,避光存放,并于采集后 30 min內采用冷凍離心機離心(3 000 r/min,10 min)。離心后的血清轉移至凍存管中,并加入5 μL 50%的色譜級甲酸溶液,放入-80 ℃冰箱保存供后續測試。從血液采集到樣品保存至-80 ℃冰箱,所有操作在1～1.5 h完成。所有血清樣品在5 d內完成液質檢測。具體步驟:取150 μL血漿樣品,加入含有色譜級甲酸的乙酸乙酯溶液 450 μL渦旋混勻 5 min,采用冷凍離心機在10 000 r/min 離心10 min,取上清液,定容至500 μL后移入帶有內襯管的棕色進樣瓶中,進行液質分析。

1.3.6.3 色譜及質譜條件

色譜柱:C18柱,流動相B:0.1%甲酸水,流動相C:0.1%甲酸甲醇,流速0.2 mL/min, 柱溫20 ℃。

離子源:ESI;正離子模式;采集模式:targeted-sim-ddms2。以母離子定量:姜黃素(369.133 26),姜黃素葡萄糖醛酸(545.165 35)。以子離子定性:姜黃素(285.111 63,245.080 46),姜黃素葡萄糖醛酸(369.132 69,285.111 63,245.080 46,177.054 38)。

1.4 數據統計與分析

實驗數據以均數±標準差表示,采用SPSS Version 18.0軟件進行分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 理化性質表征

脂質體的粒徑是一個重要參數,其大小不僅影響自身的環境穩定性,還對生物活性成分的負載、吸收和釋放等有較大影響[21]。如圖1所示,當磷脂添加量為2.5%(質量分數)時,脂質體粒徑為(5.23±0.14) μm,隨著磷脂添加量的增加,姜黃脂質體粉的粒徑先減小后趨于平穩。這可能是因為當磷脂含量較低時,膜流動性和穩定性較差,不足以包封體系中大量的姜黃素;隨著磷脂添加量的增加,在高壓均質過程中形成的膜結構更加緊密穩定,粒徑減小;繼續添加磷脂對粒徑的影響不大,可能主要用于增加雙分子層的厚度[22]。

a-粒徑;b-電位圖1 不同磷脂添加量姜黃脂質體粉的粒徑和電位表征Fig.1 Characterization of particle size and zeta potential of turmeric liposomes powder with different phospholipid addition levels注:不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)(下同)。

Zeta電位值也是影響脂質體穩定性的重要因素。一般來說,ζ電位的絕對值越高,脂質體體系越穩定[23]。姜黃脂質體粉的電位受磷脂含量影響較大。隨著磷脂添加量的增加,姜黃脂質體粉的Zeta電位絕對值逐漸增大,表明脂質體之間靜電排斥力逐漸增強,對體系的穩定性具有重要作用。

對不同磷脂含量的姜黃脂質體粉進行微觀結構表征(圖2),可以觀察到微膠囊表面都有一些“褶皺”。這些褶皺的形成是因為料液在噴霧干燥中首先被霧化成小液滴,并在熱空氣中快速干燥,導致表面形成不同程度的褶皺[24]。隨著姜黃脂質體粉中磷脂含量的增加,微膠囊的形狀更加規則飽滿且表面逐漸平滑。這可能是因為多余的磷脂在噴霧干燥過程中起到了一定的填充作用。

圖2 不同磷脂添加量姜黃脂質體粉的微觀結構Fig.2 Microstructure of turmeric liposomes powder with different levels of phospholipid addition

脂質體復溶后的結構也是判斷脂質體情況的重要指標,如圖3所示,TEM圖像顯示姜黃素脂質體粉劑復溶后為球形,具有多層結構,在整個圖像中均勻分布。這一現象表明,姜黃素脂質體的成功制備且其粉劑具有良好的溶解性。綜上,選用10%磷脂添加量的姜黃脂質體粉進行后續研究。

圖3 10%磷脂含量姜黃脂質體粉復溶后的微觀結構Fig.3 Microstructure of redissolved turmeric liposomes powder with 10% phospholipid addition

2.2 貯藏穩定性分析

貯藏穩定性分析可為樣品有效期的確定提供必要的數據支持。實驗過程中考察了姜黃脂質體粉在加速貯藏過程中的外觀、含量、包封率、休止角、崩潰角、松密度及實密度等指標的變化情況。如圖4所示,40 ℃加速貯藏3個月,姜黃脂質體粉顏色變化不明顯,粉體未出現結塊現象。姜黃素含量輕微下降,從(60.80±0.15) mg/mL降低至(55.12±0.55) mg/mL,這可能是因為長時間高溫使少量姜黃素發生了降解[25]。但經3個月的加速貯藏后,姜黃脂質體粉包封率數值從0月的98.1%降低至3月的91.1%,結果顯示有所下降但基本穩定,表現出優秀的姜黃素包封和保留能力。SILVA等[26]所制備的姜黃脂質體粉在儲存60 d后僅有80%的保留率。加速3個月休止角、崩潰角、松密度及實密度無明顯變化且從這些數值上可以看出姜黃脂質體粉具有良好的粉體學特性(表1)。綜上,姜黃脂質體粉具有良好的貯藏穩定性,能為更好的發揮其功效奠定基礎。

表1 姜黃脂質體粉含量、包封率、休止角、崩潰角、松密度及實密度隨加速貯藏時間的變化Table 1 Changes in curcumin liposome powder content, encapsulation rate, repose angle, collapse angle, bulk density, and true density over accelerated storage time

a-初始;b-40 ℃加速貯藏3個月圖4 10%磷脂含量姜黃脂質體粉初始和40 ℃加速貯藏3個月的表觀圖Fig.4 Appearance of turmeric liposomes powder with 10% phospholipid content after accelerated storage at 40 ℃ for 3 months

2.3 模擬體外消化特性

為了考察姜黃脂質體粉中姜黃素的吸收性能,本研究采用模擬體外消化方法,以姜黃原料和商業高吸收姜黃作為對照,測定各樣品在消化過程中的外觀變化和姜黃素的生物可及性。

在經過每個胃腸道階段后,各樣品的外觀有一些差異(圖5-a)。姜黃原料自身晶體顆粒較大具有較強疏水性,當其加到水中之后會浮在水面上。與之相反,商業高吸收姜黃和姜黃脂質體粉可以和水均勻混合。當在胃和腸消化結束后,可以發現消化液底部仍有很多未被消化的姜黃原料。相較之下,商業高吸收姜黃和姜黃脂質體粉均勻分散在胃液和小腸液中,表明姜黃原料在未經處理時的吸收性能較差。圖5-b的生物可及性結果也證實了這一點,姜黃原料的生物可及性<1%,幾乎不能被吸收利用[8]。而商業高吸收姜黃和姜黃脂質體粉顯著改善了姜黃素的生物可及性(P<0.05),其中商業高吸收姜黃約為姜黃原料的4倍,姜黃脂質體粉約為姜黃原料的11倍,說明通過高壓均質技術制備的脂質體成功將姜黃素包埋。綜上,脂質體包埋對姜黃素生物可及性的改善有積極意義。

a-模擬體外消化表觀圖;b-姜黃素生物可及性圖5 模擬體外消化表觀圖和姜黃素生物可及性Fig.5 Apparent images of simulated in vitro digestion and bioaccessibility of curcumin

2.4 動物實驗

在模擬體外消化的基礎上,進一步研究其在大鼠口服灌胃后的吸收性能。大鼠按照100 mg/kg姜黃素計量灌胃姜黃原料,商業高吸收姜黃及姜黃脂質體粉后,如表2所示,血清中總姜黃素(包含姜黃素和姜黃素代謝產物姜黃素葡萄醛酸)曲線下面積(area under curve,AUC)分別為2 095.68,16 968.18和4 105.80 (ng·h/mL),姜黃脂質體粉中總姜黃素AUC是姜黃原料的8.1倍,是商業高吸收姜黃的4.13倍。血清中姜黃素代謝產物(以姜黃素葡萄醛酸計)AUC分別為1 865.97,17 998.18、4 028.7 ng·h/mL,姜黃脂質體粉中姜黃素代謝產物AUC是姜黃原料的9.65倍,是商業高吸收姜黃的4.47倍。如圖6-a所示,姜黃原料、姜黃脂質體粉和商業高吸收姜黃均可以進入血液,但從圖6-b可以看出姜黃脂質體粉的姜黃素葡萄糖醛酸濃度顯著高于姜黃原料和商業高吸收姜黃,可能是高壓均質處理使姜黃脂質體粉的粒徑更小,更容易被腸道吸收進血液,這也與模擬體外消化結果一致。因此,采用高壓均質技術制備的姜黃脂質體粉能夠顯著地改善姜黃素在大鼠體內的藥動力學過程,從而有效地提高了姜黃素的生物利用度,提高其口服吸收性能。

表2 三種樣品主要藥動力學參數比較Table 2 Comparison of the main pharmacokinetic parameters among three samples

a-姜黃素;b-姜黃素葡萄醛酸;c-總姜黃素圖6 大鼠灌胃后各樣品姜黃素,姜黃素葡萄醛酸和總姜黃素血藥濃度-時間曲線圖Fig.6 Blood concentration-time curves of curcumin, curcumin glucuronide, and total curcuminoids in rats after oral administration of different samples

3 結論

本研究采用高壓均質技術制備高負載姜黃脂質體粉,探究了磷脂添加量對脂質體粒徑、電位、微觀結構等理化性質的影響,評價其貯藏穩定性并以姜黃原料和市售中高吸收姜黃行業標桿品牌物料作為對照組研究其體外和體內吸收性能。結果表明姜黃脂質體粉具有良好的儲存穩定性,表觀、含量、包封率和其他粉體數據無顯著變化。模擬體外消化實驗結果表明,脂質體包封可顯著改善姜黃素的生物可及性,且高于商業高吸收姜黃。動物實驗結果表明,姜黃脂質體粉總姜黃素AUC是姜黃原料的8.1倍,是商業高吸收姜黃的4.13倍,姜黃脂質體粉顯著提升了姜黃素的口服吸收性能。綜上,采用高壓均質及噴霧干燥技術制備的姜黃脂質體粉是實現姜黃素高負載及高吸收的有效手段,對姜黃相關產品的開發具有重要意義。需要指出的是,本研究中藥代動力學數據由于大鼠個體代謝存在差異等原因而存在一定的數據偏差,我們計劃在后續研究中進一步擴大實驗動物的樣本量以減少個體差異所帶來的影響。此外,我們將致力于推進臨床試驗,通過人體實驗進一步確認和完善該研究成果,旨在確保所得結論的精確性和穩定性,以期為人類健康做出更大的貢獻。