羧甲基化柑橘果膠的體外模擬消化及益生元作用

梁美香,楊可,李康杰,黎柏輝,姜鐵民,李霞*

1(桂林理工大學醫院,廣西 桂林,541000)2(桂林理工大學 化學與生物工程學院,廣西 桂林,541000)

益生元是人體無法消化吸收的食物成分,多為多糖、寡糖或其他天然植物成分,可促進宿主體內活性微生物的生長或繁殖[1]。益生元具有改善免疫調節、抵抗病原體、影響新陳代謝、增強健康的作用,還具有調整腸道微生態、促進鈣的吸收以及降血脂的功能,能夠對宿主造成有益的影響[2]。此外,益生元在腸道經過益菌微生物發酵后,能夠產生短鏈脂肪酸、維生素和其他碎片分子[3]。

柑橘類水果是最普遍被食用的一種世界大宗型水果,其中含有大量有益的次生代謝產物[4]。柑橘果皮作為柑橘加工的主要副產物,占鮮果的1/3左右,通常不會被利用,造成環境污染。然而,柑橘皮含有大量的生物活性成分,如類黃酮、類檸檬素、精油和果膠[5]。其中柑橘果膠(citrus pectin,CP)是從柑橘屬水果中提取的一種酸性雜多糖,其分子質量為50～300 kDa。果膠豐富的結構特性賦予其多樣化的生物功能,如抗氧化、抗炎、生物活性傳遞、抗癌、益生元、吸附重金屬等[6-7]。柑橘果膠分子質量巨大,雖然具有高度多樣性的結構,但溶解性較低,導致其生物利用度下降[8]?；瘜W修飾法通過化學方法將其他活性基團引入多糖鏈,增強天然多糖生物活性,是解決天然多糖水溶性差和生物活性低的常用方法,其中成本低、反應產物無毒性的羧甲基化修飾是提高多糖水溶性最常用的化學修飾方法[9]。李雪暉等[10]制備的羧甲基化南瓜多糖具有更強的抗氧化能力且能提高其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。TANG等[11]制備的羧甲基化廣金錢草多糖顯著提高原多糖的抗氧化能力與修復受損細胞能力。李霞等[12]制備的羧甲基化木聚糖具備更為顯著的益生元作用。然而,關于羧甲基化CP的生物活性相關研究鮮有報道。本實驗以CP為原料,探究羧甲基化柑橘果膠(carboxymethyl citrus pectin,CCP)對4種益生菌的益生元作用,在醫藥保健等領域開發新一代益生元產品、充分利用農業食品廢棄物和改善環境方面具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

CP、低聚果糖(fructo-oligosaccharides,FOS),上海源葉生物科技有限公司;嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)GIM1.540、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)GIM1.155、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)GIM1.191、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)GIM1.773,廣東省微生物菌種保藏中心;MRS培養基、二硝基水楊酸、氯乙酸、NaOH、α-淀粉酶、胰蛋白酶及其他試劑,分析純,市售。

SQP電子天平,賽多利斯科學儀器有限公司;UV760CRT型紫外可見分光光度計,上海傲譜分析儀器有限公司;LRH-250-Z振蕩培養箱,韶關市泰宏醫療器械有限公司;3 500 Da透析袋,北京瑞達恒輝科技發展有限公司;Nicolet IS10型傅立葉紅外光譜儀,美國Thermo Fisher公司;LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫療器械有限公司;ALPHA1-2 LD冷凍干燥機,德國Martin Christ 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CCP的制備

在50 mL異丙醇和20 mL 5 mol/L的NaOH溶液中加入0.24 g CP,在冰浴條件下攪拌3 h。在50 mL異丙醇與20 mL 5 mol/L的NaOH溶液中加入6 g氯乙酸,攪拌均勻。將NaOH-氯乙酸溶液緩慢滴入反應體系,于60 ℃條件下攪拌3 h,結束反應。待溶液冷卻至室溫,以1 mol/L的HCl溶液調至pH 7.0,蒸餾水透析24 h。減壓濃縮后凍干,制得CCP[12]。

1.2.2 取代度的測定

取代度測定采用滴定法[13],取10 mg CCP溶于3 mL 70%(體積分數)乙醇,靜置5 min后將10 mL蒸餾水、50 mL 0.5 mol/L NaOH溶液依次加入其中。待樣品完全溶解,以0.5 mol/L HCl溶液滴定,采用酚酞顯示點,計算1 g CCP所需HCl的毫摩爾數(A),計算如公式(1)所示:

A=[V0c0-(V2-V1)c]/m

(1)

式中:V0,消耗NaOH的體積,mL;V1,空白樣品測定消耗HCl的體積,mL;V2,樣品測定消耗HCl的體積,mL;c0,加入的NaOH濃度;c,加入的HCl濃度,mol/L;m,測定所用樣品的質量,g。

CCP取代度(degree of substitution,DS)計算如公式(2)所示:

DS=0.162A/(1-0.058A)

(2)

式中:A,1 g樣品所需HCl的物質的量,mmol。

1.2.3 傅里葉變換紅外光譜檢測

以1∶100(質量比)稱取CP和CCP分別與KBr混合研磨,壓片,在4 000～400 cm-1波長處對樣品進行紅外光譜掃描。

1.2.4 模擬人體抗消化性實驗

模擬唾液消化的測定。取0.191 g NaCl、0.373 g KCl、0.033 g CaCl2溶于250 mL水,用1 mol/L的HCl溶液將混合溶液pH值調至6.9得到模擬唾液。稱取α-淀粉酶0.086 g加入100 mL模擬唾液中溶解,磁力攪拌20 min后用漏斗過濾,濾液中再加入100 mL的模擬唾液溶液混勻。分別配制1 mg/mL CCP、CP和FOS溶液,按照V(多糖溶液)∶V(模擬唾液)=1∶1添加模擬唾液,于37 ℃恒溫振蕩器中反應,以模仿口腔環境。在0 h和0.5 h采集樣品,沸水浴5 min使α-淀粉酶滅活。還原糖的測定采用二硝基水楊酸比色法,總糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[14]。根據公式(3)計算水解度。

水解度/%=A/(B-C)×100

(3)

式中:A,某時間點取樣測得的還原糖含量,g/L;B,溶液中的總糖含量,g/L;C,模擬消化前的還原糖含量,g/L。

模擬胃液消化的測定。緩沖溶液的配制:稱取2.06 g Na2HPO4,3.59 g NaH2PO4,2 g NaCl,0.05 g KCl,0.025 g CaCl2·2H2O,0.045 g MgCl2·6H2O,溶于250 mL蒸餾水。以1 mol/L HCl溶液將3份上述緩沖液的pH值分別調至1、2、3得到不同pH下的模擬胃液。在10.0 mL不同pH下的模擬胃液中分別加入100 mg CCP、CP和FOS,37 ℃恒溫水浴加熱。在反應進行至4 h和6 h時,3組樣品溶液中各取1.0 mL反應溶液測定還原糖和總糖的含量。根據公式(3)計算水解度。

模擬小腸液消化的測定。取3.4 g KH2PO4溶于200 mL水中,用4 g/L的NaOH溶液調pH值至6.8。稱取胰蛋白酶2.5 g,溶至調節pH后的溶液中并定容至250 mL,使胰蛋白酶的終質量濃度為0.01 g/mL,置于36 ℃恒溫水浴攪拌混勻得到模擬小腸液[12]。

配制1 mg/mL CCP、CP和FOS溶液,將多糖溶液與模擬小腸液1∶1(體積比)混合均勻,在反應進行至4 h和6 h時,3組樣品溶液中各取1.0 mL反應溶液測定溶液中的還原糖和總糖的含量。根據公式(3)計算水解度。

1.2.5 CCP對腸道益生菌生長速率的影響

取200 μL甘油保存的菌種接種于液體培養基中37 ℃培養48 h,活化2次。配制CCP、CP和FOS質量濃度分別為5、10、15、20、30 g/L的液體培養基,分別接種1%充分活化的菌懸液,在37 ℃條件下培養48 h后檢測培養基中菌懸液的OD600值和pH值[15],以FOS作為陽性對照。配制最佳濃度的CCP和相同濃度的CP、FOS培養基,分別接種1%充分活化的菌懸液,37 ℃下振蕩培養48 h。前24 h間隔2 h,后24 h間隔6 h,于無菌環境下檢測菌懸液pH值并取100 μL菌懸液轉移至比色皿中測定OD600值,實驗以FOS作為陽性對照。以培養時間為橫坐標,OD600值為縱坐標,繪制4種益生菌生長曲線,擬合曲線方程,計算益生菌的最大生長速率和延滯期。以時間為橫坐標,pH值為縱坐標,繪制微生物產酸曲線。

1.3 數據分析

所有實驗重復3次,實驗結果均以平均值±標準誤差的形式表示,采用Origin 9.8軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 紅外光譜結果分析

圖1 羧甲基化柑橘果膠紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of carboxymethylated citrus pectin

2.2 CCP對抗消化性實驗結果分析

2.2.1 CCP模擬唾液消化實驗結果分析

如表1所示,在模擬唾液消化實驗中,FOS、CP和CCP在反應0.5 h后測得的水解度分別為5.66%、2.18%、2.61%,CPP在模擬唾液中的水解度高于CP,可能是CP經過羧甲基化修飾后分子質量變小,溶解度增加,導致其水解度有了小幅度的上升,但仍低于FOS,較低的水解度說明CP經過羧甲基化修飾后在抵抗模擬唾液消化方面仍具有良好的作用。

表1 CCP在模擬唾液、胃液和小腸液中的水解度 單位:%Table 1 CCP hydrolysis degree in simulated salivary, gastric and intestinal conditions

2.2.2 CCP模擬胃液消化實驗結果分析

人體胃酸的pH值一般為1～3,食物進入胃之后停留時間為4～6 h[18]。CCP要作為益生元被腸道益生菌所利用,必須經過胃部的消化才能到達腸道。設計實驗模擬pH 1～3的胃液,對CCP進行4～6 h的模擬消化反應,分析CCP在益生元方面的潛力。如表1所示,在反應4 h時,CCP在pH 3的模擬胃液中水解度高于pH 1,但在反應6 h后,pH 3條件下的CCP水解度與反應4 h時相仿,在pH 1的模擬胃液中,CCP的水解度達到了最高,總的來說,隨著反應時間的延長與pH值的降低,CCP在模擬胃液中的水解度呈上升的趨勢。模擬胃液pH值為1時,在反應6 h后,FOS、CP和CCP的水解度均達到最大值,分別為3.22%、5.53%和5.62%。CCP在模擬胃液環境中水解度低于6%,說明其能較好地抵抗胃液的消化。結果與余茂元[19]的抗消化性實驗結果一致。

2.2.3 CCP模擬小腸液消化實驗結果分析

如表1所示,在模擬小腸液消化實驗中,FOS、CP和CCP在反應4 h和6 h的水解度分別為3.11%、3.36%、1.09%和3.54%、3.77%、1.78%。CCP的最大水解度低于2%,且低于FOS和CP,表明CP在經過羧甲基化修飾后在小腸消化環境中具有更好的抗消化性。綜上所述,在模擬人體對抗消化性實驗中,CCP證明了其擁有較好的抵抗人體唾液、胃液和小腸液消化的能力。

2.3 CCP對益生菌增殖的影響

如圖2所示,將不同質量濃度FOS、CP和CCP添加至4種益生菌液體培養基培養48 h后,所有培養基的OD600值都出現了不同程度的上升,說明培養基中活細菌數量在增大,細菌能夠分解利用3種樣品進行增殖。在以CCP為碳源的培養基中,植物乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌在5～30 g/L隨著質量濃度增大OD600值也在不斷增大,3種益生菌的增殖最佳質量濃度都為30 g/L。在短乳桿菌培養基中,OD600值在5～15 g/L隨質量濃度升高而增大,在15 g/L達到最大值后OD600值不再上升,因此對短乳桿菌來說,15 g/L是其增殖的最佳質量濃度。這也證明了多糖添加量并不是越多越好,可能是當多糖添加量過大,多糖濃度過高時,會導致液體培養基的滲透壓過高,進而導致細菌脫水死亡,抑制了細菌的增殖[18]。在CCP的最佳濃度下,可以看出以CCP為碳源的培養基OD600值與FOS組相仿,高于CP組,說明CP經過羧甲基化修飾后,能夠更加便于被益生菌分解利用,從而促進益生菌的增殖。

a-短乳桿菌;b-植物乳桿菌;c-德氏乳桿菌保加利亞亞種;d-嗜熱鏈球菌圖2 不同濃度CCP多糖對益生菌生長的影響Fig.2 Effects of different concentrations of CCP polysaccharides on the growth of probiotics

如圖3所示,以CCP為碳源的培養基中,短乳桿菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌分別在培養18、24、20、22 h后細菌濃度達到最大值。隨著培養時間加長,細菌濃度上下浮動,但變化不大。在相同濃度下,CCP對4種益生菌促進增殖的效果高于CP,這說明CCP對益生菌的生長有良好的促進作用,是一種具有發展潛力的益生元,這與探索CPP最佳濃度對益生菌增殖影響的實驗結果一致。

a-短乳桿菌;b-植物乳桿菌;c-德氏乳桿菌保加利亞亞種;d-嗜熱鏈球菌圖3 最佳濃度多糖對益生菌增殖的影響Fig.3 Effect of optimal concentration of polysaccharide on the proliferation of probiotics

CCP對益生菌的增殖作用高于CP,低于FOS,可能有以下幾種原因:1)聚合度低的多糖作為碳源更容易被益生菌分解利用,而聚合度低的多糖一般分子質量較小,所以聚合度低的FOS對4種益生菌的增殖效果比CP和CCP明顯[20],而羧甲基化修飾過程中存在使得多糖部分降解的可能[21],使得CCP分子質量變小。2)羧甲基為親水基團,能夠提升多糖的親水性,使多糖溶解度增加并提升多糖活性,使得CCP更好地被益生菌分解利用,所以其益生元作用要優于CP[17]。但多糖的益生元作用不僅僅受聚合度以及水溶性的影響,多糖的結構、組成、提取方式或純度都會對其益生元作用造成一定的影響,所以CCP的益生元效果優于CP的具體原因有待進一步研究。

益生菌在利用糖類物質生長代謝時,會產生酸性代謝產物,引起培養基pH的變化。從圖4的pH值變化曲線可以看出,3種多糖培養基在培養12～20 h出現了pH值大幅下降,說明此時菌體的生長旺盛,酸性代謝產物開始大量產生,在20～30 h達到最大。20 h之后細菌生長達到生長穩定期,pH值基本保持不變。在圖4中可以看出,在pH值穩定后,FOS培養基pH值最低,CCP培養基pH值次之,CP培養基pH值最低,證明CCP能夠更好地被益生菌分解利用。

a-短乳桿菌;b-植物乳桿菌;c-德氏乳桿菌保加利亞亞種;d-嗜熱鏈球菌圖4 四種益生菌生長48 h pH值變化Fig.4 pH value changes of four probiotics in 48 hours

3 結論

本研究制得CCP,通過模擬人體消化實驗和益生菌增殖影響實驗,探究其在人體消化環境中的抗消化性和其對4種人體常見腸道有益菌的益生元作用。紅外光譜圖分析表明CP羧甲基化修飾成功;模擬人體消化實驗結果表明,CCP在模擬唾液、胃液和小腸液中的水解度分別低于3%、6%和2%,證明其在人體消化道具有較好的抗消化性,能順利進入腸道被腸道益生菌分解利用;CCP促進短乳桿菌增殖的最佳質量濃度為15 g/L,對另外3種實驗益生菌為30 g/L,在培養4種不同益生菌的培養基中,測得OD值有不同程度的上升,pH值有不同程度的下降,CCP對4種益生菌的促進增殖作用弱于FOS,但優于CP,表明CP在經過羧甲基化修飾后能夠更好地被腸道益生菌分解利用。研究可知,羧甲基化CP在對人體腸道益生菌的促進增殖作用優于CP,是一種具有發展潛力的益生元,大量的柑橘果皮資源使得羧甲基化CP在醫藥保健等領域開發新一代益生元產品具有極大地潛力,同時在充分利用農業食品廢棄物和改善環境方面具有重大意義。