丁香酸多孔淀粉酯的制備與表征

陳瑞喜,馬云翔,李建剛,張曉萌,周治屹,陳金鳳,汪月,張盛貴*

1(甘肅農業大學 理學院,甘肅 蘭州,730070)2(甘肅農業大學 食品科學與工程學院,甘肅 蘭州,730070)

淀粉具有良好的生物相容性和生物降解性,可作為運輸功能分子理想載體使用[1]。但是,天然馬鈴薯淀粉(native starch, NS)顆粒較差的孔隙結構,限制了對目標物質的吸附和運輸方面的潛力[2]。多孔淀粉(porous starch, PS)作為一種通過物理、化學或酶處理獲得的具有蜂窩狀孔洞的變性淀粉,與NS相比,其表面及內部形成了大量的孔洞,這種結構顯著增加了比表面積和總孔隙體積[3]。在醫藥、食品等行業中,PS可用于對目標物質的轉運、控釋以及對光、氧化或高溫敏感分子的保護。WU等[4]用多孔淀粉微球泡沫對疏水性較高的洛伐他汀進行吸附,與商業膠囊相比,多孔淀粉為載體時可顯著提升洛伐他汀的溶解性和生物利用度。

丁香酸(syringic acid, SA)是水果、蔬菜以及谷物中常見的酚酸類化合物,在植物中通過莽草酸途徑合成[5],其具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗內毒素等生物活性[5],在預防疾病(如糖尿病、心血管疾病、癌癥、腦缺血)等方面具有廣泛的治療應用。SA的多種生物醫學活性主要取決于芳香環上羥基(—OH)和甲氧基(—OCH3)的存在,取代的數量和位置決定了其作用的廣泛范圍和效力[6]。目前,SA與多糖的研究主要集中于殼聚糖成膜性方面的改善。YANG等[7]通過把不同濃度的SA加入到殼聚糖薄膜中制備復合膜,發現SA對復合膜的力學性能和抗菌性能均有影響;LIU等[8]把不同結構羥基苯甲酸接枝到殼聚糖上,結果發現沒食子酸接枝殼聚糖薄膜具有最高的紫外線和濕氣阻隔、機械和抗氧化性能。淀粉和殼聚糖都是可生物降解性、安全性較高的生物質材料。與殼聚糖相比,多孔淀粉具有良好的包埋能力,且其孔隙、孔道和空腔的存在使更多的羥基暴露,增加了與SA分子作用的敏感性,使酯化反應易于發生。因此,綜合多孔淀粉良好的包埋能力和酚類物質的生物活性,研究酚類物質對淀粉改性,使淀粉攜帶酚類功能,制備具有轉運、控釋和保護活性物質功能的材料,是當前的研究熱點。

本研究以溶劑交換法制備出納米級孔結構PS為反應主體,SA為客體,在有機體系中對PS進行酯化改性,旨在制備高取代度且具備大量孔隙結構的丁香酸多孔淀粉酯(syringic acid porous starch ester, SA@PS),并對其結構性能進行表征,為改性淀粉作為載體材料提供一個可行的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

異丙醇,二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO),天津市北辰方正試劑廠;馬鈴薯淀粉、丁香酸、N,N′-羰基二咪唑、DMSO-d6(純度≥99.9%)、DPPH,上海麥克林生化科技有限公司;所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

B11-2型恒溫磁力攪拌水浴鍋,上海司樂儀器有限公司;HXLG-10-50B型真空冷凍干燥機,上海滬析實業有限公司;JSM-6701F型冷場發射型掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM),日本電子光學公司;ASAP 2020型全自動比表面積及孔隙度分析儀,美國麥克公司;NEXUS 670型傅里葉紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR),美國Thermo公司;AVance NEO型600 MHz核磁共振波普儀,德國布魯克科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 馬鈴薯多孔淀粉的制備

參考CHANG等[9]的方法稍作修改,稱取馬鈴薯淀粉10.0 g并加入100 mL去離子水,放置于磁力攪拌水浴鍋中溫度設為40 ℃攪拌20 min形成均勻分散的淀粉懸浮液,然后持續升溫到90 ℃并攪拌1 h淀粉完全糊化,4 ℃下貯存72 h形成淀粉凝膠,將淀粉凝膠切成立方體小塊(0.6～0.8 cm3),浸入無水乙醇(200 mL×6次,每次1 h)置換后冷凍真空干燥,研磨備用。

1.3.2 丁香酸多孔淀粉酯的制備

參考HAN等[10]和WEN等[11]的方法并改進,采用兩步法合成丁香酸多孔淀粉酯(合成路線如圖1所示)。第一步:將等摩爾的丁香酸和CDI加入至100 mL單口平底燒瓶中,再加入25 mL DMSO,置于恒溫磁力攪拌油浴鍋中,燒瓶在60 ℃、N2氣氛下加熱15 h,生成丁香酸咪唑化合物。取1.0 g多孔淀粉加入到丁香酸咪唑化合物中,混合物在75 ℃、N2氣氛下磁力攪拌反應7 h后停止。第二步:反應物用異丙醇多次洗滌離心(6 000 r/min,10 min),沉淀物裝入透析袋(截留分子質量為8～14 kDa)中用DMSO透析24 h,然后用異丙醇再進行透析48 h后,進行真空冷凍干燥,得到丁香酸多孔淀粉酯(SA@PS)。

圖1 丁香酸多孔淀粉酯的合成路線圖Fig.1 The synthetic route of preparing SA@PS

1.3.3 N2-吸附/脫附等溫線測定

低溫N2吸附法是測定多孔材料孔隙度最常用的方法之一,采用非定域密度泛函理論,從多孔淀粉的吸附數據中得到孔徑的尺寸分布曲線。依據Brunauer-Emmett-Teller(BET)多層吸附理論計算樣品的比表面積。

1.3.4 取代度的測定

丁香酸多孔淀粉酯的取代度(degree of substitution, DS)參考KAPUSNIAK等[12]的方法稍作修改。在1H NMR譜圖中,4.58～5.50 ppm的峰對應于淀粉脫水葡萄糖單元(anhydro glucose unit, AGU)的4個質子的信號,而SA@PS結構中的甲氧基(—OCH3)質子信號峰在3.83 ppm左右處[13]。因此,取代度由3.83處甲氧基的3個質子峰面積與4.58～5.50淀粉脫水葡萄糖單元中1號位氫和2、3、6號位羥基的質子峰面積和之比計算而來。計算如公式(1)所示:

(1)

式中:Isignal、3分別是樣品在3.83處的峰面積、質子數;IAGU、4分別是淀粉在4.58～5.50的4個質子的峰面積之和、質子數。

1.3.5 SEM表觀形態觀察

利用SEM觀察不同倍數下樣品的表觀形態特征。將樣品座置于離子濺射儀中鍍金60 s后,加速電壓為5 kV時觀察。

1.3.6 FT-IR測定

FT-IR測定采用KBr壓片法。將樣品與KBr按1∶50(mg∶mg)的比例混合均勻,反復碾磨至無顆粒感后壓片,在4 000～500 cm-1進行掃描測定。

1.3.7 液態核磁分析

在使用600 MHz核磁共振氫譜儀(1H NMR)測定之前,稱取一定量樣品于核磁管中,加入DMSO-d6,在75 ℃下超聲波處理30 s使淀粉樣品充分溶解并去除溶解氧對實驗的影響,使用TXISz探針(8 μs 90°脈沖,重復時間15.07 s,包括采集時間3.07 s和松弛延遲12 s),測量溫度25 ℃。所有化學位移以百萬分之幾(ppm)為單位報告,使用通常用作核磁共振測量內部標準的四甲基硅烷信號作為參考。

1.3.8 X-射線衍射測定

使用多晶粉末X射線衍射儀(X-ray diffraction, XRD)來測定樣品的晶體結構,掃描范圍為10°～40°。

1.3.9 DPPH自由基清除活性測定

將PS和不同取代度的SA@PS均勻分散在4 mL的DPPH乙醇溶液中(0.2 mmol/L),并制備一系列質量濃度梯度(0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL)。將制備好的樣品渦漩振蕩3 min后,在室溫條件下,黑暗環境中反應30 min進行測定,以無水乙醇為空白對照,混合物的吸光度在517 nm處測定[14]。樣品的DPPH自由基清除活性的計算如公式(2)所示:

(2)

式中:A1,樣品吸光值;A2,乙醇溶液代替DPPH溶液所測吸光值;A0,空白樣品吸光值。

1.4 數據分析與處理

利用Origin 2018和SPSS 25軟件進行處理和分析數據。

2 結果與分析

2.1 SEM形態結構分析

如圖2所示,NS顆粒在形狀和大小上表現出很大的差異,淀粉顆粒形狀呈球形或橢圓形,顆粒表面光滑,觀察不到孔隙或裂縫(圖2-a);經溶劑交換法制備得到的PS表面粗糙、不規則、呈蜂窩狀(圖2-b)。馬鈴薯淀粉經高溫糊化、冷凍之后,大量的水分子變成冰晶被固定在淀粉凝膠中,經乙醇置換、干燥揮發后,從而形成表面孔隙及內部的孔結構,這提供了大的比表面積和總孔隙體積,同時也增加了與化學基團或酶反應的可能性[15]。多孔淀粉經過酯化改性后,顆粒形狀不規則,相互堆積。低DS的SA@PS-1(圖2-c)孔大小不一,分布不均勻,與圖2-c、圖2-d相比,高取代度淀粉酯(圖2-e)的孔呈蜂窩絮狀結構,這是由于淀粉表面及顆粒內部發生了酯化反應,從而影響其外觀形態。

a-NS(500×);b-PS(5 000×);c-FA@PS-1(5 000×);d-FA@PS-2(5 000×);e-FA@PS-3(5 000×)圖2 馬鈴薯淀粉、多孔淀粉和丁香酸多孔淀粉酯的SEM圖Fig.2 SEM images of native starch、porous starch and SA@PS

2.2 多孔淀粉的BET分析

為表征制備材料的孔徑,采用Barret、Joyner和Halenda(BJH)理論計算了孔隙分布,根據國際純粹與應用化學聯合會將孔隙分為三大類:微孔(<2 nm)、介孔(2～50 nm)、大孔(>50 nm)。如圖3-a所示,PS的平均孔徑為18.03 nm,表明所制備的PS可歸屬于介孔材料范疇。參照王宇霞等[16]NS的比表面積僅為0.02 m2/g,經溶劑交換法制備的PS的表面積達到了14.69 m2/g(圖3-b)。但是,多孔淀粉經過酯化之后,SA@PS-3(圖3-d)比表面積為7.64 m2/g,這表明酯化過程中破壞了原來的孔結構,且平均孔徑(圖3-c)由原來的18.03 nm減小為13.88 nm。

a-孔徑大小;b-多孔淀粉BET;c-SA@PS-3孔徑;d-SA@PS-3比表面積圖3 多孔淀粉和多孔淀粉酯的孔徑分布及BET表面積圖Fig.3 Pore diameter distribution and BET surface area plots of PS and SA@PS-3

2.3 丁香酸多孔淀粉酯取代度分析

DS是指淀粉聚合物的每個AUG被反應試劑取代的羥基數[17]。實驗中設定不同反應底物比例(表1),用1H NMR譜圖對取代度進行定量分析。如表1所示,SA@PS的取代度隨著SA/PS摩爾比例的增大而增加,這可歸因于丁香酸濃度增加,另一方面PS的孔結構以及內部的空腔暴露出更多的活性位點與丁香酸發生化學反應,使丁香酸分子靠近主體PS的可能性增大,進而提升了反應效率。這與LU等[18]在混合離子液體中脂肪酶催化合成棕櫚酸淀粉酯的結果相似。

表1 丁香酸多孔淀粉酯的取代度Table 1 Degree of substitution of SA-PS

2.4 1H NMR液態核磁分析

圖4顯示了溶解在d6-DMSO中PS(圖4-a),SA(圖4-b),以及SA@PS-3(圖4-c)的核磁共振氫譜圖。質子在3.64 ppm的1H化學位移歸屬于H-3,3.57 ppm歸屬于H-5,3.31 ppm歸屬于H-2,3.15 ppm歸屬于H-4,H-1和OH-2、3、6位的化學位移被指定為4.58～5.50 ppm的峰[19];而2.5 ppm和3.3 ppm分別對應的是溶劑d6-DMSO和水的質子峰[20](圖4-a)。相比PS,SA@PS-3的1H NMR譜有額外的信號,包括7.36～7.54 ppm(苯環上的亞甲基質子)的多重信號,3.83 ppm的強峰[13](—OCH3,圖4-c)。這些附加信號的存在證實了PS和SA已成功合成。此外,指定給—COOH的峰為12.62 ppm的SA(圖4-b)在SA@PS-3不存在,表明未反應的SA從目標產物中完全脫除。

a-PS;b-SA;c-SA@PS-3圖4 多孔淀粉、丁香酸及丁香酸多孔淀粉酯的核磁共振氫譜圖Fig.4 1H NMR images of PS、SA and SA@PS-3

2.5 紅外光譜分析

圖5 多孔淀粉和不同取代度丁香酸多孔淀粉酯的紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectra of PS、SA@PS of different degree of substitution

2.6 X-衍射分析

NS、PS和不同取代度的SA@PS進行XRD分析(圖6)。NS的X射線衍射圖顯示出典型的B型晶體結構特征,分別在15.2°、17.1°、22.5°處有3個較強的特征衍射峰[22]。PS的圖譜中觀察到無定形分散的寬峰,這可能是PS制備過程NS經高溫糊化、淀粉晶核熔化,破壞了分子之間的氫鍵,使更多的淀粉分子長鏈發生分離,導致淀粉結構分解程度增加,最終呈現為單一的、非晶態的衍射峰[23]。而SA@PS在12.8°、19.2°、26.6°處有3個新的衍射峰,表明PS經酯化作用形成了新的晶體結構,SA@PS 3個新衍射峰的峰強度隨著取代度的增大而增強,這可能是酯化過程中短鏈直鏈淀粉發生了回生重新聚集形成了新的晶體結構,確切的形成機理有待深入研究[24]。

圖6 丁香酸、多孔淀粉及不同取代度的丁香酸多孔淀粉酯的X射線衍射圖譜Fig.6 The X-ray diffraction pattern of SA、PS and SA@PS of different degree of substitution

2.7 DPPH自由基清除能力分析

PS和不同取代度的SA@PS對DPPH自由基的清除率如圖7所示。在DPPH自由基清除實驗中,抗氧化劑能夠將穩定的DPPH自由基(紫色)還原為非自由基形式的DPPH-H(黃色)[25]。結果表明PS對DPPH自由基的清除能力非常弱;相同濃度的條件下,SA@PS對DPPH自由基的清除率隨著取代度的增加而增加,這可能由于丁香酸通過酯化反應連接到PS骨架中。當SA@PS的質量濃度為2.5 mg/mL,SA@PS-3對DPPH自由基的清除率達到最高17.68%。取代度越大說明有更多的丁香酸分子參與酯化反應,丁香酸的酚羥基能與自由基反應形成穩定的苯氧基,且兩側的甲氧基有效加強了苯氧基的穩定性[26],從而使SA@PS具備了較強的抗氧化性。

圖7 多孔淀粉和不同取代度的丁香酸多孔淀粉酯的DPPH自由基清除能力Fig.7 DPPH free radical scavenging ability of PS and SA@PS of different degree of substitution

3 結論

化學改性是一種廣泛應用于改善淀粉性能以滿足某些特定應用要求的有力手段。以溶劑交換法對NS進行多孔化改性,完全破壞了淀粉顆粒原有的表觀形貌,制備出PS 顆粒形狀不規則,表面形成了大量分布不均的孔隙結構,孔隙及內部的空腔暴露出更多的反應位點,使靠近主體分子的可能性增大,提升了反應效率,且隨著丁香酸分子濃度的增加,DS也隨之增加,表明多孔處理有利于淀粉改性反應的發生。利用CDI介導的反應將丁香酸酯化到馬鈴薯多孔淀粉上。1H NMR和FT-IR譜圖結果表明,丁香酸羧基與淀粉羥基之間通過酯鍵完成骨架連接;酯化反應后XRD顯示,SA@PS的晶體結構由PS無定形狀態在酯化過程中發生部分回生,從而形成新的晶體結構。SA@PS因攜帶了酚類物質,獲得了較強的抗氧化活性,取代度和樣品濃度與DPPH自由基的清除率呈正相關關系。制備的淀粉酯化物可用于生物活性物質的轉運、控釋和保護材料,有望在醫藥、食品等領域應用。