不同酵母發酵的白蘭地基酒在蒸餾前后的香氣分析

馬玥,吳元,張葆春,申春華,于立娜,鞏傳斌,李成林,唐柯*

1(江南大學 生物工程學院 釀造微生物與應用酶學研究室,江蘇 無錫,214122)2(煙臺張裕集團有限公司,山東 煙臺,264000)

白蘭地是世界著名的蒸餾酒之一,與威士忌、金酒、伏特加、朗姆酒以及中國的白酒共稱為世界六大蒸餾酒[1]。白蘭地起源于法國的夏朗德地區,早在19世紀90年代傳播到中國。白蘭地的成分非常復雜,其中水和乙醇占總成分98%以上,構成白蘭地最主要的成分,但不足1%的揮發性化合物決定其香氣品質[2],主要包括酯類、醇類、酸類、醛類、酮類、酚類、芳香化合物、萜類、內酯類等多種化合物,其中異丁醇、反式-β-甲基-γ-辛內酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、異戊醇、辛酸乙酯、β-大馬酮是關鍵呈香化合物[3]。盡管這些揮發性香氣成分含量很低,但卻是白蘭地香味、口感及酒體等方面特征的主要來源,其種類、含量、感覺閾值決定著白蘭地的風味和典型性[2]。在過去的幾十年里,隨著白蘭地在中國越來越受歡迎,其特色和獨特的風味開始受到消費者的更多關注。

白蘭地中的化合物的差異主要來自于葡萄原料、釀造和蒸餾工藝及橡木桶陳釀[4-5]。通常白蘭地以葡萄為原料,先經過葡萄取汁、自然發酵或加酵母發酵等過程獲得酒精度較低的白蘭地原料葡萄酒后,再經過二次蒸餾得到新蒸餾的原白蘭地,最后經過橡木桶長時間的陳釀獲得高檔成品白蘭地。在發酵過程中,酵母株的選擇對于釀造特定風味的酒至關重要,不同的酵母在從葡萄前體釋放品種揮發性化合物方面及在合成新的酵母衍生揮發性化合物方面能力不同[6],從而影響這些揮發性化合物的最終水平,造成白蘭地的品質差異。ZHAO等[7]研究了8株商用釀酒酵母對白蘭地的影響,結果表明由于使用不同酵母,白蘭地出現了不同風味。姜忠軍[8]對不同釀酒酵母在發酵過程中對有機酸、pH、香氣成分影響進行分析,得出不同酵母對白蘭地香氣和感官有不同影響。程顯好等[9]也比較分析了不同酵母對白蘭地風味的影響。

這些研究為白蘭地釀造者選擇發酵酵母提供了有用信息。而在蒸餾過程中,大部分的水會被冷凝去除,原料和發酵中的揮發性成分濃縮,此外還會有新的化合物產生,這一過程使得白蘭地香氣較大多葡萄酒更為濃郁、復雜[10]。AWAD等[11]對干邑白蘭地在蒸餾過程中的揮發性化合物變化情況進行研究分析,結果發現在一次蒸餾過程中得到的揮發性化合物對白蘭地的香氣特征起著決定性作用。TSAKIRIS等[12]研究了白蘭地在蒸餾過程中化合物的變化,結果顯示醇類和芳香物質含量明顯增多。宋普等[13]研究白蘭地中主要的芳香類化合物在蒸餾過程中的變化規律,結果顯示苯甲醛、乙酸苯乙酯和苯乙醇的含量在酒身時開始餾出,在次酒尾時含量較高,在酒頭和酒尾中含量較低。這些研究為白蘭地工藝的優化、產品品質的進一步提高提供基礎數據及理論依據。

雖然上述研究者已經對不同酵母發酵的白蘭地基酒中的揮發性化合物進行了研究,但是由于一維氣相色譜分析的共留出等限制,部分香氣化合物并未檢出。本研究基于以上內容,通過全二維氣相色譜-飛行時間質譜對樣品進行分析,以實現更全面的白蘭地香氣化合物的檢測,同時結合感官定量描述分析,探究了以不同酵母(71B、KD、F33、K1、FC9DP、D254、FC9)釀造的新疆產區的白蘭地發酵酒及其新蒸餾原白蘭地在揮發性風味物質及香氣特征的差異,從而為白蘭地釀造工藝的進一步改進提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗樣品

實驗酒樣由煙臺張裕集團有限公司提供。

樣品的生產工藝如下:原料采用2021年新疆產區白玉霓釀酒葡萄,含糖量162 g/L(發酵后酒精體積分數為8.3%～8.8%),隨后采用夏朗德壺式蒸餾器進行二次蒸餾,獲得白蘭地原酒,實驗分析中所有二次蒸餾后的白蘭地原酒酒精體積分數為68%。

1.1.2 試劑

正構烷烴(C5～C30,色譜純),美國Sigma公司;NaCl(分析純),中國國藥上?；瘜W試劑公司;乙酸苯乙酯同位素(純度>95%),美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

DVB/CAR/PDMS固相微萃取三相頭(2 cm 50/30 μm),美國默克公司;Agilent 7890 N-Pegasus 4D全二維氣相色譜-飛行時間質譜,美國安捷倫、LECO公司;DB-FFAP毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美國安捷倫公司;Rxi-17Sil MS色譜柱(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm),美國瑞思泰康(Restek)公司;多功能自動進樣系統(MPS),德國Geststel公司;SB-25-12D超聲波清洗儀,寧波新芝生物科技股份有限公司;Milli-Q 純水儀,美國Millipore公司;電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 香氣萃取方法

樣品香氣萃取由MPS2系統進行頂空固相微萃取(headspace solid phase micro extraction, HS-SPME)自動進樣分析。蒸餾酒稀釋10倍后進行香氣分析。所有酒樣取5 mL置于20 mL頂空瓶中,加入1.5 g NaCl及10 μL乙酸苯乙酯同位素(濃度為204 mg/L)作為內標。萃取溫度50 ℃,樣品平衡5 min,萃取45 min,轉速400 r/min。萃取結束后,將萃取頭置于氣相色譜(gas chromatography,GC)進樣口,在250 ℃下解吸附5 min,不分流進樣,每個樣品重復3次。

1.3.2 全二維氣相色譜-飛行時間質譜(comprehensive two-dimensional gas chromatography and time of flight mass spectrometer,GC×GC-TOFMS)分析

全二維氣相色譜(comprehensive two-dimensional gas chromatography,GC×GC)條件:起始溫度45 ℃保持3 min后,以4 ℃/min升溫至150 ℃并保持2 min,之后以6 ℃/min升溫至200 ℃,然后以10 ℃/min升溫至230 ℃并保持10 min。

飛行時間質譜(time of flight mass spectrometer,TOFMS)條件:離子源電壓70 eV,溫度230 ℃,傳輸線溫度240 ℃,檢測器電壓1 430 V,采集質量數范圍為35～400 amu,采集頻率100 spectra/s。

1.3.3 香氣化合物定性及定量分析

樣品中揮發性化合物的定性:通過LECO公司自帶ChromaTOF?工作站(version 4.44)處理數據。用于峰值拾取的分段信噪比(S/N)設置為200∶1,至少2個頂點質量。在單個色譜圖中,當二維子峰的譜圖相似度至少滿足匹配度為800且S/N≥6時可被合并為同一個峰。運用軟件的數據比較功能自動匹配相似度≥800且3個平行樣品中至少出現2次的峰作為該酒樣中存在的組分。峰的Kovats保留指數(retention index,RI)通過在相同色譜條件下用正構烷烴(C5～C30)校準獲得。經過文獻比對,篩選RI相差10以內的化合物作為最終的定性結果。與標準品色譜峰比對:對通過RI對比進一步鑒定出的化合物用標準品進行色譜峰比對,進一步驗證定性結果。揮發性化合物的半定量計算如公式(1)所示:

(1)

1.3.4 感官分析

本研究從江南大學選取12名(18～30歲,5男7女)人員組成健康評價員小組,這些評價員按照國際標準(ISO 5496:2006)招募及培訓,且通過香氣識別相關的考核與香氣標度方面的測試。參考之前課題組對白蘭地酒研究中的感官分析結果,結合小組成員討論,最終選擇13個能夠全面描述所有待測白蘭地酒樣品的特征性和差異性的香氣描述詞,如表1所示。在正式實驗前,基于13個香氣屬性對感官小組及其評價員進行評估,采用Panel check軟件[14]分析結果,結果顯示12名評價員在一致性、穩定性及區分能力上表現較好,可進行白蘭地酒樣品正式的香氣描述分析。

表1 白蘭地香氣的描述詞及其描述詞的參照物Table 1 Descriptors of brandy aroma and their references

在正式實驗時,將不同的白蘭地酒樣(10 mL)分別倒入3位隨機數字編碼的ISO標準品評杯中,樣品順序采用隨機完全區組設計,依次遞送給每個評價員。要求評價員在獨立的品評隔間里(25 ℃)對樣品進行品評。每個樣品品評時間間隔1 min,3個樣品為一輪,每輪樣品間休息10 min,以避免嗅覺疲勞。定量描述性分析采用7點標度法,其中0表示無法感知屬性強度,6表示屬性具有最高強度[15]。

1.3.5 數據處理

香氣化合物數據及感官數據通過Excel 2019進行處理;熱圖分析采用R語言(版本4.0.1)中的ComplexHeatmap數據包中的Heatmap功能來實現。主成分分析(principal component analysis,PCA)采用SIMCA 2016進行;偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)使用XLSTAT 2019進行。

2 結果與分析

2.1 不同酵母發酵后白蘭地葡萄酒基酒的香氣比較

2.1.1 香氣化合物分析

在所有樣品中共定性檢出485種揮發性化合物,結合香氣物質數據庫Flavornet(http://www.flavornet.org/flavornet.html)進行匹配,篩選出174種在酒精飲料中具有主要香氣特征化合物進一步分析。將定性后的化合物分為醇類、芳香族、酚類、呋喃類、含氮化合物、含硫化合物、內酯類、醛類、酸類、萜烯類、酮類、酯類及其他共計13類。

比較經不同酵母發酵后白蘭地葡萄酒基酒中香氣種類的差異,結果顯示(圖1),經D254酵母發酵的酒樣化合物數量較多,為102種,而經KD酵母發酵的酒樣化合物數量較少,為86種。

圖1 不同酵母發酵后白蘭地葡萄酒基酒的香氣化合物對比Fig.1 Comparison of aroma compounds in raw brandy wines after fermentation with different yeasts

對定性到的化合物進行半定量分析,結果見電子增強出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038013)。比較不同酵母發酵后白蘭地葡萄酒基酒中不同類別的香氣化合物相對含量的差異,結果顯示(表2),經不同酵母發酵的發酵酒中,芳香族化合物僅在71B、FC9DP及KD發酵酒中檢出。而其他類別的化合物含量,醇類最高的為KD,最低的為FC9DP;酚類最高的為D254,最低的為K1酵母;呋喃類最高的為FC9,最低的為K1,含硫化合物最高的為KD,最低的為D254;內酯類最高的為KD,最低的為71B;醛類最高的為FC9DP,最低的為K1;酸類最高的為KD,最低的為K1;萜烯類最高的為FC9DP,最低的為KD;酮類最高的為FC9,最低的為K1;酯類最高的為D254酵母,最低的為FC9DP。

表2 不同酵母發酵后白蘭地葡萄酒基酒香氣化合物的半定量含量 單位:μg/LTable 2 Semi-quantitative content of aroma compounds in raw brandy wines after fermentation with different yeasts

將這些不同酵母發酵的樣品中具有顯著差異的香氣化合物,根據半定量含量繪制聚類熱圖,結果如圖2所示。聚類分析根據化合物含量高低將相似的組別聚在一起。分為三大類,其中FC9DP為一類,D254和FC9聚為一類,F33、71B、K1及KD聚為一類。結果可知,添加酵母FC9DP的酒樣的大馬士酮、乙酸苯乙酯、異戊醇、檸檬烯等化合物的含量相對其他樣品較高;添加酵母D254和FC9的酒樣相比其他樣品,其酯類化合物含量較高,其中FC9酒樣的二甲基二硫及二甲基三硫2種含硫化合物在所有樣品中含量最高,而添加酵母D254的酒樣的1-戊醇、反式-2-辛烯-1-醇、反式-2-己烯酸等化合物在所有樣品中含量最高;添加酵母KD的酒樣的月桂酸甲酯、金合歡烯、2,3-丁二醇等化合物的含量相對其他樣品較高;添加71B的酒樣的苯乙酮、γ-辛內酯、β-環檸檬醛、癸醛、乙酸丁酯等化合物的含量相對其他樣品較高;添加K1的樣品乙酸香葉酯、乙酸香茅酯、十二醛、4-甲基-2-戊醇及4-乙烯基愈創木酚等化合物的含量相對其他樣品較高;添加F33酒樣的異松油烯、2,3-二甲基-3-戊醇、庚醇的含量相對其他樣品較高。

圖2 不同酵母發酵后白蘭地葡萄酒基酒香氣化合物含量的熱圖Fig.2 Heat map of the content of aroma compounds in raw brandy wine after fermentation with different yeasts

2.1.2 感官分析

采用了定量描述分析比較不同酵母發酵后白蘭地葡萄酒基酒香氣在感官上的差異并對整理后的數據做香氣輪廓圖,結果如圖3所示。結果顯示添加不同酵母發酵后的白蘭地葡萄酒基酒香氣輪廓差異較小,所有樣品都具有明顯的酵母、酸味、生青及較明顯的花香、果香、香料、果干香氣,而在尾氣、木質、焦糖、烘烤、皮革等香氣屬性上強度較低。

圖3 不同酵母發酵后白蘭地葡萄酒基酒香氣輪廓圖Fig.3 Aroma profiles of raw brandy wines after different yeast fermentation

為更方便得出添加不同酵母酒樣間所具有的香氣屬性的差異,對樣品的感官分析結果進行PCA,結果如圖4所示,前2個主成分共包含了61.5%的變量信息,結果顯示添加酵母K1及FC9的酒樣在第1主成分負方向,與酵母、酸味屬性相關;添加D254的酒樣在第1主成分正向,與果香、花香屬性相關,FC9DP在第2主成分負方向,與生青、皮革、香料、焦糖、烘烤等屬性相關;其余酒樣集中在中心區域,與木質屬性更相關。

圖4 不同酵母發酵后白蘭地葡萄酒基酒香氣的PCAFig.4 PCA of the aroma in raw brandy wine after fermentation with different yeasts

2.2 白蘭地葡萄酒基酒蒸餾后的香氣比較

2.2.1 香氣化合物分析

比較不同酵母發酵后白蘭地葡萄酒基酒蒸餾后的香氣種類的差異,如圖5所示,結果顯示重要香氣化合物檢測數量最高的酒樣所添加的酵母種類為FC9DP,共定性出的關鍵香氣化合物為107種;而添F33酵母的蒸餾后的酒樣化合物數量較少,為99種。

圖5 發酵后的白蘭地葡萄酒基酒在蒸餾后的香氣化合物對比Fig.5 Comparison of aroma compounds of raw brandy wines after fermentation and distillation

對定性到的化合物進行半定量分析,半定量結果見電子增強出版附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038013)。比較不同酵母發酵后白蘭地葡萄酒基酒蒸餾后的香氣化合物相對含量的差異,如表3所示,結果顯示添加酵母FC9DP的化合物半定量總量最高,K1的酒樣半定量含量最低。醇類最高的為FC9DP,最低的為D254;芳香族最高的為71B,最低的為KD;酚類最高的為FC9DP,最低的為F33;呋喃類最高的為KD,最低的為K1;有3個樣品在蒸餾后檢測出含氮類香氣化合物;含硫化合物最高的為KD,最低的為K1;內酯類最高的為FC9,最低的為FC9DP;醛類最高的為KD,最低的為FC9DP;酸類最高的為FC9DP,最低的為FC9;萜烯類最高的為FC9DP,最低的為D254;酮類最高的為KD,最低的為D254;酯類最高的為FC9DP酵母,最低的為K1。

表3 發酵后的白蘭地葡萄酒基酒經蒸餾后的香氣化合物的半定量含量 單位:μg/LTable 3 Semi-quantitative content of aroma compounds in raw brandy wines after fermentation and distillation

將蒸餾后檢測出的這些不同酵母發酵的樣品中具有顯著性差異的香氣化合物(電子增強出版附表2)根據半定量含量繪制聚類熱圖,結果如圖6所示。

圖6 發酵后的白蘭地葡萄酒基酒在蒸餾后的香氣化合物含量的熱圖Fig.6 Heat map of the content of aroma compounds in raw brandy wine after fermentation and distillation

聚類分析結果可以看出圖中有3類:添加酵母FC9DP為一類,添加酵母71B及KD為一類,其余酒樣為一類。其中添加酵母FC9DP的樣品在蒸餾后相較其他樣品,除了(E)-β-羅勒烯、2,3-丁二酮、2-戊醇、苯甲醛、異松油烯等之外的其他的香氣化合物含量都較高,添加酵母71B和KD的酒樣在蒸餾后相較其他樣品,各類化合物的相對含量相對較平衡,但酵母KD酒樣的苯乙烯、乙酸及乙酸丁酯含量較低。結果顯示,F33、K1、D254及FC9樣品為一類,這些樣品在蒸餾后大部分的化合物的相對含量相比FC9DP、71B及KD皆較低,但是FC9的十四酸乙酯、己酸己酯、乙酸香茅酯、3-戊醇、2-羥基苯甲酸乙酯及D254的己醛、乙酸異戊酯、檸檬醛在蒸餾后相較其他樣品較高。

2.2.2 感官分析

采用了定量描述分析比較經不同酵母發酵后白蘭地葡萄酒基酒蒸餾后香氣在感官上的差異并對整理后的數據做香氣輪廓圖,結果如圖7所示。結果顯示所有蒸餾酒樣都有強烈的乙醇、果香和較強的果干、花香氣味及微弱的生青與酸氣味。而添加不同酵母的蒸餾酒樣香氣特征的區別集中在焦糖、香料、烘烤香上,其中添加酵母FC9的酒樣在蒸餾后在焦糖、香料及烘烤香氣屬性皆最強,其次是添加FC9DP和KD的酒樣,較弱的是添加K1、F33、D254及71B的酒樣。

圖7 發酵后的白蘭地葡萄酒基酒在蒸餾后的香氣輪廓圖Fig.7 Aroma profiles of raw brandy wines after different yeast fermentations and distillation

為更方便看出經不同酵母發酵再蒸餾后的酒樣間所具有的香氣屬性差異,對樣品的感官分析結果進行PCA,結果如圖8所示,前2個主成分共包含了72.0%的變量信息,結果顯示添加酵母FC9與FC9DP的酒樣在第1主成分負向,主要與花香、果香、烘烤、果干、香料等屬性相關,且其香氣屬性相對成熟豐富;添加酵母K1分布在第1主成分正向,與尾氣、酵母屬性相關。

圖8 發酵后的白蘭地葡萄酒基酒在蒸餾后的香氣的PCAFig.8 PCA of the aroma in raw brandy wine after fermentation and distillation

2.3 白蘭地葡萄酒基酒蒸餾前后的香氣比較

2.3.1 香氣化合物分析

比較蒸餾前(圖1)及蒸餾后(圖5)檢測到的各類香氣化合物的數量差異,結果顯示蒸餾后檢測到的化合物總數量增加,但是檢測到的酯類化合物、內酯類化合物、酚類化合物及醇類化合物的種類皆減少,而檢測到的芳香族、呋喃類、酮類、萜烯類、含氮及含硫類化合物的種類增加。比較蒸餾前(表2)及蒸餾后(表3)檢測到的各類香氣化合物的相對含量差異,結果顯示由于蒸餾作用,除了酚類化合物及內酯類化合物,大部分香氣化合物的相對含量皆增加,其中酯類、醇類、酸類及萜烯類化合物增加最明顯的皆為FC9DP樣品。

將檢測出的這些不同酵母發酵的樣品中在蒸餾前后具有顯著性差異的香氣化合物根據半定量含量繪制聚類熱圖,結果如圖9所示。結果顯示蒸餾前后的樣品根據香氣化合物相對含量的分布情況可分成2類,其中所有蒸餾前的樣品聚為一類,大部分的蒸餾后的樣品聚為一類,但是蒸餾后的D254樣品在香氣化合物相對含量的分布情況更接近于蒸餾前的樣品。

圖9 發酵后的白蘭地葡萄酒基酒在蒸餾前后的香氣化合物含量的熱圖Fig.9 Heat map of the content of aroma compounds in raw brandy wine before and after distillation

2.3.2 感官分析

通過PLS-DA對定量描述分析獲得的經不同酵母發酵后白蘭地葡萄酒基酒在蒸餾前后的香氣的感官差異,結果如圖10所示,蒸餾前的香氣屬性大都集中在生青、酵母、酸味、皮革、尾氣上,而蒸餾酒香氣屬性則集中在乙醇、果香、果干、花香、焦糖、烘烤、香料上,結果顯示經過蒸餾以后,基酒香氣得到了明顯的改善,去除了生青、酸味這些不良的香氣特征,蒸餾酒的香氣更加芳香馥郁。

圖10 發酵后的白蘭地葡萄酒基酒在蒸餾前后的香氣的PLS-DAFig.10 PLS-DA of the aroma in raw brandy wine before and after distillation

3 結論與討論

在前期研究中程顯好等[9]比較了不同酵母菌對白蘭地35種揮發性成分的影響,結果顯示酵母菌株對發酵產物影響很大,尤其是對酯類成分和雜醇油成分。因此選取最適宜的酵母是保證產品風味質量的關鍵因素之一。本研究通過全二維氣相色譜-飛行時間質譜分析結合感官定量描述分析,探究了以不同酵母(71B、KD、F33、K1、FC9DP、D254、FC9)釀造的新疆產區的白蘭地發酵酒及其新蒸餾原白蘭地關于174種重要香氣化合物及樣品整體香氣特征的差異。結果顯示,不同酵母菌發酵的樣品檢出的不同類別香氣化合物有較大差異,添加D254酵母的發酵酒樣可檢出102種香氣化合物,而添加KD酵母的發酵酒樣可檢測的化合物數量僅為86種。此外添加不同酵母發酵的基酒中,D254的發酵基酒的香氣物質總含量最高,該樣品的果香、花香、木質屬性也更突出,結果顯示D254的發酵基酒中,己醛、乙酸異戊酯、檸檬醛等具有植物香及果香的香氣化合物在蒸餾后相較其他樣品較高。

在前期研究中AWAD等[11]對干邑白蘭地在蒸餾過程中的揮發性化合物變化情況進行研究分析,結果在一次蒸餾過程中發現得到的揮發性化合物對白蘭地的香氣特征起著決定性的作用,此外,在這一過程中還生成了新的酯類、醛類、降異戊烯類和萜類化合物及其他由于高溫引起的化學反應而形成的化合物。本研究結果顯示,蒸餾后的樣品檢出的不同類別香氣化合物的種類增加,其中重要香氣化合物檢測數量最高的酒樣所添加的酵母種類為FC9DP,共定性出的關鍵香氣化合物為107種;而添加F33酵母的蒸餾后的酒樣化合物數量較少,為99種,其中大部分樣品在蒸餾后檢出的芳香族、呋喃類、含氮化合物、含硫化合物、醛類、萜烯類及酮類化合物的種類皆增加。這也驗證了AWAD等[11]關于蒸餾作用由于高溫引起的化學反應會形成的新化合物的結論。在蒸餾后,添加酵母FC9DP酒樣的香氣化合物相對含量最高,且FC9DP酒樣與FC9的酒樣香氣屬性更為豐富,其中花香、果香、木質屬性突出。經過蒸餾以后,除了酚類及內酯類化合物,大部分香氣化合物的相對含量皆增加,其中酯類、醇類、酸類及萜烯類化合物增加最明顯的皆為FC9DP樣品。此外,發酵基酒香氣得到了明顯的改善,去除了生青、酸味這些不良的香氣特征,蒸餾酒的香氣也更加芳香馥郁。本研究可為白蘭地釀造工藝的進一步改進提供數據參考。