藤椒果實成熟期麻味物質及其揮發性香氣組分的變化規律

閆紫瑋,謝天芳,王佳琳,尤霜,張家余,2,張逸飛,趙麟,2,朱翔*

1(幺麻子食品股份有限公司,四川 眉山,620360)2(四川幺麻子生物科技有限公司,四川 成都,611430)

藤椒(ZanthoxylumarmatumDC.,學名竹葉花椒),屬蕓香科(Rutaceae)花椒屬(Zanthoxylum)植物,具有獨特的“清、香、鮮、麻”風味,同紅花椒(Z.bungeanumMaxim.)、青花椒(Z.schinifoliumSieb.Et Zucc.)并稱為花椒屬調味料“三巨頭”,其富含揮發油、酰胺、生物堿、木質素、香豆素等多種活性化合物[1-2],是一種特色的藥食同源資源。

目前對藤椒化學成分分析已有多份報道[3-4],其中,以山椒素為代表成分的鏈狀不飽和脂肪酸酰胺類物質,是藤椒麻味的主要來源,其通過介導肉桂醛、辣椒素激活受體而成為主要刺激性物質[5],根據YANG[6]的報道,高溫、光照等環境因素會導致羥基-α-山椒素含量下降,從而使麻木、刺痛感覺顯著減弱。具有廣泛生物活性的山椒素,還可通過線粒體依賴性途徑有效抑制細胞生長,發揮抗癌活性;通過靶向作用Aδ機械感受器達到麻醉作用以及通過激活腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)途徑改善葡萄糖和脂質代謝[5]。

植物精油含有大量揮發性風味化合物,通過改變細菌細胞膜的通透性,導致細菌細胞內細胞質和電解質大量滲出,從而發揮抗菌活性,也可通過清除超氧陰離子自由基發揮抗氧化活性[7]。與此同時,揮發性化合物作為藤椒芳香氣味的主要表征成分,是其品質評價的主要指標[8],而目前研究集中于不同品種[9]、不同產地[8, 10]、不同提取方法[11]藤椒揮發油以及不同加工工藝[12]藤椒油的風味組成和相對含量,對于不同成熟期藤椒風味組分的變化研究相對較少,杜鋼等[13]對綿陽藤椒甲醇提取液中的芳樟醇、檸檬烯進行了準確定量分析,發現兩者隨采收時間的延長均呈現先增加后降低的趨勢,并于六月底達到最高含量,分別為14.98、4.87 mg/g。吳素蕊等[14]采用蒸餾法提取重慶花椒精油,結果表明芳樟醇隨采收時期的延長而增加,后期伴隨乙酸芳樟酯的生成。相較之下,缺乏整個成熟期藤椒麻味和香氣變化規律的系統研究,以及對藤椒揮發油中關鍵風味化合物的探究。

藤椒于每年六月至八月采收,較長的采摘周期使藤椒果實化學成分和生物活性隨生長時間而發生變化,尤其是精油揮發性風味化合物,已有研究報道不同成熟期的檸檬果實[15]、枳殼果實[16]精油中檸檬烯含量高低不同,周麗免等[17]表明木姜子果精油中萜烯類物質含量在未成熟期較高,醛類物質在成熟后期逐漸積累。由此可見,藤椒的揮發性風味化合物在不同成熟期具有不同的含量,進而影響產品質量的穩定性,因此根據不同利用目標選擇不同成熟期的藤椒,將大大提升藤椒資源的最大化利用。實驗以洪雅藤椒——國家地理標志保護產品的四川洪雅止戈鎮某藤椒基地的藤椒為研究對象,對比分析了不同成熟期麻味物質及其揮發油香氣成分的組成及含量差異,為藤椒的適時采摘提供依據,也為藤椒資源的質量評價標準建立以及藤椒的生產加工提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羥基-α-山椒素標準品(>98% HPLC),成都普思生物科技股份有限公司;正構烷烴混合標準品(C7～C40,色譜純);實驗用新鮮藤椒樣品采自四川省眉山市洪雅縣止戈鎮某藤椒標準化種植基地,共計9批樣品分別于2022年4月21日、5月11日、5月31日、6月20日、6月30日、7月10日、7月20日、7月30日、8月9日采樣,編號依次為JD01～JD09。

1.2 儀器與設備

ME-204分析天平,上海梅特勒-托列多儀器有限公司;LG-02高速中藥粉粹機,浙江瑞安市百信制藥機械有限公司;DIGITAL PRO+超聲波清洗器,山東鑫貝西科學儀器有限公司;SHSL調溫電熱套,上海坤誠科學儀器有限公司;CR-10手持色差儀,柯尼卡美能達;L6S紫外可見分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;1260高效液相色譜儀、8890-5977B氣相色譜-質譜聯用儀,美國Agilent。

1.3 實驗方法

1.3.1 基礎指標測試

藤椒色澤、粒徑分別采用手持色差儀、粒度計測定。

1.3.2 總酰胺測定

藤椒色澤按照GH/T 1290—2020《花椒及花椒加工產品 花椒酰胺總含量的測定 紫外分光光度法》測定藤椒的酰胺總含量。試樣中藤椒酰胺總含量以mg/g表示,按照公式(1)計算:

(1)

式中:A,270 nm處測定的吸光度值;v,甲醇稀釋樣品的體積,mL;k,稀釋系數;m,樣品質量,g。

1.3.3 羥基-α-山椒素測定

1.3.3.1 樣品處理

準確稱取5.000 0 g粉碎混勻后的藤椒,加25 mL色譜級甲醇,于超聲波中浸提30 min后過濾,濾液轉入50 mL棕色容量瓶中定容。制得的樣品在進樣前稀釋10倍后,使用0.22 μm的有機相過濾膜過濾至進樣瓶中,-20 ℃冷凍保藏待用。

1.3.3.2 色譜條件

色譜柱:Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm),檢測器:VWD,流動相:水(A)-乙腈(B),檢測波長268 nm,柱溫35 ℃,流速1.0 mL/min,進樣量10 μL。洗脫程序見表1。

表1 HPLC洗脫程序Table 1 HPLC elution procedure

1.3.3.3 標準曲線的繪制

準確稱取羥基-α-山椒素標準品0.010 0 g,用色譜級甲醇溶液定容于10 mL的棕色容量瓶中,配制成質量濃度為1 000 μg/mL的對照品儲備液。儲備液經甲醇稀釋成一系列質量濃度(10、50、100、200、400、600 μg/mL)的羥基-α-山椒素溶液。各濃度分別取10 μL進行HPLC檢測,以峰面積為Y軸,濃度為X軸,繪制得到藤椒麻味物質中羥基-α-山椒素的標準曲線為y=28.347x-185.72(R2=0.999 2)。

1.3.3.4 方法的回收率和精密度考察

將質量濃度為200 μg/mL的標準溶液連續進樣6次,得到相應的響應值,計算相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為0.86%,表明儀器精密度良好,能夠滿足樣品分析。

選擇JD07樣品,以加標質量濃度為100 mg/mL做加標回收實驗,平行測定6次計算樣品的加標回收率。計算RSD為4.77%,回收率為99.48%,表明該方法準確度較好。

1.3.3.5 羥基-α-山椒素含量的計算

根據樣品峰面積從標準曲線中計算出羥基-α-山椒素的濃度,再根據公式(2)計算出藤椒中羥基-α-山椒素的含量:

(2)

式中:ρ,根據標準曲線計算的羥基-α-山椒素質量濃度,mg/mL;v,甲醇稀釋樣品的體積,mL;k,稀釋系數;m,樣品質量,g。

1.3.4 香氣成分測定

1.3.4.1 藤椒揮發油的提取

采用水蒸氣蒸餾法提取藤椒揮發油,取100 g藤椒顆粒置于蒸餾燒瓶中,按照料液比1∶10加入去離子水,加熱并保持微沸狀態萃取4 h,至揮發油含量不再增加,冷卻至室溫后讀取揮發油體積并收集揮發油于4 ℃下保存。根據公式(3)計算揮發油含量:

(3)

式中:V,所得揮發油體積,mL;m,藤椒質量,g。

1.3.4.2 樣品處理

將收集得到的揮發油用正己烷溶解、稀釋100倍,并加入無水硫酸鈉于-20 ℃下保存過夜。進樣前需要將樣品用0.22 μm有機相濾膜過濾即得到供試樣品溶液。

1.3.4.3 色譜條件

色譜條件:色譜柱:HP-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);程序升溫:初始柱溫50 ℃,保持2 min,以3 ℃/min升至110 ℃,保持3 min,以3 ℃/min升至140 ℃,保持10 min,以6 ℃/min升至220 ℃,保持2 min;載氣為高純He;進樣口溫度250 ℃,檢測器溫度260 ℃,進樣量1 μL,分流比10∶1;溶劑延遲時間3 min。

質譜條件:70 eV EI離子源,離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃,掃描范圍(m/z)40～550;質譜檢索圖庫:NIST11.1譜庫。

1.3.4.4 定性和定量

定性方法:C7～C40正構烷烴混標在相同GC/MS條件下液體上樣分析。采用NIST 20標準譜庫檢索,選擇匹配度>85%的揮發性風味成分,通過與標準品的保留指數值對比分析,進一步對揮發性物質進行定性[18]。

定量方法:采用內標法定量,以環己酮(10 mg/mL)為內標,利用總離子流峰面積定量其他化合物。

1.3.4.5 相對氣味活度值(relative odor activity value,ROAV)法確定藤椒主體風味物質

參考郝旭東等[19]采用ROAV法對大紅袍花椒的揮發性風味成分的貢獻大小進行評價,進而確定主體風味物質。定義對藤椒總體風味貢獻最大的組分ROAVmax=100,其他組分ROAV的計算如公式(4)所示:

(4)

式中:C為揮發性組分的相對含量,%;T為揮發性組分的感覺閾值,μg/kg;Cmax為對藤椒總體風味貢獻最大的揮發性組分的相對含量,%;Tmax為對藤椒總體風味貢獻最大的揮發性組分的感覺閾值,μg/kg。

1.3.5 數據統計與分析

采用SPSS 26.0對數據進行統計分析,實驗數據表示為平均值±標準偏差,使用方差分析和鄧肯多重范圍檢驗對數據進行顯著性分析(P<0.05),以Origin 2022軟件、Heat Map with Dendrogram v2.00進行分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 不同成熟期藤椒的基礎指標變化

藤椒的色澤參數隨生長期的變化如表2所示,明度值L逐漸減小,表明藤椒變暗,色度值a為負值且逐漸增大,表明藤椒為綠色且逐漸偏向紅色,色度值b為正值且逐漸減小。這與其外觀變化相一致,藤椒在結果至成熟過程中,色澤由青綠色轉為暗綠色再轉至暗紅。以JD01為標準計算不同生長期藤椒的總色差ΔE,可以發現,JD01～JD05藤椒的總色差ΔE值均在10以下,人體肉眼不容易觀察到顏色變化,表明該采摘周期藤椒色澤變化較小;而JD06總色差ΔE值超過10,藤椒開始轉紅。

表2 不同成熟期藤椒各項基礎指標的變化Table 2 Variation of indexes of Z.armatum at different maturity stages

藤椒粒徑在生長過程逐漸增大,隨著藤椒進入成熟期,JD04藤椒粒徑顯著增加至5.71 mm。同樣地,JD01藤椒所得揮發油含量為0.26 mL/100 g,此時藤椒油腺還未完全長出導致揮發油含量較低;隨著生長期的延長,揮發油含量顯著增加并在成熟期(JD03～JD07)保持相對穩定,此時段采收的藤椒次生代謝占主導地位,次生代謝產物不斷積累,至JD08揮發油含量達到最大值,為3.14 mL/100 g[20];然而,JD09藤椒揮發油含量顯著降低,這是由于該時期藤椒完全成熟,活性成分達到“飽和”,并且受持續高溫的影響導致了揮發油的損失[21]。揮發油與藤椒的芳香氣味密切相關,后續試驗進一步采用GC-MS對香氣物質進行定性定量分析。

2.2 不同成熟期藤椒總酰胺、羥基-α-山椒素含量的變化

總酰胺含量能夠快速反映藤椒中的麻味成分,羥基-α-山椒素在藤椒麻味物質中占主導地位,可以決定藤椒整體山椒素的含量變化[22]。如圖1所示,不同采收期藤椒總酰胺、羥基-α-山椒素含量的變化趨勢基本一致,并且兩者具有較好的線性相關性(R2=0.986)。對于JD01～JD08,總酰胺、羥基-α-山椒素含量在生長過程中呈現先急速增加后緩慢增加的趨勢,至JD08達到最大值,此時總酰胺、羥基-α-山椒素含量分別為5.55、48.25 mg/g,該結果與朱建朝[23]報道的林州大紅袍花椒在生長過程中麻味物質含量的變化趨勢一致,其他研究[24-25]也表明花椒在生長過程中,花椒酰胺物質由椒葉逐漸轉移至果皮,并不斷積累。與此同時,JD04～JD08藤椒麻味物質含量緩慢增加的原因是受連續高溫影響,藤椒水分含量略有降低,相同質量的藤椒所含麻味物質略有增加。然而JD09藤椒的總酰胺、羥基-α-山椒素含量相比于JD08顯著降低(P<0.05),即成熟后期藤椒的麻味物質減少,李佩洪等[26]研究表明,“青花椒”麻味素總量隨青花椒果實成熟度增加呈先增后減趨勢。該結果表明6月中下旬至8月初,尤其是7月下旬采收的藤椒能夠為生產藤椒油提供更多的麻味物質。

a-總酰胺;b-羥基-α-山椒素含量圖1 不同成熟期藤椒的總酰胺、羥基-α-山椒素含量Fig.1 The content of alkylamides and hydroxy-α-sanshool of Z.armatum at different maturity stages注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 藤椒揮發性風味組分分析

2.3.1 不同成熟期藤椒揮發性風味物質種類及其含量分析

從不同成熟期的藤椒揮發油中共鑒定出93種化合物,其中烯類32種、醇類20種、酯類13種、醛類15種、酮類5種、其他化合物8種。不同成熟期藤椒揮發性風味組分的種類有所差異,JD01、JD02分別鑒定出47、44種化合物,JD04～JD08鑒定的化合物顯著增加至50～79種,JD09共鑒定出40種化合物,這與精油提取率的變化趨勢一致,說明精油含量隨成熟度的增加而增加,風味也愈發濃郁飽滿[27]。

藤椒揮發性風味組分的種類及其相對百分含量隨成熟期變化的規律如圖2所示,在整個成熟期,藤椒揮發油中烯類、醇類物質含量較高,兩者總占比高達96%～99%,即藤椒揮發油的主要成分為烯類和醇類物質[18, 28]。

圖2 不同成熟期藤椒揮發性風味組分的種類和相對百分含量Fig.2 Types and relative percentage content of flavor components in volatile oil of Z.armatum at different maturity stages

此外,藤椒揮發油中烯類物質含量隨生長期的延長逐漸降低,由于萜類具有較強的生物活性,因此JD01～JD04的藤椒揮發油可用于制備殺蟲劑等;隨著生長期的延長,醇類物質含量不斷增加,以JD05～JD09醇類物質占主導,同時酯類、醛類物質的個數及含量均顯著增加,其中,醛類具有明顯的木味、柑橘香味、桉葉香味,酯類具有果香味、花香味、清苦香味,從而使得藤椒風味更佳濃郁、香味越發飽滿,因此可用于香料的開發。

2.3.2 不同成熟期藤椒各揮發性風味物質含量的分析

選擇共有且組分含量較高的成分進一步分析,9組藤椒揮發油樣品中共檢測出54種揮發性風味組分,如表3所示。其中稀類是種類最多且含量最高的組分,為16～22種,含量變化范圍500～1 413 mg/mL,其中D-檸檬烯(610.2 mg/mL)、檜烯(351.0 mg/mL)、(1S)-β-蒎烯(147.1 mg/mL)、β-石竹烯(120.6 mg/mL)、β-胡椒烯(88.8 mg/mL)均有連續性檢出,且相對含量較高。隨著采收時間的延長,烯類物質的含量呈現先降低后略有升高的趨勢,研究表明以D-檸檬烯為代表的萜烯類物質隨果實成熟度的提高逐漸減少,有相關報道[11, 29],D-檸檬烯在未成熟果實香氣中含量較高,隨著果實成熟度的提高,含量顯著降低。

表3 不同成熟期藤椒揮發油各香氣組分的相對含量Table 3 Relative content of flavor components in volatile oil of Z.armatum at different maturity stages

不同成熟期藤椒揮發油中醇類化合物的種類及相對含量居第二位,其中含量最高的成分是芳樟醇(706.8 mg/mL),LIU等[30]研究表明超臨界CO2藤椒果皮萃取油中芳樟醇含量最高,是其最有效的氣味活性化合物。隨著生長期的延長,醇類物質的相對含量呈現升-降-升的趨勢,至JD09達到最大值779.3 mg/mL,芳樟醇占該時期醇類物質總量的91%。研究表明以芳樟醇為代表的醇類物質隨果實成熟度的提高逐漸積累,與吳素蕊等[14]報道的芳樟醇隨著采收時間的延長而增加結論一致。

醛類化合物閾值低,作為水果香氣的主要貢獻成分,可以為藤椒提供濃郁的果香、鮮香及青葉香等[29]。隨著采收時間的延長,醛類物質的相對含量呈現先升高后降低的趨勢,至JD08達到最大值,檸檬醛、(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、癸醛占該時期醛類物質總量的65%。研究表明以檸檬醛為代表的醛類物質隨果實成熟度的提高逐漸積累。

酯類化合物主要存在于成熟果實中,JD01、JD02未檢出,而隨著生長期的延長,在藤椒揮發油中逐漸檢出乙酸苯乙酯、左旋乙酸冰片酯等3種酯類化合物,但含量極微(0.7～10.9 mg/mL),吳素蕊等[14]研究發現藤椒果實在成熟后期產生了乙酸芳樟酯。

酮類、烷烴類化合物在不同成熟期藤椒揮發油中有檢出,其中,2-十一烷酮、胡椒酮在JD01檢出,含量相對較高,(-)-寧酮在JD02～JD09均有檢出;與此同時,烷烴類物質在藤椒成熟過程中有所積累,但相對含量無明顯規律。根據相關文獻報道[25],果實在生長過程中,各揮發性風味化合物受風味物質及其形成前體調控基因的影響,導致其含量存在動態變化差異,整體上表現為無規則變化積累。

2.3.3 不同成熟期藤椒關鍵風味組分分析

藤椒的總體風味由揮發性組分的含量及其感覺閾值共同決定,即香氣物質含量較高而閾值也較高的組分對藤椒風味的貢獻不大,而某些含量較低的組分對藤椒整體風味的影響較大[31]。為進一步研究不同成熟期藤椒揮發性香氣組分的差異并確定藤椒關鍵風味成分,通過計算ROAV進行分析。通過查閱資料得到各風味成分的閾值,并計算ROAV,結果如表4所示,其中,芳樟醇是整個成熟期藤椒風味貢獻最大的組分,D-檸檬烯、蒎烯對藤椒風味的貢獻較大,在整個成熟期間ROAV分別為5.29～14.37、1.86～6.35。

表4 不同成熟期藤椒的關鍵揮發性物質及其ROAVTable 4 Key flavor components and their ROAV in volatile oil of Z.armatum at different maturity stages

不同成熟期藤椒的關鍵風味化合物存在差異,JD01關鍵呈味組分(ROAV≥1)有8種,分別是芳樟醇、D-檸檬烯、橙花醇、蒎烯、β-石竹烯、3-蒈烯、(1S)-β-蒎烯、2-十一烷酮;同時4-松油醇、水芹烯、松油烯、香茅醛、L-α-松油醇對藤椒風味有修飾作用(0.1≤ROAV<1)。JD02關鍵呈味組分有3種,分別是芳樟醇、D-檸檬烯、蒎烯;同時(1S)-β-蒎烯、β-石竹烯、3-蒈烯、水芹烯、香茅醛對藤椒風味有修飾作用。JD03、JD04、JD08關鍵呈味組分有4種,分別是芳樟醇、癸醛、D-檸檬烯、蒎烯;同時(1S)-β-蒎烯、β-石竹烯、3-蒈烯對藤椒風味有修飾作用。JD05、JD06關鍵呈味組分有5種,分別是芳樟醇、癸醛、D-檸檬烯、壬醛、蒎烯;同時(1S)-β-蒎烯、β-石竹烯、3-蒈烯、4-松油醇對藤椒風味有修飾作用。JD07、JD09關鍵呈味組分有4種,分別是芳樟醇、癸醛、D-檸檬烯、蒎烯;同時(1S)-β-蒎烯、β-石竹烯、3-蒈烯、4-松油醇對藤椒風味有修飾作用。郝旭東等[19]利用頂空固相微萃取氣質聯用結合ROAV和主成分分析確定了大紅袍花椒的主體風味物質,共測出芳樟醇、3-蒈烯、水芹烯、壬醛等9種關鍵揮發性香氣組分,γ-松油烯、4-松油醇、十一醛等對大紅袍花椒香氣起修飾作用,與本研究結果有所不同的原因在于藤椒與紅花椒的品種差異。

可以發現,芳樟醇、D-檸檬烯、蒎烯是藤椒整個生長期的關鍵風味化合物,芳樟醇具有花香、木香、花甜香味及微弱的柑橘香,檸檬烯具有柑橘香及清淡的香脂香氣,蒎烯具有特有松木香氣;橙花醇、β-石竹烯、3-蒈烯、(1S)-β-蒎烯、2-十一烷酮賦予未成熟藤椒特有干木香、辛香風味;癸醛則是藤椒成熟期的關鍵風味化合物,具有生青、柑橘香氣,可將其應用于食品行業中多種食用香精配方。

3 結論

本文研究了不同成熟期藤椒麻味物質含量的變化及其揮發油香氣成分的組成及含量差異,結果為藤椒的適時采收及其加工提供了科學指導。

1)藤椒總酰胺類物質、羥基-α-山椒素含量隨成熟度的增加顯著增加,對于4月、5月采收的藤椒,麻味成分較低;6月中下旬至7月底含量較高且保持相對穩定,能夠為藤椒油生產提供足夠的麻味物質。

2)不同成熟期藤椒風味化合物的種類和含量均存在差異:4月至6月中旬采收的藤椒揮發性風味組分以稀類為主,且隨果實成熟度的提高逐漸減少;醇類物質含量逐漸增加;醛類、酯類物質在6月開始積累,且隨果實成熟度的提高逐漸增加。ROAV分析結果表明,芳樟醇、D-檸檬烯、蒎烯對藤椒風味的貢獻較大;早期藤椒揮發油的關鍵風味化合物較多,而以癸醛為代表的醛類物質成為成熟期藤椒的關鍵風味化合物。

3)針對不同用途選擇藤椒采收期:對于醫藥行業為主的利用以及食品行業藤椒油的生產,可選擇6月中下旬至7月底采收的藤椒,此時藤椒麻度較高、風味組分相對較多;4月采收的藤椒揮發性風味組分以稀類、酮類為主,可用于制備殺蟲劑等;對于6月下旬采收的藤椒,作為香氣重要來源的醛類、酯類物質逐漸積累,因此可用于香料的開發。