氟喹諾酮類藥物免疫分析方法的研究進展

王雪晴,陳秀金,2,3*,李兆周,2,3*,王耀,2,3,安彪,白玉冰,代明慧,陳佳琪

1(河南科技大學 食品與生物工程學院,河南 洛陽,471000)2(河南省食品綠色加工與質量安全控制國際聯合實驗室,河南 洛陽,471000)3(食品加工與安全國家級實驗教學示范中心,河南 洛陽,471000)

氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones,FQs)是一類人工合成的抗菌藥物,抗菌譜廣,對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有抗菌活性[1],被認為是目前最有效的抗感染藥物之一,廣泛用于家畜、水產養殖動物和寵物病菌感染的防治。目前市場上廣泛使用的氟喹諾酮類藥物有二氟沙星(difloxacin,DIF)、沙拉沙星(sarafloxacin,SAR)、培氟沙星(pefloxacin,PFL)、環丙沙星(ciprofloxacin,CIP)、諾氟沙星(norfloxacin,NOR)、恩諾沙星(enrofloxacin,ENR)、洛美沙星(lomefloxacin,LMX)、達氟沙星(danofloxacin,DAN)等20多種。長期以來,FQs在動物飼養過程中的過度使用,造成了食品中的FQs殘留超標,若經常攝入這種食物,會導致體內耐藥病原菌的產生,增加耐藥性的風險[2]。為了保障消費者的利益,國家標準GB 31650—2019 《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》中規定了各種FQs在食品中的最大殘留限量(maximum residue limits,MRLs),其中達氟沙星在牛、羊、家禽肌肉中的MRLs為200 μg/kg;二氟沙星在牛、羊、豬肌肉中的MRLs為400 μg/kg;恩諾沙星在豬、兔、家禽肌肉中的MRLs為100 μg/kg;沙拉沙星在雞、火雞肌肉中的MRLs為10 μg/kg。另外中華人民共和國農業農村部公告[第2292號]發布,禁止在動物養殖中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等獸藥。

迄今為止,用于檢測FQs的方法有高效液相色譜法[3]、超高效液相色譜-質譜法[4]、毛細管電泳法[5]、微生物檢測法等[6]。儀器檢測法的靈敏度高、準確性好,但存在樣品前處理步驟復雜、設備昂貴的缺點。微生物檢測法具有操作簡便、儀器投入少、重復性好的優點,但易出現假陽性現象,耗時長,且無法準確定量,因此只適于對大批量樣品進行粗篩,難以滿足食品安全快速檢測的需求。免疫分析法具有特異性強、靈敏度高、快速簡便等特點,廣泛用于喹諾酮類藥物殘留的檢測。近年來,PAN等[7]對食品和環境樣品中喹諾酮類藥物的免疫分析方法的研究進展進行了報道。蔡新發等[8]發表了FQs免疫分析方法的研究進展,文章總結了2018年以前國內的相關研究概況。本文主要對近5年來國內外FQs免疫分析法的研究進展進行綜述,以期為FQs免疫檢測技術的開發和應用提供理論支撐。

1 FQs的抗體制備

FQs分子質量<1 000 Da,只有反應原性而無免疫原性,這類小分子物質在免疫學上被稱為半抗原,與載體蛋白偶聯后得到完全抗原。完全抗原誘導機體產生免疫應答可獲得相應的抗體?？贵w制備是建立FQs免疫分析方法的關鍵,抗體類型包括多克隆抗體、單克隆抗體和單鏈抗體等。

1.1 多克隆抗體的制備

多克隆抗體是一種受多種抗原決定簇刺激而產生的多種抗體混合物,具有制備簡單、生產成本低的特點。劉向輝等[9]采用碳二亞胺法將洛美沙星半抗原與牛血清白蛋白偶聯制備免疫原,免疫新西蘭大白兔,獲得一種至少能識別11種FQs的抗體,檢測限低于10 ng/mL。李彬彬等[10]用氧氟沙星制備的免疫原,免疫BALB/c小鼠,獲得氧氟沙星多克隆抗體,其半數抑制濃度(fifty percent inhibitory concentration,IC50)為19.97 ng/mL。汝曉飛等[11]合成了馬波沙星人工抗原,免疫BALB/c小鼠,制備馬波沙星的多克隆抗體,其IC50為90.2 ng/mL。韓振宇[12]將諾氟沙星與載體蛋白偶聯獲得人工抗原,通過免疫,制備諾氟沙星多克隆抗體。李源珍[13]用諾氟沙星、環丙沙星、沙拉沙星和氧氟沙星通過活性酯法與牛血清白蛋白偶聯,制備免疫原,通過免疫,獲得了同時識別諾氟沙星和氧氟沙星的抗體,諾氟沙星的IC50為0.73 ng/mL,氧氟沙星的IC50為0.2 ng/mL。GALVIDIS等[14]以沙拉沙星偶聯蛋白質作為人工抗原,制備沙拉沙星多克隆抗體,測得抗體的IC50為0.25 ng/mL。

1.2 單克隆抗體的制備

單克隆抗體是由單一B細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原決定簇的抗體。劉勁濤[15]采用氧氟沙星人工抗原免疫小鼠,選擇檢測效價高、抑制好的小鼠進行細胞融合,通過篩選,獲得了3株分泌氧氟沙星單克隆抗體的細胞株,命名為C9、B2和A10,其IC50分別為3.85、6.25、6.96 ng/mL。王雅潔[16]將氟羅沙星與載體蛋白偶聯制備人工抗原,免疫小鼠,純化腹水得到氟羅沙星的單克隆抗體,其IC50為1.28 ng/mL。TOCHI等[17]合成氧氟沙星人工抗原,免疫小鼠,并采用體內誘生法制備腹水,產生抗氧氟沙星的單克隆抗體,其IC50為1.17 ng/mL。汝曉飛[18]以洛美沙星為半抗原,用碳二亞胺法和混合酸酐法制備人工抗原,獲得洛美沙星單克隆抗體,IC50為1.10 ng/mL。ZHANG等[19]制備了培氟沙星的單克隆抗體,測得其IC50為0.902 ng/mL。黃美[20]制備了諾氟沙星人工抗原,免疫小鼠,制備了諾氟沙星的單克隆抗體,其IC50為0.45 ng/mL。

1.3 單鏈抗體的制備

單鏈抗體屬于第三代抗體,是通過短肽拼接抗體重鏈可變區和輕鏈可變區片段而獲得的,由于其具有分子小、免疫原性低、可體外大批生產的優點,逐漸在免疫分析法中廣泛應用。WANG等[21]利用分子對接方法在虛擬突變結果的基礎上,將重組抗沙拉沙星單鏈抗體的接觸氨基酸Tyr99定向突變為His,進化出沙拉沙星單鏈抗體。該抗體對12種氟喹諾酮類藥物的親和力顯著提高,靈敏度比突變前提高了7倍?？的列竦萚22]將環丙沙星和恩諾沙星的單克隆抗體通過聚合酶鏈式反應獲得相應的單鏈抗體,其親和常數達到了108,說明所制備的環丙沙星和恩諾沙星單鏈抗體親和力比較理想。張運尚等[23]采用噬菌體展示技術構建免疫小鼠噬菌體庫,經過篩選后將分離出的陽性抗體轉入大腸桿菌BL21中進行表達。采用分子對接的方法對單鏈抗體進行虛擬突變,根據虛擬突變的結果,將單鏈抗體與氧氟沙星結合的關鍵氨基酸殘基(甲硫氨酸209)突變為谷氨酰胺后,降低了抗原抗體的總結合能,提高了單鏈抗體突變體的結合能力。

2 氟喹諾酮類藥物免疫分析法

2.1 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是將抗原-抗體反應的特異性和酶的高效性相結合而開發的一種方法。MUKUNZI等[24]借助2,2′-乙烯二氧雙乙胺將培氟沙星與牛血清白蛋白偶聯,免疫小鼠,制備抗體,建立了檢測雞肌肉樣品中FQs殘留的間接競爭ELISA。在優化條件下,對培氟沙星的半數抑制濃度IC50為0.2 ng/mL,檢測限為0.082 ng/mL。該方法還能同時檢測雞肌肉中其他9種FQs靶標物質,檢測范圍為0.2～4 ng/mL。LI等[25]用司帕沙星偶聯載體蛋白制備免疫原,免疫動物,篩選抗血清,建立了檢測蜂蜜中司帕沙星的間接競爭ELISA。在最佳條件下,測得司帕沙星的IC50為0.12 ng/mL,檢測限為0.02 ng/mL。WANG等[26]通過噬菌體文庫的構建和定向進化,獲得了一種抗環丙沙星單鏈抗體(single chain antibody fragment,scFv)突變體?；谟H本scFv和突變scFv分別建立了環丙沙星的間接競爭-ELISA,結果表明,基于突變scFv建立的ELISA比用親本scFv建立ELISA靈敏度提高了16.6倍,且突變體scFv的親和力也得到顯著提高,得出該方法可用于動物源性食品中環丙沙星的超靈敏測定。

2.2 免疫層析法

免疫層析法(immunochromatography assay,ICA)是一種以毛細管吸附作用力為動力,通過目標物與檢測線(test line,T線)和控制線(control line,C線)上的生物受體發生特異性反應,檢測結果以線條的形式顯示出來的方法。目前,用于免疫層析法的信號標記物有金納米粒子(gold nanoparticles,AuNPs)[27]、金-銀納米粒子(Au-Ag nanoparticles,Au-AgNPs)[28]、碳納米材料[29]、量子點(quantum dots,QDs)[30]、磁納米粒子(magnetic nanoparticles,MNPs)[31]、上轉化納米粒子(upconversion nanoparticles,UCNPs)[32]等。

2.2.1 金標免疫層析法

金標免疫層析法(gold immunochromatography assay,GICA)是一種以金納米顆粒為標記物的免疫層析法。PENG等[33]開發了一種能夠快速檢測牛奶中FQs殘留的膠體金免疫層析試紙條。試驗用諾氟沙星衍生物和沙氟沙星衍生物的混合物作為半抗原制備了一種可識別32種FQs的廣譜性單克隆抗體,然后用羊抗鼠抗體和包被原(沙氟沙星偶聯卵清蛋白)分別噴膜形成C線和T線,試驗表明所研制試紙條可在10 min內同時對32種FQs進行檢測,該方法的消線值為1.0～100 ng/mL,檢測限為0.1～10 ng/mL,為現場篩選牛奶中FQs殘留提供了一種有用的方法。HENDRICKSON等[34]以金納米粒子作為標記物,建立了一種同時檢測乳制品中環丙沙星和氯霉素的免疫層析法。該方法可在15 min內完成檢測,其儀器檢測限分別為20 pg/mL和0.5 ng/mL,可視消線值均為0.5 ng/mL。乳制品中環丙沙星和氯霉素的回收率為83%～120%。YANG等[35]建立了一種快速檢測牛奶中達氟沙星的金標免疫層析法,該方法的檢測限為0.092 ng/mL,與HPLC法的驗證結果無顯著差異。

2.2.2 熒光免疫層析法

熒光免疫層析法(fluorescence immunochromatography assay,FICA)是一種將熒光檢測體系與抗原抗體反應相結合建立起來的新型膜條層析法。LIU等[36]研制了一種以量子點微球為標記物的熒光免疫層析法,用于檢測環丙沙星,檢測限為0.05 ng/mL,檢測范圍為0.1～100 ng/mL。YANG等[37]用碳二亞胺法將單克隆抗體和羧基化的CdSe/ZnS量子點偶聯制成熒光探針,建立了檢測氟羅沙星的熒光免疫層析法,用于檢測豬肉中氟羅沙星的殘留,其消線值為2.5 ng/mL。陳俊珺[38]將含有稀土元素銪的熒光微球分別與二甲基嘧啶和諾氟沙星的單克隆抗體偶聯得到熒光免疫標記物,建立了可同時檢測二甲基嘧啶和諾氟沙星的時間分辨熒光免疫層析法,研究得出,諾氟沙星在豬肉樣中的檢測范圍為2.74～18.70 μg/kg、在蝦肉樣中檢測范圍為2.37～85.22 μg/kg和在雞蛋檢測范圍為4.68～16.54 μg/kg。由于熒光微球具有時間分辨和波長分辨優勢,不受背景熒光干擾,故大大提高了免疫層析法的靈敏度。

2.2.3 表面增強拉曼光譜免疫層析法

表面增強拉曼光譜(surface enhanced raman spectroscopy,SERS)免疫層析法是借助SERS的高靈敏度和光譜選擇性,結合抗原抗體的特異性識別作用和金屬納米粒子的表面增強特性,發展起來的一種新型免疫分析方法?，F已用于食品中FQs的殘留檢測。SHI等[39]利用所建立的SERS免疫層析法對諾氟沙星(norfloxacin,NOR)和新霉素(neomycin,NEO)進行了超靈敏檢測。如圖1所示,試驗在AuNPs的表面連接拉曼信號分子4-氨基苯硫酚(4-aminothiophenol,PATP),分別制備拉曼免疫探針NOR mAb-AuNPs-PATP和NEO mAb-AuNPs-PATP,組裝試紙條,同時對諾氟沙星和新霉素進行檢測。該法測得諾氟沙星的檢測限為0.55 pg/mL,借助SERS對免疫層析試紙條進行檢測,能大幅提高免疫層析法檢測的靈敏度,也為其他小分子殘留物的高靈敏檢測提供新思路。

a-SERS多聯試紙檢測示意圖;b-T1、T2、C線的反應示意圖圖1 基于AuNPs-PATP標記的免疫層析原理圖[39]Fig.1 Schematic representation of AuNPs-PATP tags-based immunochromatography[39]

2.3 化學發光酶免疫分析法

化學發光酶免疫分析法(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA)是將化學發光測定技術和酶免疫分析技術相結合的檢測方法,其靈敏度和可靠性更高。ZENG等[40]通過帕珠沙星衍生的免疫半抗原,制備廣譜性抗體,建立了檢測牛奶中FQs殘留的間接競爭化學發光酶免疫法,對FQs的檢測限為0.10～33.83 ng/mL。曹敬政等[41]建立了一種能夠檢測動物源性食品中多種氟喹諾酮類藥物殘留的直接競爭化學發光酶免疫法,對諾氟沙星、培氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、洛美沙星、那氟沙星、達氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星和麻保沙星共10種FQs的IC50為1.46～11.57 ng/mL,檢測限為0.07～0.27 ng/mL,實現了對上述10種FQs殘留的同時檢測。PEI等[42]建立了一種以氫氧化鈷納米片為過氧化物納米酶取代HRP發揮催化放大信號作用的流動注射化學發光免疫法,并成功應用于家禽及水產品中恩諾沙星的高靈敏檢測,線性范圍0.000 1～1 000 ng/mL,檢測限為0.041 pg/mL。

2.4 熒光免疫分析法

熒光免疫分析法(fluoroimmunoassay,FIA)是一種將免疫反應的特異性和熒光標記的高靈敏性相結合的檢測方法。目前,用于熒光免疫分析的標記物有熒光素、量子點[43]、上轉換熒光納米粒子[44]、鑭系元素螯合物鋱[45]、銪[46]等。根據檢測原理不同,FIA被分為時間分辨熒光免疫分析法(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)和熒光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)等。

2.4.1 時間分辨熒光免疫分析法

時間分辨熒光免疫分析法是一種對鑭系元素螯合物發出的熒光信號進行檢測的免疫分析方法。ZHANG等[47]利用牛血清白蛋白與環丙沙星偶聯合成免疫原,免疫動物,制備了一種能識別12種FQs的群選性單克隆抗體。以諾氟沙星與卵清蛋白偶聯物為包被原,建立了測定環境水體中12種FQs的時間分辨熒光免疫分析法。該方法對12種FQs的檢測限為0.051～0.10 ng/mL,測得的總FQs濃度與液相色譜-串聯質譜法測得的結果一致,可用于直接評估案例區地表水中FQs的存在和環境風險,在環境風險評價中具有巨大潛力。

2.4.2 熒光偏振免疫分析法

熒光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)是一種通過熒光素標記抗原,并與游離抗原競爭性地與抗體結合,引起2種免疫標記物旋轉運動差異,從而造成其熒光偏振度發生變化的新型免疫分析法。CHEN等[48]將帕珠沙星(pazufloxacin,PAZ)和異硫氰酸熒光素異構體(fluorescein isothiocyanate isomer,FITC)合成異源示蹤劑(PAZ-FITC),該示蹤劑和克林沙星競爭性地與抗克林沙星抗體結合,首次建立了一種檢測羊奶中克林沙星殘留的異源FPIA,該方法的IC50為29.3 ng/mL,比同源熒光偏振免疫法的IC50值低了6倍。SHEN等[49]開發了一種檢測水中恩諾沙星的FPIA。研究合成了3種具有不同間隔基的熒光素(氨基熒光素、硫氨基乙二胺熒光素和硫氨基己二胺熒光素)標記恩諾沙星,得到標記物A、B和C,通過比較,手臂最長標記物C顯示出最好的靈敏度。在此條件下,恩諾沙星的檢測限為1.68 ng/mL,交叉反應性小于2%,對豬肝和雞肉樣品的添加回收率分別為91.3%和112.9%。該方法不需要樣品預處理,免疫測定過程只需8 min,比ELISA的檢測時間短得多。另外FPIA將免疫反應過程從異質(固液相)轉變為均質(液相),無分離步驟,提高了反應效率。

2.4.3 其他熒光免疫分析法

此外,有研究者建立了其他熒光標記物(如熒光素)的免疫分析法。如YU等[50]開發了一種直接競爭性雙熒光素酶生物發光免疫測定法(dual-luciferases competitive direct bioluminescent immunoassay,DBL-dcELISA),實現了只需添加底物一步反應,便可同時檢測出20種FQs和21種磺胺類藥物2類小分子,對FQs的檢測限為0.178～41.428 ng/mL。DBL-dcELISA不僅簡化了信號產生和收集程序,而且能夠以簡單的程序快速同時檢測各種小分子,這對于開發多殘留免疫分析方法具有重要意義。KERGARAVAT等[51]建立了一種間接競爭磁熒光酶免疫分析法,用于篩選牛奶中的FQs。陽性奶樣中的FQs與磁珠固定的FQs將競爭性地與抗體結合,然后加入酶標二抗及其相應底物,通過酶催化底物反應,產生熒光信號。該方法能對7種FQs進行定量檢測,其中環丙沙星和馬波沙星檢測限分別為10 ng/mL,恩諾沙星和達氟沙星檢測限分別為13 ng/mL,諾氟沙星檢測限為22 ng/mL,沙拉沙星檢測限為29 ng/mL,氧氟沙星檢測限為30 ng/mL,表明該方法可用于牛奶中FQs的常規檢測。

2.5 免疫傳感器

免疫傳感器是利用抗原-抗體的特異性反應導致傳遞信號發生變化所建立的生物傳感器。根據檢測原理不同,將免疫傳感器分為電化學免疫傳感器、光學免疫傳感器、表面等離子體共振免疫傳感器等。

2.5.1 電化學免疫傳感器

電化學免疫傳感器是將免疫反應與電化學檢測相結合所建立起來的傳感器,通過使用安培、電勢、阻抗或電導換能器來量化目標分析物。電化學傳感器的分析速度快、靈敏度高、響應時間短、微型化和自動化能力強,因此被廣泛用于FQs殘留的檢測。電化學免疫傳感器近年來在FQs殘留檢測中的應用,具體見表1。

表1 電化學免疫傳感器在FQs殘留檢測中的應用Table 1 Application of electrochemical immunosensor for the detection of FQs residues

由表1可知,電化學免疫傳感器已用于牛奶、豬肉、雞肉、鴨肉、水等樣品中的FQs殘留檢測?，F用于檢測FQs殘留的電化學免疫傳感器的納米材料有AuNPs[52-53]、石墨烯[54]、氧化釩納米粒子[58]等。其中,AuNPs有很大的比表面積,有利于增大識別分子的吸附面積;石墨烯具有高導電性和高比表面積的優勢,可用于修飾電極,提高電極的電子傳遞速度;氧化釩的介孔結構和大表面積可促進電解液離子擴散和電荷轉移;綜上可見,納米材料用于檢測FQs的電化學免疫傳感器將會提高傳感器的靈敏度和實用性。

2.5.2 表面等離子體共振免疫傳感器

表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)免疫傳感器是一種通過抗原抗體在金屬表面結合引起光學反射率發生變化而產生SPR信號的檢測方法。SPR免疫傳感器已用于恩諾沙星殘留的檢測,試驗原理見圖2。

圖2 檢測ENR的SPR免疫傳感器原理圖[61]Fig.2 Schematic diagram of the SPR immunosensor for ENR detection[61]

當恩諾沙星與SPR傳感器芯片上的抗體結合時,會引起鍍金薄膜表面的反射率發生變化,使金屬表面等離子體共振,引起入射角發生改變,有效地檢測結合到金屬介質表面上的恩諾沙星,從而實現對恩諾沙星的檢測。該方法的IC50為3.8 ng/mL,檢測限1.2 ng/mL,檢測時間6 min[61]。SARI等[62]以甲基丙烯酸為功能單體,采用微乳液聚合技術合成分子印跡納米顆粒,對SPR芯片表面進行修飾,建立了檢測環丙沙星的SPR仿生免疫傳感器,該傳感器對環丙沙星的檢測限為7.1 ppb。李樹瑩等[63]研制了一種新型平面波導免疫傳感器,建立了恩諾沙星和諾氟沙星的同時快速檢測方法。待測樣品溶液和熒光染料標記抗體溶液通過傳感器預反應槽,流向免疫芯片,待測樣品中的抗原與芯片表面的抗原競爭結合熒光染料標記抗體,采用倏逝波激發熒光染料產生熒光,測量熒光強度定量檢測FQs。該方法測得恩諾沙星檢測限為0.34 ng/mL,諾氟沙星的檢測限為0.14 ng/mL,檢測周期僅需15 min。SPR免疫傳感器結合了SPR技術和免疫分析技術的優點,無需標記直接感知抗體捕獲目標物時信號的變化,為食品中FQs的殘留檢測提供了一種準確、靈敏、穩定、自動化的方法。

2.5.3 其他免疫傳感器

此外,還有免疫傳感器用于氟喹諾酮類藥物的檢測。如YUAN等[64]建立了一種基于氧化蝕刻銀納米棱鏡(silver nanoprisms,AgNPRs)的等離子體間接競爭ELISA免疫傳感器,實現了對食品中達氟沙星(danofloxacin,DAN)的定量和定性檢測(檢測原理見圖3)。當樣品中不存在DAN時,生物素-葡萄糖氧化酶通過鏈霉親和素被生物素-抗DAN單克隆抗體復合物捕獲,與葡萄糖反應生成H2O2,使AgNPRs被蝕刻,顏色從深藍色變為無色。反之,當樣品中存在DAN時,DAN競爭性地與生物素-抗DAN單克隆抗體結合,阻止其與包被原結合,溶液中就不會生成H2O2,AgNPRs就不會被氧化,則保持原來的形態和藍色。該方法對DAN定量檢測限為0.24 ng/mL,定性檢測限為0.32 ng/mL,該方法與傳統的間接競爭ELISA相比,定量檢測限和定性檢測限分別降低3倍和32倍。

圖3 用于DAN定量和定性檢測的AgNPRs蝕刻免疫傳感器原理圖[64]Fig.3 Schematic of the proposed AgNPRs etching immunosensor for the quantitative and qualitative detection of DAN[64]

3 結論與討論

由于FQs的化學結構相似,例如沙拉沙星、二氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星等都含有一個六元雜環芳香環、一個羧酸基、一個酮基、一個氟基和一個哌嗪環。因此,制備抗體時,有可能產生與這些FQs具有交叉反應性的廣譜特異性抗體?；趶V譜性抗體建立的免疫學檢測方法,實現同時對幾種甚至十幾種FQs的快速檢測。當樣品的檢測結果為陽性時,表明樣品中可能含有與抗體具有交叉反應性的FQs中一種或者多種,所以該方法往往只用于初篩。因此,免疫分析法測出的陽性樣品,通常需要用其他方法進行驗證。

ELISA方法具有高通量、高靈敏和低成本的優點,但也存在重現性差,易受復雜基質影響的缺點[65]。免疫層析法具有簡便、快速和價廉的優點,尤其適用于現場檢測。其中,膠體金在免疫層析方法中得到了廣泛的應用,但也存在較多的缺陷,如易受基質干擾而導致檢測結果準確性較差,檢測靈敏度低等[66]。熒光免疫層析法的靈敏度高,但標記抗體的有機染料標記物在光照下易分解并發生光漂白現象,影響了分析結果的準確性和可靠性[67]。SERS免疫層析法因需要SERS儀,提高了檢測成本。采用熒光素或熒光納米材料標記抗體,會降低抗體活性。另外,食品基質中部分有機物存在熒光效應,會對FQs熒光檢測造成背景干擾。而時間分辨熒光納米材料能夠避免基質中背景熒光的干擾,具有更高的靈敏度,一直是研究的熱點[68]。免疫傳感器具有微型化、自動化、可再生和易商業化的優點已被證明,然而納米材料修飾電極的重現性和穩定性不足,受食品基質干擾大。因此,提高信號放大的再現性和基于納米材料的信號放大是未來研究的重點[69]?？傊?在FQs免疫分析中引入納米酶、納米膜、金屬納米簇等新型納米材料,有望解決食品復雜基質干擾問題和提高方法的靈敏度。同時將FQs免疫分析法與微流控芯片技術(或智能檢測系統)相結合,促使其向高通量、智能化、高靈敏和多重檢測的方向發展。