等溫擴增技術在水產品寄生蟲檢測中的應用研究進展

孫曉紅,張妮,趙嘉怡,李達容,趙勇,藍蔚青,3*

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)2(農業農村部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室,上海,201306)3(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海,210306)

寄生蟲病是指人們生食寄生蟲污染的生鮮食品,或食用未進行徹底熱加工的食品,導致人們身體出現多種不適的疾病總稱[1]。近年來,我國飲食習慣發生明顯變化,生魚或半生海鮮類產品以其肉質清鮮甘甜、營養價值豐富,受到廣大消費者喜愛,市場需求量逐年增加,現已成為人們餐桌上必不可少的美食[2]。然而,生食海鮮類產品易增加感染和過敏風險[3],隨之而來的寄生蟲導致水產品質量安全問題頻頻發生,引發的寄生蟲疾病更成為世界范圍內影響人們健康的關鍵[4-5]。據估計,全球人類寄生蟲病的每年患病人數約為4.07億例,其中9 110萬例由于生食生鮮類食品導致患病的患者中,有5.2萬死亡病例[6]。

水產品中寄生蟲的檢測技術主要有傳統的病原學檢測、免疫學與分子生物學等技術,但前述方法往往存在耗時、專業性強、操作繁瑣、易出現錯漏檢等問題,已不能滿足人們對水產品中寄生蟲快速檢測的要求。因此,開發簡便快速、準確靈敏的寄生蟲檢測技術已成為保障水產品質量安全的需求。為促進寄生蟲檢測技術在水產品中的發展和應用,同時減少或消除誤檢和漏檢的發生,實現快速檢測,現已有環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)與重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification, RPA)等多種等溫擴增技術被應用于食品安全檢測。其突出優勢是操作簡單,可實現快速高效檢測?；诖?本文介紹了部分等溫擴增技術原理、優缺點及在吸蟲、線蟲等水產品寄生蟲檢測領域的應用研究進展,提出其存在的問題,如引物設計繁瑣、擴增產物純化與假陽性等。同時,介紹了可通過研發新型等溫擴增技術引物設計軟件來簡化引物設計步驟、擴增產物純化等辦法予以解決,并對其在水產品寄生蟲檢測中的未來發展前景進行分析總結,以期為早期寄生蟲疾病的預防和診斷提供保障。

1 等溫擴增技術的作用原理及特點

等溫擴增技術的作用原理主要是使用便攜設備,在恒溫下用更短的時間,實現目標核酸的放大。該技術與傳統檢測技術相比的主要特點如表1所示。

表1 水產品主要寄生蟲檢測方法Table 1 Detection technology of parasites in aquatic products

1.1 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術最初由Eiken Chemical Company于2000年開發的,其可在60～65 ℃的恒溫條件下實現核酸擴增,對熱循環儀器無依賴性,且與傳統PCR檢測技術相比較,該技術具有擴增快速高效、實用性強等優點[37]。該技術已應用于線蟲、血吸蟲、病原微生物、轉基因以及食源性致病菌的檢測。其中,CAI等[27]使用環介導等溫擴增法快速檢測魚肉中的華支睪吸蟲囊蚴,比PCR法的檢測靈敏度高100倍,為快速、靈敏檢測魚中華支睪吸蟲提供了有效工具;張森等[28]實現了對棘顎口線蟲的快速檢測,檢測限為2 fg棘顎口線蟲質粒DNA,靈敏度較傳統PCR低100倍;TONG等[29]以28S rDNA為靶點的環介導等溫擴增試驗,能快速有效地檢測感染和早期感染釘螺中的日本血吸蟲DNA,檢測限為100 fg,日本血吸蟲基因組DNA;CAMMILLERI等[30]建立的LAMP方法實現了對人工污染異尖線蟲的加工魚樣品的陽性擴增,檢測限比實時熒光定量PCR方法低100倍;喬艷等[31]建立的環介導等溫擴增技術結合試紙條檢測,能在50 min內準確鑒定出異尖線蟲/派氏異尖線蟲,且操作簡便;CHEN等[32]報告的LAMP法可以在60 ℃的等溫條件下在45 min內完成并殖吸蟲檢測,為淡水蟹、小龍蝦等樣本中并殖吸蟲DNA的檢測提供了快速靈敏工具,這對有效控制人類寄生蟲疾病具有重要意義。

1.2 重組酶聚合酶等溫擴增技術

2006年,有學者利用參與細胞DNA合成、重組和修復的蛋白質開發了RPA技術。該反應中,T4 噬菌體的重組酶在 ATP存在下與引物結合,形成重組酶-引物復合物,該復合物會尋找雙鏈DNA同源序列,并促進同源位點與引物的結合,就會發生鏈交換反應啟動DNA合成,單鏈結合蛋白將與另一條鏈結合防止被進一步替換。最后,重組酶分解, DNA聚合酶結合到引物的3′端,在dNTP存在下啟動DNA合成,實現核酸擴增[38-40],如圖1所示。

圖1 重組酶聚合酶擴增原理Fig.1 Amplification principle of recombinase polymerase

重組酶聚合酶等溫擴增技術具有簡單、高靈敏度、與多重檢測的兼容性、快速擴增,以及在低溫和恒定溫度下操作,無需初始變性步驟與使用多個引物等優勢,已成功應用于細菌、真菌、寄生蟲等早期診斷[41]。其中,SUN等[33]通過RPA技術結合側流層析試紙條(lateral flow dipstick, LFD)可從糞便樣品中快速檢測日本血吸蟲,且RPA-LFD技術擁有較高靈敏度和特異性,在現場應用中具有良好潛力。XING等[34]以RPA擴增日本血吸蟲SjR 2基因,該法檢測限為0.9 fg的日本血吸蟲DNA,結果表明,基于RPA的檢測方法可用作血吸蟲病診斷的有前景的即時檢測。POULTON等[35]開發了一種針對曼式血吸蟲28S rDNA區域的RPA側流層析測定,檢測限為10 pg DNA,該法對曼式血吸蟲診斷檢測有很高的潛力,幾乎不需要設備和技術支持,結果可快速獲得且易于判讀。WU等[36]建立了針對B1基因檢測弓形蟲的LF-RPA方法,檢測限為0.1個卵囊/反應。該技術在37～42 ℃(人體體溫)下即可進行,靈敏度和特異性均高,結果讀取多樣化。

2 存在問題和解決辦法

LAMP與RPA新型等溫擴增技術,通過提供等溫環境合成目的基因DNA,避免傳統PCR的部分弊端,并結合免疫學檢測技術、生物傳感器等,使用多樣化的判讀方式,如通過LFD代替瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis, AGE)等,縮短檢測時間。等溫擴增技術雖然擁有較好特異性、選擇性、靈敏度和效率,但仍有假陽性、引物設計繁瑣與擴增產物需要純化等問題,針對于此,有必要采取相應措施予以解決[42]。

2.1 引物設計繁瑣

LAMP、RPA 已逐步應用于多重擴增,這不僅需要設計適宜的引物,也需對引物濃度進行優化。迄今為止,還未對這些新型等溫擴增技術引物設計開發專屬的軟件[43],只有聚合酶鏈式反應軟件可用于引物設計和篩選。但LAMP需設計多條引物,RPA的引物理想長度為30～35 bp,不論是引物數還是引物長度均不同于聚合酶鏈式反應軟件所設計的引物。有時雖可用PCR引物擴增相應的片段,但可能無法達到最佳的擴增效果[43]。因此大多數情況下,需人工設計合成引物,這可能導致引物設計以及濃度優化時間過長、引物合成成本消耗很大的問題。引物濃度優化是由于引物競爭重組酶蛋白,一個靶標引物可抑制另一個靶標擴增,因此需要優化每種引物的比例。此外,不同的DNA靶標,即使有相同的GC含量、引物熔解溫度和擴增子長度,也會以不同的效率進行擴增。若引物設計不夠好,會導致RPA在瓊脂糖凝膠電泳和側向流動分析試紙的情況下出現拖尾[44]。在擴增過程中沒有熱循環會增加形成引物二聚體的風險,這也是許多目前等溫檢測中最具挑戰性的問題,研發新型等溫擴增技術專屬的引物設計軟件,該軟件若在達到這些等溫擴增技術引物本身要求的同時,又可自動規避引物二聚體形成,這將在一定程度上有效解決引物設計所帶來的一系列技術問題。

2.2 擴增產物需純化

重組酶等溫擴增技術擴增時需與重組酶、DNA聚合酶與單鏈DNA結合蛋白等多種酶充分接觸,共同作用,達到短時成倍擴大目的基因的效果。檢測結果判斷方式多樣,常見的有瓊脂糖凝膠電泳[45]、實時熒光定量[46]、側流層析試紙條[47]與CRISPR/Cas聯動系統[48]等。但反應結束后,大量酶殘留在反應體系中,在對RPA產物采用AGE檢測時,會導致電泳條帶出現抹帶現象,影響結果判別,因此需要進行產物純化[44],同時,通過加入酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1,體積比)進行純化處理,以除去蛋白雜質,吸取上清液進行后續檢測[49],同時還需要注意操作過程中氣溶膠的產生與擴散,防止交叉污染。

2.3 假陽性

近年來,分子生物學發展迅速,有著不需要控溫設備、檢測時間短等優勢的等溫擴增技術現已開始逐步應用于寄生蟲蟲體鑒定或病原檢測,并顯示出非常廣闊的應用前景。需要注意的是,新型的等溫擴增技術克服了傳統檢測技術的缺點,但任何一項新興技術總有其相應的不足之處。LAMP反應受自身原理所限,需使用多個引物進行擴增,而這會增加引物與引物的非特異性擴增的風險,導致假陽性結果[50]。多年來,其已與各種分子方法(如實時和多重檢測方法)相結合,并結合各種比色和視覺檢測方法,輕松識別陽性樣品[51]。目前較新穎的RPA亦不例外,如引物長度需控制在30 bp左右,若長度過短則會導致引物之間的非特異性結合,使結果出現假陽性結果。因此,在以后發展中需不斷優化技術反應條件,避免假陽性結果的產生。

3 結論和展望

寄生蟲疾病仍是當今社會關注的重點感染性疾病之一,傳統檢測技術的不成熟是導致寄生蟲病原從魚體到水源性食品,再到餐桌的重要原因。由于寄生蟲本身復雜的生物學特性限制,傳統病原學檢測技術目前仍是檢測寄生蟲的金標準,其不僅依賴檢測人員豐富的經驗積累,有關的便攜式儀器也少之又少,無法實現真正意義上的快速檢測?；诜肿由飳W的新型等溫擴增技術是對寄生蟲疾病的早期預防與診斷重要保障,不僅可限制食源性寄生蟲類疾病的傳播,更能促進相關食品工業的發展。

隨著經濟快速發展,人們健康意識不斷提高,對寄生蟲病診斷要求也不斷提高,研發快速新型檢測技術的重要性也愈加突顯。高靈敏度、準確、簡便及快速、高通量、低成本等溫擴增技術是水產品中寄生蟲檢測技術研發的趨勢。因此,可通過多種技術組合,優勢互補,如將等溫擴增技術與生物傳感器、側流分析和微流體設備聯合使用將有望成為檢測寄生蟲的新方法,這有助于實現更加快速的分子診斷,但核酸提取等前處理步驟仍難以在實驗室外實施,仍需一個包含現場檢測所有必要工具的便攜式手提包,里面可裝有迷你離心機、移液管、手套、操作說明書等。這將為寄生蟲檢測領域的發展開辟一個新的局面,為我國寄生蟲檢測方法和技術的創新以及寄生蟲檢測能力的提高提供參考。