基于文獻計量分析益生菌微膠囊化研究現狀及發展趨勢

黃鎮宇,徐磊,孫培龍,楊開,蔡銘,王艦

(浙江工業大學 食品科學與工程學院,浙江 杭州, 310014)

益生菌泛指可在宿主腸道內定殖并改善微生態平衡、有益機體健康的一類微生物。近年來,腸道菌群對于人體健康的關鍵作用不斷得到揭示,高效益生菌遞送系統的開發成為研究熱點[1-2]。益生菌產品的生產、儲存與運輸都會造成活力損失,而在益生菌被攝入之后,仍然需要面對食物組分互作、強酸性pH環境以及各類消化酶的挑戰[3]。為了在到達腸道前為益生菌提供必要的保護,微膠囊化是當下的最優解,常見的途徑包括擠壓、乳化、凝聚、凍干和噴霧干燥[4-5]。除了增加穩定性與細胞活力外,微膠囊化后的益生菌往往還具備控制釋放與腸道黏附作用。如今,益生菌微膠囊已經逐漸應用于乳制品、巧克力甚至谷物食品中,但是這項技術的工業規模應用仍存在許多問題亟待解決[1]。菌種與壁材之間的生物相容性及不同微膠囊制備技術需要驗證,還要考慮多種環境脅迫因素對產品穩定性的影響。同時,為確保益生菌微膠囊的健康益處,要進一步解析對體內消化脅迫的抵抗力,調控益生菌膠囊在消化道中的控制釋放。有關研究仍在不斷涌現,由于益生菌菌種、壁材以及封裝策略的種類繁多,一般的系統性綜述難以具體量化它們的演變趨勢,需要借助文獻計量工具對科學文獻進行大規模統計分析,深入探索以推進其產業化。

文獻計量分析可以系統梳理國內外相關研究的熱點遷移、發展脈絡與前沿方向,展示國家與機構間合作關系,聚焦關鍵論文,此類研究方式已經在食品領域得到大量應用[6-7]。主流的文獻計量軟件包括CiteSpace、Vosviewer、Gephi、Histcite等,其中CiteSpace是一個動態的引文可視化平臺,由于功能豐富常被作為研究者的首選[6]。此外,基于R語言的bibliometrix軟件包也可以實現類似的功能[8]。文獻計量學應用了數學與統計學方法,對已發表文獻進行定量分析與描述,科學高效地探索、分析、聚類特定領域的知識?？蒲姓撐氖腔A科研成果的主要轉化形式,借助文獻計量學繪制科學知識圖譜,本研究直觀展現了益生菌微膠囊化領域內的信息全景,預測了未來發展趨勢,有助于指導開辟新的研究方向。

1 文獻計量分析策略

1.1 文獻來源

中英文文獻分別采集于China national knowledge infrastructure(CNKI)數據庫與Web of Science(WOS)數據庫,檢索策略如表1。納入文獻池的文獻均發表于學術期刊,排除會議論文、碩博士論文以及科普論文等,剔除重復發表文獻。文獻的發表時間為2004年1月至2023年3月。

表1 文獻檢索策略Table 1 Search strategies for literature

1.2 研究方法及數據處理

檢索收集得到的中英文文獻以完整記錄的方式分別導出為Refworks格式與純文本(plain text file)。CiteSpace6.1.R6 (64-bit) Advanced主要用于實現關鍵詞、機構等信息的聚類或共現,進行數據處理時,時間切片設置為1年,閾值(Top N)設置為50。Vosviewer1.6.19、Gephi0.10.0與Microsoft Charticulator用于繪制國家合作網絡圖。Bibliometrix平臺和ggplot2軟件包用于分析關鍵詞頻次與繪制分布熱力圖。在科學知識圖譜中,節點的大小代表了權重或出現頻率,網絡密度從宏觀上表示不同節點聯系的強弱,2個節點間的連線表示兩者同時出現的概率,連線越粗概率越大。

2 結果與分析

2.1 年度發文數量

年度發文量是體現特定研究領域發展速度的重要指標之一[9]。如圖1-a所示,益生菌微膠囊化研究領域在2004年1月至2023年3月共發表文獻1 438篇,其中中文202篇,英文1 236篇。從發表趨勢來看,2009年前國內外發文量普遍偏低;2010—2013年期間英文文獻發表速度顯著增長,說明相關研究正處于起步階段;2017—2022年期間,中英文文獻年度增長速度均提升較快,處于快速發展階段(2023年的文獻統計僅截止3月底)。英文文獻無論是整體發文量還是增長速率都要遠高于中文文獻,表明有關研究趨向國際化發展。

a-年度發文量統計;b-國內主要發文機構;c-國外主要發文機構;d-國際合作網絡圖1 年度發文量統計與國內外主要發文機構以及國際合作網絡Fig.1 Annual publication statistics, domestic and foreign major publishing institutions and international cooperation network

2.2 主要發文機構與國家合作網絡

通過分析發文機構與國際合作網絡,可以對益生菌微膠囊化研究領域內科研資源的分布與儲備進行討論,國內外機構合作網絡如圖1-b和圖1-c所示。主要發文機構基本為高等院校,機構間合作通常展現很強的內聚性與地域性[10]。中文文獻中的合作往往只在較少的幾個機構之間進行,大多數科研成果僅涉及2～4個機構。國際機構間的合作更加密切,最大中介中心度是江南大學的0.05,體現了中國機構在該領域國際合作中的主導地位。江南大學在國內的合作網絡也最為龐大,科研實力雄厚。一般來說,機構的中心度高于單一作者但是低于某個國家,這個中心度水平上較難形成清晰的差異網絡[9,11]。伊斯蘭阿扎德大學(Islamic Azad University)的發文量在所有機構中位居第一,為27篇。其次是加拿大農業食品協會(Agriculture and Agri-Food Canada)與圣保羅大學(University of Sao Paulo)并列第二,均為21篇。4個中國機構的發文量入圍全球前20,分別為江南大學(12篇)、東北農業大學(10篇)、南昌大學(10篇)與中國科學院(9篇)。發文量前3的國家依次是中國(184篇)、巴西(124篇)與伊朗(118篇),其余前10的國家為美國、印度、澳大利亞、加拿大、西班牙、法國和英國。中國、美國、印度等國家的國際合作伙伴較為豐富,而巴基斯塔、韓國等國家在這方面有所欠缺(圖1-d)。我國雖然發文量位居榜首,但起步時間較晚,中心度僅為0.15,遠低于英國的0.36與美國的0.29。這說明我國仍然處于國際合作網絡的外圍,核心競爭力有待進一步提升[9]。

2.3 高被引文獻

文章被引次數受到領域熱度、作者數量等因素的影響,是文章價值的直觀反映[8]。表2顯示了益生菌微膠囊化相關的前10篇高被引文獻?！癛ecent advances in microencapsulation of probiotics for industrial applications and targeted delivery”被引用1 255次,是引用量最高的文章,重點綜述了多糖相關的聚合物封裝系統,如淀粉、殼聚糖、醋酸鄰苯二甲酸纖維素、藻酸鹽以及蛋白-多糖混合物[12]。而“Progress in microencapsulation of probiotics:A review”僅發行2年,就獲得了175次引用。該研究重點討論益生菌在儲存和腸胃道系統中面臨的挑戰,同時提出多種遞送系統效率評估的新興手段,包括體內成像系統(invivoimaging system,IVIS)、計算機輔助體外消化模型(dynamic gastrointestinal simulator,SIMGI)等[13]。引用量最高的研究論文“Microencapsulation of a probiotic and prebiotic in alginate-chitosan capsules improves survival in simulated gastro-intestinal conditions”開發了一種海藻酸鹽-殼聚糖膠囊,顯著提高了益生菌在體外消化模型中的存活率,同時發現槲皮素等益生元會威脅益生菌的生理活動,應當單獨膠囊化[14]。

表2 益生菌微膠囊化前10篇高被引文章Table 2 Top 10 high-cited article in field of probiotic microencapsulation research

2.4 關鍵詞聚類分析

關鍵詞聚類分析旨在揭示本領域內研究人員主要探討的焦點問題[6,11]。CiteSpace聚類分析結果顯示,中文文獻的模塊化數據Q=0.564 3>0.3,S=0.859 7>0.5,網絡密度為0.019 1;英文文獻的Q=0.308 8>0.3,S=0.678 2>0.5,網絡密度為0.025 2,表明關鍵詞間聯系緊密,聚類效果良好[15]。英文文獻由于數量豐富,主題更加多元化,因此Q值、S值與單個關鍵詞中心度都會有所下降[11]。如圖2與表3所示,“乳酸菌(lactic acid bacteria)”“存活率(survival)”“海藻酸鹽(alginate)”等關鍵詞在中英文文獻中出現頻次都很高,占據主導地位,體現了益生菌微膠囊化研究中常用的菌種、壁材以及評估手段。英文文獻中中心度最高的關鍵詞為“嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)”,其次是“乳酸菌(lactic acid bacteria)”,這表明乳酸菌是研究中最常使用的一類益生菌?！皣婌F干燥(spray drying)”說明噴霧干燥在過去20年中是研究最廣泛的微膠囊化手段,而“模擬胃腸狀況(simulated gastrointestinal condition)”是益生菌封裝效果評價的必要步驟。英文文獻的簇呈現更強的內聚性,說明相關研究可能更加全面,涉及更多表征技術與評價指標。

a-中文文獻關鍵詞;b-英文文獻關鍵詞圖2 益生菌微膠囊化中文及英文文獻關鍵詞聚類分析Fig.2 Keyword cluster analysis of probiotic microencapsulation research in Chinese and English literature

表3 益生菌微膠囊化中英文文獻10個主要關鍵詞Table 3 Top 10 main keywords of probiotic microencapsulation in Chinese and English literature

2.4.1 菌種

益生菌以乳酸菌為主,包括雙歧桿菌、腸球菌、鏈球菌等。此外,芽孢桿菌與酵母菌也屬于益生菌的范疇[16]。它們的益生機制是競爭性排斥各類病原體,形成更健康的腸道環境,產生短鏈脂肪酸和細菌素等活性物質。不同益生菌菌種的益生功效各不相同,主要取決于自身的生理活性與代謝產物的屬性。乳酸菌在相關研究中占據主導地位,在中文關鍵詞聚類結果中排名第四(#A3乳酸菌),英文排名第二(#B1 乳酸菌lactic acid bacteria)?！笆人崛闂U菌(lactobacillusacidophilus)”的頻次達到154次,是最常使用的微膠囊化對象之一,其他如干酪乳桿菌和格氏乳桿菌等都是典型的乳酸菌,這是因為乳制品(牛奶、奶酪等)往往是最受消費者歡迎的益生菌產品形式[17]。乳酸菌還作為功能發酵劑賦予傳統食品營養與藥理價值,如韓國的泡菜、愛爾蘭的切達干酪、泰式辣醬等。與傳統發酵相比,微膠囊乳酸菌的發酵速度更快、細胞密度更高、使用周期長,還可以去除有毒的疏水物質[18]。除乳酸菌外,酵母菌等其他益生菌的封裝策略亦有報道[2,19]。

2.4.2 壁材

壁材是影響益生菌微膠囊加工、儲存與消化穩定性的關鍵因素。中文文獻中以殼聚糖(#A6 殼聚糖)為代表的多糖在過去20年中是研究關注最多的壁材。殼聚糖是一種線性多糖,通過來源豐富的幾丁質脫乙?；频?與纖維素和幾丁質具有類似的化學結構,但作為包埋材料,一般不單獨使用。例如,KIM等[20]研究了殼聚糖-植酸、殼聚糖-植酸-淀粉以及殼聚糖-植酸-CaCO33種壁材對嗜酸乳桿菌的保護作用,殼聚糖-植酸-CaCO3膠囊的負載容量最小但是抗酸能力最強,掃描電鏡顯示其微觀結構最為致密。而殼聚糖-植酸-淀粉膠囊的外層起皺,呈現半透明狀,儲存穩定性較好。此外,殼聚糖還能夠與羧甲基魔芋葡甘露聚糖作為羅伊氏乳桿菌保護劑,并形成穩定的W/O/W雙乳液[21]。雙乳化益生菌的活性一定程度提高,但在腸胃道中不太穩定,可能導致突然釋放,控釋效果較差。同時,海藻酸鹽的濃度可以通過調節其與羧甲基魔芋葡甘露聚糖-殼聚糖之間的氫鍵影響水凝膠的溶脹行為,對釋放調節起到一定效果。

藻酸鹽也屬于傳統包埋材料,海藻酸鈉在中文文獻的主要關鍵詞頻次排名第4,“藻酸鹽(alginate)”在英文文獻中排名第8。藻酸鹽也常與其他材料復合使用,純藻酸鹽甚至可能對益生菌產生負面影響,且幾乎沒有任何抗氧化活性。例如,在添加了一種果膠后,干酪乳桿菌對氧化損傷的抗性增強,膠囊表面的裂隙減少,持水能力增強,鈣離子誘導產生的細胞活力損失減少[22]。董陽等[23]評估了內源乳化法封裝乳酸菌的效果,發現當海藻酸鈉質量分數為3%,CaCO3和海藻酸鈉質量比為1.5∶9,水油質量比為30∶120時,包埋率最高可達86.3%。該研究進一步比較了只使用海藻酸鈉與海藻酸鈉-殼聚糖聯用時的益生菌穩定性,復合膠囊的耐胃腸液的效果更好,但是釋放速度較慢。此外,海藻酸鈉對乳桿菌生產的乙醛脫氫酶同樣具有突出保護效果,未經包埋的2種菌體中的乙醛脫氫酶在體外消化進行到30 min時就已完全失活,經過脫脂乳和海藻酸鈉包埋后,消化180 min后酶活力保持率高達73.4%[24]。

其他多糖如果膠、麥芽糖糊精、黃原膠、明膠、k-角叉菜膠等均具備形成三維網絡的能力[25]。明膠、黃原膠、卡拉膠等已經是成熟的工業原料,獲取途徑豐富,成本低廉?？剐缘矸鄣目姑附庑再|優越,其本身含有多羥基基團,適合構建涂層材料。但抗性淀粉也會在一定程度上阻礙益生菌在腸道的釋放與定殖,主要用于設計緩釋體系[26-27]?？剐院司哂蟹庋b能力,其本身就是一種益生元,有助于誘導形成對人體健康有利的腸道微生物群落[28]。研究報道,糊精通過抑制幾種糞便酶(如β-葡萄糖醛酸酶和α-葡萄糖苷酶)活性,可有效降低結腸癌風險[26]。隨著機械強度的提高,模擬胃液的擴散受到限制,益生菌細胞膜完整性提高。但是膽汁鹽的擴散程度很難被這種結構較簡單的微膠囊抑制,無論封裝與否,處理過后的益生菌細胞膜完整性均在4%以下。這說明膽汁鹽造成的細胞損傷往往比酸脅迫更嚴重,需要尋找并發展新的壁材。

2.4.3 微膠囊技術

微膠囊技術借助具有一定生物相容性的材料,通過構造物理屏障顯著提升益生菌對環境脅迫的抵抗能力。中文文獻中的相關關鍵詞是固定化 (#A4 固定化)與工藝優化(#A7工藝優化),說明微膠囊技術是重要的研究內容,但這兩個簇標簽沒有提供更多的信息。由圖3-b中聚類結果可知,噴霧干燥(#B3 噴霧干燥)的影響力很強,它與凝聚技術的成本是最低廉的。噴霧干燥技術首先霧化物料,然后通過短時間脫水達到干燥的目的。噴霧干燥得到的微膠囊粒度很小,質地相對均勻,但是高溫氣流會造成益生菌活力損失,對壁材的要求比較嚴苛[17]。冷凍干燥的封裝效率和細胞存活率通常高于噴霧干燥,但是生產效率較低且成本昂貴[29]。值得一提的是,新開發的噴霧冷凍干燥技術是將霧滴與-70 ℃的逆流氣體瞬間接觸,能最大程度保留益生菌活性。無論是與傳統的噴霧干燥還是冷凍干燥相比,噴霧冷凍干燥后益生菌活力都要更高[30-31]。但是,在噴霧干燥時,有機酸會增強粉末的黏性從而降低干燥效率,需要盡可能去除[32]。果汁中的酚酸和內酯也會造成益生菌活力喪失,蔓越莓汁對乳桿菌和雙歧桿菌的傷害要大于橙汁與菠蘿汁[33]。

a-CNKI數據庫關鍵詞時間線圖;b-WOS數據庫關鍵詞熱力圖圖3 CNKI數據庫關鍵詞時間線圖與WOS數據庫關鍵詞熱力圖Fig.3 Keyword timeline diagram of CNKI database and keyword heat map of WOS database

其他微膠囊化技術包括離心擠壓、靜電紡絲/電噴霧、沖擊氣溶膠、流化床包衣等,早期較多配合保護劑使用冷凍干燥技術[16]。冷凍干燥利用了升華,分為冷凍、初級干燥和二級干燥3個階段,但是自由水可能會形成損害細胞的冰晶[34]。靜電紡絲與電噴霧主要區別是溶液黏度,靜電紡絲的聚合物溶液黏度較高,在封裝藥物和各類營養活性物質上已有進展。MA等[35]利用靜電紡絲技術將4種乳桿菌包裹在阿拉伯樹膠-支鏈淀粉形成的納米纖維中,并借助普魯蘭多糖提供可紡性,益生菌存活率顯著高于冷凍干燥。借助掃描電子顯微鏡分析,發現隨著阿拉伯樹膠比例的提高,納米纖維的直徑不斷減小,但是超過60%后可能出現紡錘狀的缺陷。噴霧氣溶膠技術的優勢在于生產的膠囊直徑較小,平均尺寸為30～50 μm[36]。

2.4.4 存活率與理化性質

存活率(#A5存活率)的評估貫穿整個生產-加工-消費過程,是膠囊化效果最重要的指標之一。簡單的微膠囊益生菌活性評估只需將膠囊分散在蛋白胨溶液中,均質化后進行平板涂布,培養一段時間進行活菌計數[37]。這種評價方式簡單快速,可以作為商業化用途,但是準確性有待商榷。根據SUN等[38]的研究,使用聚多巴胺封裝的細菌生長曲線表現出滯后性,這可能導致計算得到的活菌濃度較實際值偏低。用高速離心機破碎膠囊壁后涂布則可能導致部分益生菌受到機械破壞而失去活性,同樣可能導致測定結果偏低。因此,存活率的評估方式應當是效率、成本以及應用場景等因素的折衷。其他理化性質的測定可以指導益生菌微膠囊產品的生產過程。環境抗性用抗熱性、抗酸性以及抗機械剪切等參數體現,包封的完整程度可以使用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)或激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)表征,靜態光散射分析和粒度分析用來測定顆粒大小。對于添加在乳制品中的益生菌微膠囊,乳化行為與微觀流變學測試也是必要的,可能還需要額外的巴氏消毒穩定性與絮凝聚結度評估[39]。

2.4.5 模擬消化

益生菌的脆弱性大大降低了它們在胃腸道轉運過程中的活性。英文文獻的關鍵簇#B4 模擬胃腸狀況(simulated gastrointestinal condition)和#B7健康狀態(health status)都說明了需要體外或體內實驗對控釋能力與益生效果進行檢驗,但是在中文文獻中相關研究較少,未能出現相關簇。封裝完成的微膠囊,針對性構建人體腸胃道(gastrointestinal tract,GIT)模型探究保護效果與釋放速率,對于不必要的消化液可以適當簡化。除了體外腸胃消化外,還可以使用志愿者的糞便補充結腸發酵實驗,體外發酵用于確定包封的益生菌是否更易形成優勢種[40]。體內實驗多采用小鼠作為模型,相較體外實驗更具說服力。如果該材料對小鼠健康有害,可能出現體重減輕、疾病活動指數增加、結腸長度縮短與糞便異常。益生菌在腸道中的靶向作用與駐留能力比較能借助光聲成像實現,腸道組織切片或腸道外翻實驗分析黏膜、絨毛完整性以及是否出現病變[41]。最后,依據生化和血液學進行系統的毒理學評價是特定材料-菌種應用到食品生產中的必需環節。

2.5 關鍵詞演化

圖3-a顯示,多孔淀粉、變性淀粉與乳清蛋白等材料在2010年左右開始應用,而豌豆蛋白、大豆蛋白、海洋寡糖和丁香精油等出現較晚?！叭斯の敢骸?、“模擬胃液”、“膽汁酸鹽”等消化模擬材料幾乎貫穿了整個時間軸,突出體外消化實驗的重要性?！皵嗄套胸i”首次出現在2009年左右,說明益生菌微膠囊有助于改善動物飼料品質[42]。微膠囊化益生菌在“凝膠糖果”、“爆爆珠”、“高鹽干酪”等食品中的添加集中在2015年之后,“合生元”首次出現在2023年,符合國際研究趨勢[43]。圖3-b為WOS數據庫中的學術產出增長情況,可以看出“雙歧桿菌(bifidobacteria)”和“存活率(survival)”在過去20年內一直是相關研究的重要內容?！霸逅猁}(alginate)”近2年熱度開始消退,“果膠(pectin)”“菊粉(inulin)”和“殼聚糖(chitosan)”在2016～2017年得到的關注度最高,說明研究者在持續探索新型材料與組合?！皟Υ?storage)”的研究逐年遞增,或將成為未來研究熱點?！皣婌F干燥(spray drying)”的熱度在2020—2021年完成了對“冷凍干燥(freeze-drying)”的超越,并持續增長。2023年的數據不完整,因此不具備參考意義。

3 展望與熱點預測

本研究全面分析了益生菌微膠囊化領域內的研究現狀、研究方向與熱點,同時也應當說明一些局限性,因為CiteSpace、VOSviewer、bibliometrix等軟件只能進行單語言分析,本文只建立了中英文文獻池,沒有收錄其他語言撰寫的高質量論文,可能導致研究結論存在輕微的偏差。為了更清晰地展示最新突現的研究內容、緊抓研究熱點,本文整理了代表益生菌微膠囊化研究領域新興趨勢的15個關鍵詞(表4),結合上文的可視化分析,提出對益生菌微膠囊化未來研究的建議與展望。

表4 代表益生菌微膠囊化研究領域新興趨勢的15個關鍵詞Table 4 Top 15 keywords representing emerging trends in probiotic microencapsulation research

眾多研究證明了益生菌對人體健康的益處,包括調節腸道菌群組成、修復上皮組織、增強免疫力、治療炎癥性腸病、降低膽固醇和血脂,甚至抑制腫瘤和癌癥[45]。如何選擇合理的益生菌-壁材組合一直是益生菌微膠囊化領域的重要議題,根據圖3-b,植物乳桿菌、嗜酸乳酸桿菌、鼠李糖乳桿菌等是過去使用最多的菌種。而嗜黏蛋白阿克曼氏菌(A.muciniphila, 強度3.05)、大腸桿菌(E.coli, 強度1.99)和枯草芽孢桿菌(B.subtili, 強度2.12)在2020—2021年間獲得大量關注并持續至今(表4)。盡管大部分大腸桿菌都是有害菌,但其中的大腸桿菌Nissle1917(EcN)是熱度最高的益生菌之一,在臨床上治療炎癥性胃腸功能障礙,同時具有腫瘤靶向作用[46]。將枯草芽孢桿菌和乳酸菌共培養或者封裝,枯草芽孢桿菌產生的過氧化氫酶、枯草桿菌蛋白酶和ε-聚谷氨酸可以促進乳酸菌的生長活力,提高冷凍干燥過程中的存活率[47]。

我國法規規定不提倡以液態形式生產益生菌類保健食品活菌產品。因此,益生菌的微膠囊制備是益生菌加工產業的核心,而壁材的更新有助于更高效的產品生產與儲存、更優越的消化穩定性質以及更強的腸道定殖能力。早期的封裝材料多為藻酸鹽、殼聚糖、淀粉、蛋白質等,以乳清蛋白、大豆分離蛋白為代表的蛋白質常用于與多糖形成多尺度復合物(圖4)。隨著新材料的開發,菊粉(inulin, 強度3.49)的參與度提高。關鍵詞中近年出現的酚類化合物(phenolic compound, 強度5.44)和多酚(polyphenol, 強度2.05)強度最高,是實現納米封裝的優越材料,可以為細胞提供前所未有的特性,抵抗高溫與紫外線的傷害,生物相容性比殼聚糖更好[19,48]。利用這項技術制作的人工孢子能有效延長益生菌儲存壽命,在生產加工與運輸時,誘導產生的生物防御機制使其在壓力環境中處于休眠狀態。而當環境變得溫和之后,細胞活力又會重新恢復。多酚材料的生物相容性好,可以直接與細胞接觸,通常有2種形成機制(圖4,改編自文獻[49])。一種是鄰苯二酚在氫鍵、疏水作用力等的作用下自發聚合形成薄膜,另一種則需要鄰苯三酚通過三價金屬離子配位聚合。多酚封裝的菌體往往更加穩定,如茶多酚涂層會使天然酵母在指數增長之前表現約4 h的延滯期[19]。鑒于生物聚合物網絡的孔徑一般較大,氫離子與少部分消化酶仍能通過自由擴散通過壁材。采用逐層策略(layer-by-layer, LbL)包封的益生菌抵抗酸性環境與膽汁鹽的能力更強,通過口服強飼法和生物發光實驗可以定位腸道內的益生菌,進一步調整壁材組成與結構還可實現定點釋放[2]。此外,酶作為一種具有高度催化效能的生物大分子,參與制備的微膠囊更具可設計性。人工酶武裝的雙歧桿菌能夠緩解腸道炎癥,保護結腸上皮細胞免受病理損傷并降低促炎因子與活性氧水平。在腸炎小鼠體內,香農熵減少,表明生物多樣性減少。厚壁菌門的相對豐度增加,它們與炎癥狀態呈負相關,說明微生物群失調得到改善[41]。

圖4 兩種不同的多酚網絡形成機制[49]Fig.4 Two different mechanisms of polyphenol network formation

除壁材外,微膠囊造粒的微觀尺度也是重要的考量因素,盡可能實現納米級封裝或單細胞封裝會顯著提升微膠囊的功能性質。早期凝膠珠的粒度在微米級或者毫米級,通過二價陽離子溶液在水凝膠中的簡單注射制備得到。而益生菌的直徑一般為0.5～5 μm,每個單元內包含大量益生菌,效果不佳?，F多采用的納米膠囊化手段又可以分為納米纖維、納米顆粒(nanoparticle, 強度3.64)與納米乳液,前者固定化效果較好,適應電流體動力學加工技術[50]。蛋白質與脂質的另一個重要特性就是可以發生乳化,與其他材料復配后可以采用微流控乳化技術,包封率高,膠囊尺寸更小,脂質還具有阻斷H+的潛力[51-52]。SILVA等[53]將植物脂肪作為壁材,在9%的NaCl溶液或25%(均為質量分數)的蔗糖溶液中有效地保護益生菌,擴展在糖基食品和高鹽食品中的應用場景。將益生菌與茶蛋白-黃原膠皮克林乳液混合之后再進行3D打印,打印前后細胞活力幾乎不受影響,為益生菌產品的生產提供了新思路[54]。在封裝策略上,溫度(temperature, 強度2.27)逐漸成為重要的考量因素。此外,還要盡可能形成單包封結構,通過增加表面積/面積比提高生物利用度和腸道黏附能力[5]。

傳統的微膠囊化技術通常不會形成多層結構,無法應對消化道復雜的物理化學環境或提供良好的腸道黏附能力,終產品可能在同類產品中競爭力不強。逐層組裝技術可設計的空間大,厚度可以控制在納米級,需要保留材料上的表面電荷,在反復交替沉積帶有相反電荷的聚電解質形成功能薄膜,可以實現控制釋放(controlled release, 強度2.61)和定點遞送(targeted delivery, 強度2.82)[55]。將殼聚糖作為陽離子聚合物與不同分子質量的普朗尼克(聚丙二醇與環氧乙烷的加聚物)合成聚電解質逐層包裝德氏乳桿菌,膠囊足以保護益生菌免受腸道疾病的影響,噬菌體、細菌素或潛在的有害酶被阻斷,但單糖、雙糖、氨基酸與小分子肽滲透性良好,表明包被益生菌在釋放之前的正常生理活動仍能維持[3]。MOKHTARI等[56]同樣采用逐層封裝策略,在兩層藻酸鹽層中夾入一層釀酒酵母細胞壁,彌補了藻酸鹽抗酸差的缺點。盡管這種封裝方式對嗜酸乳桿菌是高效的,但由于雙歧桿菌對低pH環境抵抗力很差,無論是藻酸鹽層還是酵母細胞壁都沒有展現明顯的保護作用?？赡苄枰l展具有生物活性的膠囊,抑制H+的自由擴散。

4 結論

腸道菌群的重要性被持續揭示,如何保護益生菌到達腸道并順利定殖引發廣泛關注。本文利用多款文獻計量軟件繪制了過去20年內益生菌微膠囊化領域內的科學知識圖譜,為把控熱點研究趨勢提供重要參考。從關鍵詞的分析結果看,微膠囊壁材正在逐步從藻酸鹽、殼多糖等向其他材料轉移,噴霧干燥技術也得到更多關注。本文還重點綜述了最受關注的菌種、封裝材料與技術以及封裝效果的評價方式,并提出新的見解與研究展望。隨著研究不斷深入,益生菌微膠囊化技術還將與新興技術結合,如CRISPR/Cas9等基因編輯技術用來控制益生菌細胞膜的特異性表達,與3D打印技術的聯合要求微膠囊混入水凝膠后具有良好的流變學表現。綜上所述,預測未來研究會主要集中在兩個大類:一是新型微膠囊壁材的開發與理化性質分析;二是創新微膠囊化技術與體內體外評價體系。益生菌微膠囊化技術已儼然成為益生菌研究的一大熱點,將持續助力大健康產業的蓬勃發展。

體系最上層為細胞生長所必須的DMEM 培養基,而后是附著有細胞的蓋玻片,最下層為含有乳桿菌的MRS 瓊脂培養基,粘液層位于MRS 培養基與蓋玻片中間。

響應面試驗結果及分析

(A)、混菌添加量(B)、食鹽添加量(C)、發酵時間(D)的較優水平,以模糊綜合感官評分為響應值進行Box-Behnken 響應面優化試驗,試驗結果如附表1所示。

利用軟件Design-Expert8.0.6 得到二次多項回歸方程為:

Y=8.31+0.22A+0.56B+0.098C-2×10-3D-0.22AB+0.058AC+0.051AD-0.21BC-0.032BD -0.058CD-0.35A2-0.52B2-0.37C2-0.32D2

如附表2所示,回歸模型效果顯著(P<0.01),失擬項不顯著(P>0.05),并且該模型能解釋96.7%(R2=0.9670)響應值的變化。該模型校正系數(RAdj2=0.9341)接近于1,線性相關程度密切。這些參數表明此回歸模型效果較好。從附表2還可知XZ3與Y50的添加比例(A)、混菌添加量(B)、AB、A2、B2、C2、D2對模糊綜合感官評分影響極顯著(P<0.01),且各因素對鲊辣椒感官評分影響作用的大小順序為混菌添加量(B)>XZ3∶Y50(A)>食鹽添加量(C)>發酵時間(D),說明混菌添加量和XZ3與Y50的比例對鲊辣椒發酵品質影響較大。

各因素交互項的響應面及等高線,如附圖1 所示。曲面圖越陡表示交互作用越強,反之,則交互作用越弱?？梢奨Z3 與Y50 的比例(A)和混菌添加量(B)之間的交互作用強于其他因素的交互作用。