卵母細胞與顆粒細胞的交互作用

黎 婷

(蕪湖職業技術學院,安徽 蕪湖 241000)

哺乳動物卵子發生起源于胚胎階段,首先發育成為生殖祖細胞(primordial germ cells,PGCs),當PGCs遷移到胚胎性腺后發育成為卵原細胞,開始進行減數分裂成為卵母細胞,并停留在雙線期,個別卵母細胞被單層扁平顆粒細胞包繞形成原始卵泡[1].之后當卵母細胞開始生長,單層扁平顆粒細胞變為立方形,并增殖形成多層次結構,被泡膜間質細胞包繞,從而形成次級卵泡,次級卵泡繼續發育形成卵泡腔,成為有腔卵泡,而顆粒細胞分化形成卵丘顆粒細胞,圍繞次級卵母細胞行成卵丘.雌性動物開始發情后,周期性分泌促性腺激素促進囊狀卵泡中的卵母細胞完全成熟,繼續完成減數分裂Ⅰ和減數分裂Ⅱ,繼而排卵[2-3].

卵泡的發育受到下丘腦-腦垂體-卵巢軸中不同水平的激素調控,主要有下丘腦分泌促性腺素釋放激素、垂體前葉分泌促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)促黃體素(luteinizing hormone,LH).卵巢產生雌激素[4].FSH刺激顆粒細胞增和顆粒細胞內的芳香化酶的活性,使雄激素轉化為雌激素,增加雌激素的水平和促進子宮內膜的增殖,可用于誘發排卵或超排卵.初級卵泡到腔前卵泡中都表達FSH受體,受其促生長和抗凋亡作用形成有腔卵泡,FSH在卵泡發育中發揮主導作用[5].

在發現卵母細胞內源性生長因子之前,普遍認為卵母細胞的生長是受到單向調控,顆粒細胞提供營養成分,而FSH調控顆粒細胞的增殖[6].通過內分泌學和超微結構研究發現,位于卵母細胞和顆粒細胞之間的縫隙結合部存在物質轉運,二者之間有豐富的物質聯系,如顆粒細胞通過縫隙結合部提供小分子物質,如營養素、分子信號等調節卵母細胞發育和成熟,卵母細胞產生自源性生長因子GDF9和BMP15,卵泡發育受到卵母細胞和顆粒細胞的雙向調控[7].

1977年,Eppig[8]使用卵母細胞體外培養體系首次進行系統性研究,利用未成熟卵母細胞體外培養獲得成熟卵母細胞的新技術.近年來已有體外培養小鼠、牛等多種動物的胚胎干細胞和誘導多潛能干細胞,獲得成熟卵母細胞的研究報道[9].該繁殖技術已被廣泛應用于試管嬰兒、遺傳改良等人和動物的生殖研究,以期改善人類生活、產生更大的經濟效益[10].

1 顆粒細胞對卵母細胞的作用

1.1 卵母細胞和顆粒細胞間的結構連接

原始卵泡外周被前顆粒細胞直接圍繞,進入生長期后很快產生透明帶包繞卵母細胞,將其與顆粒細胞隔開,而顆粒細胞會形成胞質突,穿過透明帶,仍和卵母細胞維持一定的直接接觸[11].大部分胞質突由富含肌動蛋白絲的主鏈構成,小部分由微管蛋白構成,因此顆粒細胞層中遠層的顆粒細胞仍能保持和卵母細胞的直接聯系[12].胞質突的數量和形狀隨著卵泡發育發生動態變化,促進卵母細胞生長,在體外培養中胞質突顯著減少,添加雌二醇和FSH可緩解胞質突的減少,提高卵母細胞體外培養成熟率[13].

在胞質突的頂端,顆粒細胞與卵母細胞之間的縫隙結合部,形成胞間通道,允許離子和小分子物質(<1kDa)直接通過,縫隙結合部由連接蛋白類組成,6個連接蛋白寡聚體化形成1個連接子,相鄰細胞間(卵母細胞和顆粒細胞間、卵泡的顆粒細胞間)的兩個連接子組成通道,從而形成縫隙結合部[14].另外一些觀點認為,顆粒細胞、卵泡(包括卵母細胞,不包括泡膜細胞,二者被基膜分離)形成功能性胞體,小分子物質如氨基酸、核酸、代謝產物和cAMP等都通過顆粒細胞的縫隙結合部,與卵母細胞進行物質交換,這對卵泡發育至關重要,如小鼠卵母細胞不能合成Cx37(Connexin37,細胞連接蛋白37),卵母細胞只能發育為正常體積的74%,不能完成減數分裂,卵泡也不能發育為成熟的格拉夫卵泡[15-16].

1.2 氨基酸類和能量底物

顆粒細胞可以通過縫隙結合部運送營養物質(如氨基酸類)和能量物質(能量底物)給卵母細胞,目前在小鼠生長卵母細胞中的6種氨基酸轉運系統已被確定,顆粒細胞顯著增強其中甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸和?；撬岬臄z取量[17].小鼠、牛、羊和人等動物的卵母細胞可以通過葡萄糖轉運系統攝取葡萄糖,但由于缺乏糖酵解酶中的果糖磷酸激酶,哺乳動物卵母細胞利用葡萄糖作為能量底物的能力很低[18].因此,大多數哺乳動物卵母細胞的能量底物來源于顆粒細胞將葡萄糖轉化為卵母細胞可利用的物質,如丙酮酸鹽、乳酸鹽、NADPH等,以滿足卵母細胞的生長需求,而不是直接利用葡萄糖.體外培養卵母細胞的生長速率與共培養的顆粒細胞數量呈顯著正相關,如小鼠卵母細胞體外培養體系中沒有顆粒細胞時,直徑到35 μm即停止生長,正是因為顆粒細胞通過縫隙結合部進行的氨基酸類和能量底物轉運,對卵母細胞的活力和生長有著至關重要的作用[19].

1.3 cAMP和cGMP

原始卵泡中卵母細胞生長期到減數分裂Ⅰ期即停滯,而卵泡在FSH和LH作用下繼續成熟,原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡,甚至早期有腔卵泡中的卵母細胞都沒有繼續進行減數分裂的能力[20].而在生長期最后由于促性腺激素的作用,卵母細胞以分段式完成減數分裂,到達減數分裂Ⅱ期[21].這種減數分裂的分段式完成受到卵泡環境和顆粒細胞的抑制作用,卵泡排卵后由于擺脫了卵泡環境和顆粒細胞的抑制,即使沒有促性腺激素,卵母細胞可自發完成減數分裂[22].研究發現,卵母細胞自發完成減數分裂是胞內cAMP水平下降引起的.顆粒細胞通過縫隙結合部給卵母細胞運送cGMP,cGMP抑制磷酸二酯酶3(cAMP水解酶),從而維持卵母細胞胞內高cAMP水平阻斷減數分裂,這些環核苷酸對卵母細胞的減數分裂起到負反饋調節作用[23].

cAMP和cGMP分別由腺苷酸環化酶和鳥苷酸環化酶合成,磷酸二酯酶類可降解cAMP和cGMP.研究發現,cAMP及卵泡液(主要是其中的次黃嘌呤)協作使小鼠卵母細胞無法停留在減數分裂Ⅰ期,次黃嘌呤抑制cAMP水解酶-磷酸二酯酶的活性[24].顆粒細胞中主要的鳥苷酸環化酶是鈉尿肽受體2,是配體利鈉肽的受體,使用利鈉肽處理卵丘-卵母細胞復合體,可提高cGMP水平,敲除利鈉肽或其受體基因的小鼠卵母細胞無法停留在減數分裂Ⅰ期,最終早熟早衰[25].

1.4 旁分泌因子

顆粒細胞分泌可分泌多種物質,調控卵母細胞的生長和成熟,顆粒細胞生成的雌激素類可刺激自身增殖,分泌的旁分泌生長因子可直接刺激卵母細胞的生長,生成的激活素和抑制素均屬于轉化生長因子β家族,發揮調控腦垂體分泌FSH的作用[26].目前研究最多的調控粒層-卵母細胞交互作用的配體受體系統是酪氨酸激酶及其受體,對卵母細胞和卵泡的所有發育階段都起到促進作用,可能也與原始卵泡中休眠卵母細胞的喚醒有關[27-28].

2 卵母細胞與卵泡發育

2.1 卵源因子:GDF9和BMP15

實施顯微操作卵子去除術會引起顆粒細胞的黃體化,說明一些卵源物質可能阻止顆粒細胞的自發黃體化,證實了卵源物質對顆粒細胞功能的直接影響,這些實驗結論是基于排卵后顆粒細胞黃體化的生理學現象[29].卵母細胞對顆粒細胞的作用與卵源物質調控糖酵解和三羧酸循環有關,從而調控顆粒細胞的功能[30].研究發現卵母細胞生成的特異性生長因子調節卵泡發育,GDF9敲除小鼠的原始卵泡發育到形成1-2層顆粒細胞包繞即停止發育,而BMP15敲除母鼠生育力低下,免疫抑制GDF9和BMP5會顯著減少有腔卵泡的數量,最終證實了兩種卵源因子GDF9和BMP15的存在及對其顆粒細胞和卵泡發育的影響,GDF9和BMP15均屬于轉化生長因子β家族[31-32].

2.2 顆粒細胞的增殖和形態學研究

每個原始卵泡都包含一個卵母細胞及包繞在外的單層扁平顆粒細胞,當卵母細胞開始生長,顆粒細胞從扁平變為立方形,并隨著卵泡的發育開始增殖.體內外實驗顯示,無腔卵泡中顆粒細胞的增殖受FSH和雌激素17β促進,無腔卵泡和有腔卵泡的顆粒細胞都受卵母細胞分泌的GDF9和BMP15促進,大量增殖從而形成卵丘[33].

實驗發現,體內顆粒細胞與體外培養顆粒細胞的外形有所差異,體外顆粒細胞外形類似成纖維細胞,這種形態學的改變可能是由于FSH、cAMP類似物和生長因子的作用因引起的[34].近期研究發現,體外培養牛卵丘(去除卵母細胞)與顆粒細胞,單獨添加BMP15與不添加GDF+BMP15的情況下,顆粒細胞都分化為類似成纖維細胞,而添加GDF+BMP15后外形變為菱形,與不添加GDF+BMP15體外培養的卵丘-卵母細胞復合體中的顆粒細胞形態相似,顯示卵母細胞通過GDF9和BMP15維持顆粒細胞的外形[35].顆粒細胞具有高度分化潛能,在體外培養時可分化為多種細胞系,如成骨細胞、軟骨細胞和神經細胞,卵源生長因子對于維持顆粒細胞的外形是必需的[36].

2.3 卵泡腔的形成

在卵泡發育后期,卵泡液開始積聚在顆粒細胞層之間形成的一個單獨空間就是卵泡腔.卵泡腔是哺乳動物的特有結構,可能與哺乳動物卵生及卵巢中卵泡的選擇性發育有關.無腔卵泡體外培養實驗顯示,添加FSH可刺激卵泡腔的形成;去除了卵母細胞的無腔卵泡無法形成卵泡腔,添加GDF9和BMP15會形成卵泡腔類似結構,證實卵母細胞可能通過GDF9和BMP15參與了卵泡腔的形成[37].

3 結 論

哺乳動物卵巢、卵母細胞生長和卵泡發育是一個協調發生的漫長過程,以期排卵后產生具有受孕能力的卵子.在這個過程中,停留在減數分裂Ⅰ期的卵母細胞隨著顆粒細胞增殖、分化和有腔卵泡的發育重新開始減數分裂,同時在腦垂體作用下卵母細胞促進了卵泡的發育及顆粒細胞的增殖和分化.這種雙向交互作用一通過卵源因子GDF9和BMP15調控顆粒細胞增殖、分化及顆粒細胞cAMP及cGMP合成量,二通過顆粒細胞經縫隙結合部運送cAMP及cGMP給卵母細胞調控卵母細胞生長發育及卵母細胞GDF9和BMP15的合成量得以實現.最終保證卵母細胞和卵泡生長發育的協調性,以及哺乳動物個體正常的卵巢功能,產生具有受孕能力的卵子.卵母細胞體外培養系統需要更成熟的條件才能完善卵母細胞的全部生長過程,對卵母細胞和顆粒細胞交互作用的研究是為了更好的改進體外培養系統,從而掌握這項生殖技術,更好的為人類服務.