酪蛋白的谷氨酰胺酶水解及其產物的金屬離子螯合能力*

李丹，趙新淮

(東北農業大學，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱，150030)

酪蛋白的谷氨酰胺酶水解及其產物的金屬離子螯合能力*

李丹，趙新淮

(東北農業大學，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱，150030)

利用谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)對酪蛋白進行限制性脫酰胺和水解處理，以SDS-PAGE及排阻色譜分析評價產物的蛋白質降解情況，并制備具有較低脫酰胺度的脫酰胺酪蛋白產物。在酪蛋白質量濃度為5%、谷氨酰胺酶添加量400 U/kg酪蛋白、37℃的條件下分別反應6 h、12 h和24 h，制得脫酰胺度分別為2.8%、5.8%和8.5%，水解度分別為2.5%、3.4%和4.9%的脫酰胺酪蛋白。評價這3種脫酰胺酪蛋白產物對Fe2+和Ca2+的螯合能力，結果表明，脫酰胺酪蛋白產物對Fe2+和Ca2+的螯合能力高于酪蛋白，并隨著脫酰胺度的增加而提高。

谷氨酰胺酶，酪蛋白，脫酰胺，螯合能力，鐵，鈣

食品蛋白質經過特定的修飾會改變其相應性質，如酶法水解既能獲得具有生物活性的肽［1］，又可提高食品蛋白質的功能性質［2］。酶處理方法的反應條件相對溫和，一般不會導致有毒物質的產生。食品蛋白質經過脫酰胺作用后，能夠改善一些功能性質，因此具有潛在的食品加工應用價值［3］。例如，燕麥分離蛋白經脫酰胺處理后溶解性、乳化性等功能性質均有顯著增強［4］。對小麥蛋白進行脫酰胺作用，結果表明，中性pH條件下脫酰胺小麥蛋白的溶解性及乳化性質有顯著的提高［5］。另外，蛋白質水解產物對一些礦物質元素(如Fe2+和Ca2+)有較好的螯合作用，可以作為配體來提高礦物質的溶解性，提高礦物質的生物利用率［6］。Kumagai等［7］發現，去肌醇六磷酸大豆球蛋白經脫酰胺后對Ca2+的螯合能力，相比大豆球蛋白以及去肌醇六磷酸大豆球蛋白對Ca2+的螯合能力都有所增強。研究還發現，即使經消化酶作用后，去肌醇六磷酸脫酰胺大豆球蛋白仍具有較高的Ca2+螯合能力，并且脫酰胺大豆球蛋白及其水解產物顯著提高小腸對Ca2+的吸收利用率［8］。

本研究利用谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)對酪蛋白進行限制性脫酰胺，得到較低脫酰胺度或水解度的脫酰胺產物，并對其Fe2+和Ca2+螯合能力進行評價和比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白(蛋白質含量93.8%)、3-(2-吡啶基)-5，6-雙(4-苯磺酸)-1，2，4-三嗪(ferrozine)、谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)，均購自Sigma公司;標準蛋白Marker，購自索萊寶科技有限公司;其他試劑均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

UV-2401PC紫外-可見分光光度計，日本島津公司;Kjeltec TM 3200全自動凱式定氮儀，瑞士Foss公司;UVP/C8484－05G凝膠成像分析系統，美國UVP公司;AKTA100蛋白純化儀，美國GE Amersham公司;AA－800原子吸收分光光度計，美國Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白的限制性酶解

配制質量濃度為10%酪蛋白溶液，并用0.2mol/L的NaOH溶液調節pH至7.0。配制0.01 g/mL谷氨酰胺酶溶液(現用現配)，將一定量的酪蛋白溶液與超純水、不同體積的谷氨酰胺酶溶液混合，配制成酪蛋白質量濃度為5%、酶添加量分別為100、400、700 U/kg酪蛋白的反應體系。反應體系在37℃下酶解6～36 h，按照以下方法分別測定產物的脫酰胺度及水解度。以未加谷氨酰胺酶溶液的酪蛋白溶液為空白。

1.3.2 相關分析

1.3.2.1 蛋白質含量、脫酰胺度以及水解度的測定

(1)蛋白質含量:凱氏定氮法［9］。

(2)脫酰胺度測定:苯酚-次氯酸鹽法［10］。

反應結束后，取反應液2mL置于離心管中，并立即加入2mL質量分數為12%的三氯乙酸終止反應，12 000 r/min離心10 min除去沉淀，上清液待測。

試劑A:分取5.0 g苯酚、25 mg亞硝基鐵氰化鈉，溶于雙蒸水中，定容至500mL。

試劑B:取2.5 g NaOH溶于雙蒸水中，加入4.2mL的質量濃度為6.5%的次氯酸鈉溶液，定容至500mL。試劑A和試劑B均置于棕色試劑瓶中，4℃冰箱中儲存備用。

移取5.0mL試劑A于試管中，加入20μL樣品溶液(或20μL雙蒸水)，充分振蕩、混勻。移取5.0mL試劑B加入到上述混合溶液中，充分振蕩、混勻。37℃水浴中反應20 min，冷卻至室溫，并在625 nm波長測定溶液吸光值a(或b)。以硫酸銨標準溶液(0.2～1μg/μL)繪制標準曲線;根據所得差值(ab)和標準曲線，計算樣品中游離氨濃度。

稱取一定量的酪蛋白，置入水解管，然后加入5mL終濃度為3mol/L的H2SO4，用酒精噴燈密封水解管，110℃下水解24 h。水解完畢后，將水解液中和至中性并稀釋一定倍數后，按上述方法，在625 nm波長測定水解液稀釋液的吸光值。根據標準曲線，計算出酪蛋白中谷氨酰胺和天冬酰胺殘基總量。脫酰胺度計算公式如式(1):

(3)蛋白質水解度的測定:鄰苯二甲醛(OPA)法［11］。

OPA試劑:取2.00 g十二烷基磺酸鈉(SDS)，加入一定量硼酸緩沖溶液(pH 9.5)，待完全溶解后，加入 1mL 80mg/mL 的 OPA 乙醇溶液、200μL β-巰基乙醇，最后用硼酸緩沖溶液定容至100mL。此溶液現用現配。

將樣品溶液稀釋至一定倍數后，取3mL樣品稀釋液與同體積OPA試劑混合并開始計時，準確反應5 min，立即在分光光度計上340 nm波長處測吸光值。以亮氨酸標準溶液(12～36μg/mL)繪制標準曲線，利用標準曲線計算樣品中游離氨基濃度(μmol/mL)。水解度計算公式如式(2):

1.3.2.2 SDS-PAGE分析

采用不連續垂直板狀凝膠電泳，濃縮膠濃度為4%、分離膠濃度為15%。濃縮膠和分離膠配此組成見表1［12］。凝膠板面積120 mm×100 mm，凝膠厚度1.5 mm，上樣量10μL。電泳時初始電壓80V，待樣品進入分離膠時電壓增至120V;當溴酚藍指示劑遷移到凝膠板底部時，停止電泳。剝離凝膠，加入戊二醛固定液固定1 h。取出固定好的凝膠在染色液(含0.25%考馬斯亮藍R250、45%甲醇、10%乙酸)中染色3～5 h，棄去染色液，加入脫色液［V(甲醇)∶V(冰乙酸)∶V(水)=2∶2∶9］，經常更換脫色液，直至凝膠的藍色背景褪去，蛋白質色帶清晰為止。然后于凝膠成像系統中對各條帶進行分析。

表1 SDS-PAGE電泳分析時凝膠的配制

1.3.2.3 排阻色譜分析

采用Chu等人［13］的方法，略有改動。將酪蛋白以及脫酰胺酪蛋白產物溶于0.2mol/L、pH值12的磷酸鹽緩沖溶液中，終濃度為2mg/mL;洗脫劑為0.2mol/L、pH值12的磷酸鹽緩沖溶液。樣品溶液和洗脫劑通過0.45 μm微孔濾膜過濾，并用超聲波脫氣。利用美國GE Amersham公司AKTA蛋白純化儀進行測定。柱子型號為10 mm×300 mm、填料為Pharmacia Superdex－75凝膠。上樣量為0.5mL，壓力1.80 MPa，洗脫速度0.5mL/min。蛋白質檢測波長280 nm。每次進樣前用洗脫流動相沖洗進樣環。

1.3.2.4 Fe2+螯合能力測定

采用 Xu等人［14］的方法，稍有改動。準確吸取250μL 1mg/mL的樣品溶液(樣品最終濃度為100μg/mL)直接與 XμL 1 mmol/L的 FeCl2溶液混合(最終濃度為10～60 μmol/L，此溶液現用現配)，加入一定量的超純水使反應體系終體積為1.5mL?；靹蚝蠓胖? min，再加入1mL 500 μmol/L的Ferrozine水溶液(終濃度為200 μmol/L)，充分振蕩、混勻?；旌象w系在室溫下靜置10 min，使充分反應形成Fe2+-Ferrozine復合物，用紫外分光光度法在562 nm條件下測吸光值。對照樣中加入一定量的EDTA溶液(終濃度為10 μmol/L)。整個過程中，使用的水為超純水。樣品對Fe2+的螯合效率計算見公式(3):

式中:AT，樣品吸光度;AC，對照樣吸光度［XμL 1 mmol/L的FeCl2溶液加入(2 500－X)μL超純水］。

1.3.2.5 Ca2+螯合能力的測定

采用Bao等人［15］的方法，略有改動。

(1)將0.03 g樣品溶解于3mL、pH7.4的 Tris-HCl緩沖溶液，37℃水浴中放置10 min，充分溶解后加入0.04mol/L的CaCl2溶液1mL。37℃水浴中反應30 min后，6 000 r/min離心5 min，收集上清液。將上清液稀釋至一定倍數，用原子吸收光譜法測定上清液中的Ca2+含量A。Ca2+螯合能力計算公式為:

式中:AT，總Ca2+的量(mol);A，上清液中 Ca2+的量(mol);P，蛋白質質量(g)。

(2)鈣含量測定:采用空氣-乙炔火焰原子吸收光譜法(FAAS法)。用質量分數為3%的硝酸溶液將Ca2+標準儲備液(國家標準物質研究中心)逐級稀釋成0、2、4、6、8、10μg/mL 系列標準溶液。測定條件為:波長422.7 nm，燈電流8 mA，狹縫0.7 nm，乙炔流量1 L/min，空氣流量4.0 L/min，燃燒器高度10 mm。測定標準系列溶液(濃度由低到高)的Ca2+含量，儀器自動處理數據，并顯示標準曲線。確認后，按順序進行空白和樣品溶液的測定。計算機給出測定結果［10］。

1.3.3 統計分析

采用SPSS 13.0軟件對結果進行統計、分析，采用Excel 2003軟件繪制圖示。

2 結果與分析

2.1 酪蛋白的脫酰胺反應條件及水解度

研究發現，谷氨酰胺酶對酪蛋白的脫酰胺作用隨酶添加量的增加而增加(如圖1所示)。在37℃條件下，初始反應階段(0～18 h)，酪蛋白的脫酰胺度隨反應時間的延長而顯著增加;反應24 h以后，酪蛋白的脫酰胺度幾乎沒有顯著增加。因此，反應24 h足可以完成酪蛋白的脫酰胺反應。對比酶添加量的影響，發現脫酰胺度隨著酶添加量的增加而大幅度增加。酶添加量為100 U/kg酪蛋白或者400 U/kg酪蛋白時，酪蛋白的脫酰胺度比酶添加量為700 U/kg酪蛋白的脫酰胺度低。反應24 h時，酶添加量分別為100、400、700 U/kg酪蛋白時，酪蛋白的脫酰胺度分別為3.9、8.5、10.2%?？紤]到反應效率、酶成本等因素，在以后研究中酶添加量選用400 U/kg酪蛋白。

圖1 反應時間和酶添加量對酪蛋白脫酰胺的影響(n=3)

酪蛋白的脫酰胺度還與反應溫度有關(如圖2)，可以看出，隨著反應時間的延長，酶添加量為400 U/kg酪蛋白時，32、37和42℃進行的脫酰胺反應，只有37℃下脫酰胺度最高，說明谷氨酰胺酶在37℃下的脫酰胺活力最高。因此，可以初步確定，酪蛋白脫酰胺反應的適宜反應條件為質量濃度為5%的酪蛋白溶液、反應溫度37℃、酶添加量400 U/kg酪蛋白。此條件下，當反應分別進行6、12、24 h時，酪蛋白的脫酰胺度分別為2.8%、5.8%、8.5%，相應的水解度分別為2.5%、2.4%、4.9%，這些產物是具有較低脫酰胺度的水解酪蛋白，在以后的研究中分別稱為脫酰胺酪蛋白 1、2、3。

圖2 溫度對酪蛋白脫酰胺反應的影響(n=3)

2.2 SDS-PAGE及排阻色譜分析

通過SDS-PAGE發現，與酪蛋白相比，3種脫酰胺酪蛋白在分子質量為31.0 ku附近的肽段幾乎完全被水解(如圖3所示)，即谷氨酰胺酶使酪蛋白幾乎完全水解成小肽。小分子質量的肽主要分布在20.1、14.4 ku附近以及14.4 ku以下，并且隨著脫酰胺反應時間的延長，小分子質量的肽段更多。這再次說明谷氨酰胺酶對酪蛋白除了具有脫酰胺作用外，還有一定的水解作用。

圖3 酪蛋白與脫酰胺酪蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

酪蛋白與2個脫酰胺酪蛋白的排阻色譜分析結果如圖4所示。從分析結果上看，2個脫酰胺蛋白的峰形與酪蛋白的峰形差異顯著，說明酪蛋白在脫酰胺過程中幾乎被完全水解并生成分子質量更小(洗脫時間更長)的產物。這一結果也證明了SDS-PAGE分析結果，即谷氨酰胺酶對酪蛋白具有水解作用。

圖4 酪蛋白與脫酰胺酪蛋白排阻色譜分析結果

2.3 酪蛋白及其脫酰胺酪蛋白對Fe2+、Ca2+的螯合能力

以EDTA為對照樣，向EDTA、酪蛋白以及脫酰胺酪蛋白溶液中加入10～60 μmol/L的Fe2+，考察它們對Fe2+的螯合能力，結果如圖5A所示。脫酰胺酪蛋白對Fe2+螯合的能力比酪蛋白、10 μmol/L的EDTA的更強(尤其是在較高Fe2+添加量)，整體上約增加50%～400%，并且脫酰胺酪蛋白螯合Fe2+的能力大小依次為脫酰胺酪蛋白3、脫酰胺酪蛋白2、脫酰胺酪蛋白1。圖5B為酪蛋白以及脫酰胺酪蛋白對Ca2+的螯合能力測定結果。脫酰胺酪蛋白1、脫酰胺酪蛋白2以及脫酰胺酪蛋白3的Ca2+螯合能力分別為 1.23、1.41、1.49 mmol/g，而酪蛋白為 1.05 mmol/g，即脫酰胺酪蛋白對Ca2+的螯合能力也是隨著脫酰胺度的增加而增強，并且都高于酪蛋白。這些結果表明，脫酰胺過程中酪蛋白的谷氨酰胺殘基轉換成谷氨酸殘基，因此，更多的Fe2+或Ca2+結合于脫酰胺酪蛋白。理論上，酪蛋白中谷氨酰胺殘基轉換成谷氨酸殘基的數量越多(即脫酰胺度越高)，螯合Fe2+或Ca2+的能力就越強。

圖5 酪蛋白與脫酰胺酪蛋白對Fe2+和Ca2+的螯合能力

食品蛋白質具有螯合金屬離子的能力，蛋白質對Ca2+和Fe2+的螯合能力越強，越能夠提高元素的生物利用率，有利于機體對礦物質元素的吸收利用率。此外，Fe2+和Cu2+能夠催化反應形成氧自由基，對Fe2+和Cu2+的螯合能力越強，則蛋白質的抗氧化能力就越強。綜上所述，脫酰胺酪蛋白可以作為一種很好的蛋白質基料，并在食品加工中具有一定的潛在應用價值。

3 結論

谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)對酪蛋白具有脫酰胺和肽鍵水解作用能力。在酪蛋白質量濃度為5%、谷氨酰胺酶添加量400 U/kg酪蛋白、37℃的最佳反應條件下，分別反應6、12、24h制得3種脫酰胺酪蛋白，其脫酰胺度分別為2.8%、5.8%、8.5%，水解度分別為2.5%、3.4%、4.9%。SDS-PAGE以及排阻色譜分析結果證明，谷氨酰胺酶對酪蛋白具有水解作用。分析結果表明，脫酰胺酪蛋白對Fe2+及Ca2+的螯合能力均高于酪蛋白，且螯合能力與脫酰胺度相關。

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Hydrolysis of Casein by Glutaminase and Metal Chelating Activity of the Prepared Products

Li Dan，Zhao Xin-huai
(Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

Glutaminase(EC 3.5.1.2)was applied in the present work to treat casein for deamidation and hydrolysis to a limited reaction extent.SDS-PAGE and size exclusion chromatography analysis were used to evaluate the degradation of casein.Some deamidated casein products with lower degree of deamidation were prepared with reaction conditions of casein concentration of 5%(w/v)，glutaminase addition level of 400 U/kg casein，reaction temperature of 37℃ and reaction time were 6，12 and 24 h，respectively.Three deamidated casein products prepared had the degree of deamidation of 2.8%，5.8%and 8.5%，or degree of hydrolysis of 2.5%，3.4%and 4.9%，respectively，were prepared.The iron or calcium(II)chelating activities of three deamidated caseind products were analyzed.The results indicated that the iron or calcium(II)chelating activities of three deamidated casein products were higher than that of casein，and would be enhanced as degree of deamidation increased.

glutaminase，casein，deamidation，chelating activity，iron，calcium

博士研究生(趙新淮教授為通訊作者)。

*黑龍江省高等學?？萍紕撔聢F隊建設計劃項目(2010td11)和東北農業大學創新團隊發展計劃資助項目(CXT007－1－1)。

2010－06－18，改回日期:2010－07－25