乳酸菌包埋方法的研究*

袁秀麗，呂嘉櫪，李旭華

(陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安，710021)

乳酸菌包埋方法的研究*

袁秀麗，呂嘉櫪，李旭華

(陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安，710021)

為了研制高活性的乳酸菌載體顆粒，以保加利亞乳桿菌為研究對象，分別以瓊脂和海藻酸鈉為菌體包埋材料，通過菌體包埋、載體制備和載體培養等方面條件研究，結果表明:海藻酸鈉包埋菌體效果優于瓊脂，其載體的最佳培養條件為:1%海藻酸鈉，用1%CaCl2固化;將載體置于含1%CaCO3的培養基中，41℃、培養20 h左右時，載體中活菌數可高達2.2×1011CFU/g。

乳酸菌，保加利亞乳桿菌，載體，包埋

乳酸菌作為益生菌中頗具代表的菌群，其產品中乳酸菌的數量及活力是衡量該類產品質量優劣的重要指標之一。如何制備高菌數、高活性的乳酸菌產品已成為目前研究的重點與難點。目前常用的濃集乳酸細菌的方法［1－3］是高密度培養法和分離法，但這2種方法存在操作復雜，需要借助昂貴的儀器設備等問題，限制了在工業化生產乳酸菌時的推廣應用。采用高密度培養乳酸菌，在國內外均有報道，目前主要有化學中和法、緩沖鹽法、透析培養、膜過濾培養、微膠囊培養法。微膠囊培養法是一種新的培養方法，該法在對乳酸菌進行培養時將乳酸菌固定，由于營養物質和代謝產物可以自由地通過微膠囊，同時又減少了培養過程中對細胞的損傷和損失，克服了傳統游離細胞懸浮培養的缺點和限制，可以獲得較大的菌體密度。本研究借助包埋的方法使乳酸細菌濃集在海藻酸鈣凝膠載體中生長繁殖，此方法簡便，對設備的要求低，可為制備高活性乳酸細菌產品的工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌種

德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，L.B.)，由陜西科技大學生命科學與工程學院微生物教研室提供。

1.1.2 試劑與藥品

葡萄糖、NaCl、瓊脂粉、酵母膏、牛肉浸膏、蛋白胨、檸檬酸氫二銨(天富精細化工有限公司)，K2HPO4、乙酸鈉、吐溫 80、CaCO3、CaCl2、海藻酸鈉、檸檬酸鈉(西安中信精細化工有限公司)等。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司;PB－10酸度計，北京賽多利斯天平有限公司;LS—C50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫療設備廠;顯微攝影系統，重慶奧特光學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程［4］

瓊脂、海藻酸鈉→滅菌→與菌液混合→造?！袒d體→無菌水沖洗→培養載體→取出載體→釋放

1.3.2 檢測與分析方法

(1)包埋載體機械強度的檢測:取20個均勻的載體顆粒，用50 g的砝碼加壓，觀察包埋顆粒的外形，若無變化，為優;若有裂痕但是外形基本不變，為中;若外形完全被破壞，為差。

(2)包埋載體平均直徑的測量:取20個載體顆粒，測其總長后計算出平均值為載體直徑。

(3)pH值測定:直接用PB－10酸度計測定。

(4)海藻酸鈣載體載體中菌體釋放及活菌數的測定［5］:將載體中的菌體定向釋放，再按改進的高層瓊脂柱法進行計數。

2 結果與討論

2.1 瓊脂包埋乳酸菌條件的研究及載體的培養

分別采用滴注法和切割法進行造粒，混合前瓊脂溶液的濃度分別為2%、3%、4%，檢測所得不同載體的形態與機械強度。將包埋得到的載體置于培養基中，在41℃下培養，取 12、24、36、48、60、72 h 的培養液測定pH值及載體中的菌數。

表1 瓊脂造粒情況

圖1 瓊脂載體培養各時間段的pH值及載體中活菌數變化

試驗中發現，瓊脂溶液在50℃左右時流動性較好，但在造粒的過程中，隨著注射器中溶液溫度的下降，所造出的載體規則，表面不光滑，所形成的載體的機械強度很差。因此，以瓊脂為載體用滴注法包埋乳酸菌的方法不可行。采用切割法造粒，可以得到形態基本一致的載體，載體的大小基本在3 mm3左右，但載體的機械強度較低。

培養過程中，前24 h內培養基pH值的變化非常明顯，活菌數成對數生長，說明在這個階段菌的生長非常旺盛。后期培養基的pH值及活菌數變化逐漸趨于平緩，活菌數由于代謝產物乳酸的積累，培養基pH值降低，導致的生長逐漸變緩，最大活菌數達4.17 ×108CFU/g。

2.2 海藻酸鈉包埋乳酸菌條件的研究及載體的培養［6－9］

將2%與4%的海藻酸鈉溶液與菌液混合后用注射器分別滴入不同濃度的CaCl2溶液中固定0.5～1 h，檢測載體形態并將所得載體于40℃培養24 h，檢測相應活菌數。

表2 海藻酸鈉溶液用CaCl2溶液固化情況

表3 培養不同固化條件形成的載體得到的菌數(CFU/g)

表2表示的是海藻酸鈉溶液用CaCl2溶液固化的情況，當混合液中海藻酸鈉溶液的濃度分別為1%、2%時，用1%～5%的CaCl2溶液固化均能得到較規則的球形載體，載體的直徑為2.5～3 mm左右，載體的機械強度隨著CaCl2溶液濃度的增強而增強，整體的機械強度均較強。

表3表示的是培養不同固化條件形成的載體得到的菌數，當海藻酸鈉的濃度為1%，固化的CaCl2溶液為1%時，載體中的菌數最大，為6.09×109CFU/g。在海藻酸鈣凝膠載體的固化過程中，雖然CaCl2溶液的濃度越大得到的載體的機械強度越強，但CaCl2溶液的濃度越大，溶液的滲透壓也越大，這會對載體中的菌體產生毒害作用，使菌體的活性降低，不利于菌體的生長，因此通過對比，選取1%的CaCl2溶液作為最佳的固化溶液。

2.3 海藻酸鈣載體培養條件的研究［10－16］

2.3.1 培養基中加入不同濃度的CaCO3培養

包埋方法同上，在載體培養基中加入不同濃度的(0.5%、1%、2%、3%、4%、5%)CaCO3，不加 CaCO3作為對照組培養載體時于不同時間段測定載體中的活菌數及培養液的pH值。

由圖2可見，加CaCO3各組培養液的pH值變化較不加CaCO3組變化趨勢明顯減小，在培養初至12 h內變化較明顯，之后培養液pH值的變化比較平緩，而不加CaCO3組pH值一直降低。表明加CaCO3對培養液有較好的緩沖作用。而載體中活菌數變化情況，各組變化趨勢相似，開始一直呈增長趨勢，在20 h時達到最大值，為2.1×1011CFU/g(1%CaCO3組)，載體中菌數在培養的16～20 h內變化最為明顯。載體中菌數的持續增長說明培養液中加入的CaCO3的確能促進載體中菌體的生長。

圖2 加入不同濃度CaCO3各組培養液pH值及載體中

2.3.2 加入不同接種量的載體培養

包埋方法同上，以5%、10%、20%、30%的接種量將載體加入培養基中，于42℃培養24h，測各時間段培養基的pH值及載體中的活菌數。

圖3 不同接種量組培養液pH值及載體中活菌數的變化情況

圖3可見接種量為5%與10%，20%與30%的培養液pH值及載體中活菌數的變化趨勢類似，pH值均是先降低后維持在一個pH值范圍之內，但加大接種量組pH值較較小接種量組降低明顯。載體中的活菌數變化趨勢各組大致相同，載體均培養到20 h達到最大活菌數為2.2×1011CFU/mL(接種量為10%組)，然后活菌數逐漸降低，但20%與30%較5%與10%小一個數量級左右，由此可知最佳接種量約為10%。

3 固定化乳酸菌的活力測定［17］

將固定化的乳酸菌載體分別投入到200mL三角瓶中，加入150mL牛乳發酵，測定凝乳時間。凝乳時更換新鮮牛乳，試驗共連續進行10批，通過凝乳時間的長短及發酵乳中pH值來研究固定化乳酸菌的活力。

由圖4可以看出，固定化的乳酸菌載體在發酵使用10批后凝乳時間由3.4 h上升到7.5 h。此試驗表明海藻酸鈉包埋的乳酸菌顆粒在發酵使用10批后任具有較強的發酵力，并且載體形狀完好。

圖4 凝乳時間及pH值

4 結論

本試驗以乳酸菌的包埋、包埋載體的培養為主要內容，對乳酸細菌的最佳包埋條件進行了摸索。包埋的最佳條件為，以海藻酸鈉作為包埋材料，最佳濃度為1%，并以1%CaCl2固化得到的載體呈球形，直徑2.5 mm;載體培養的最佳條件為以10%的接種量將載體培養在加入1%CaCO3的培養基中，培養時間約20 h，載體中的活菌數達到最大為2.2×1011CFU/mL，且具有較強的活力。此過程不需要復雜、昂貴的儀器設備且操作簡單，可廣泛應用于其他微生物發酵劑、菌制劑或微生物產品的開發之中。

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The Analysis for Lactic Acid Bacteria Encapsulation Methods

Yuan Xiu-li，Lv Jia-li，Li Xu-hua
(College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi＇an 710021，China)

In order to develop the high－activity lactic acid bacteria carrier particles，we used Lactobacillus bulgaricus as study object and agar and sodium alginate being the cell encapsulation materials respectively.This article focuses on the following conditions:cell encapsulation，carrier preparation and carrier culture and so on.The results show that:the encapsulation effect by sodium alginate is better than agar and the optimum culture conditions is:1%sodium alginate solidified by1%CaCl2;with placing the carrier into the culture medium containing 1%CaCO3，41℃and 20 hours more or less，total viable count in the carrier is up to 2.2 ×1011CFU/g.

Lactic acid bacteria，Lactobacillus bulgaricus，vector，encapsulation

碩士研究生。

*陜西省“13115”項目(2009ZDKG－20);固定化法制備高菌濃乳酸菌的研究(2010JK446)

2010－06－07，改回日期:2010－09－15