氣相色譜內標法測定魷魚油中的膽固醇

李 偉，陳華勇，*，張 凱，王永華，楊 博

（1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州510641）

氣相色譜內標法測定魷魚油中的膽固醇

李 偉1，陳華勇1，*，張 凱1，王永華2，楊 博1

（1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州510641）

目的：以正三十二烷為內標物，建立了魷魚油中膽固醇含量測定的氣相色譜（GC）分析方法。方法：采用0.5mol/L的氫氧化鉀乙醇溶液在65℃水浴鍋中對油樣皂化30min，乙醚萃取，毛細管氣相色譜法測定魷魚油中膽固醇，討論并確定了樣品皂化的最佳條件。結果：利用該方法，膽固醇與雜質可以得到較好的分離和準確的定量。內標法制定標準曲線相關系數大于0.999，測得膽固醇含量為29.01±0.56mg/g。膽固醇的最低檢出限為2.21ng，加標回收率在92.14%～102.45%之間，其RSD＜5%（n=3）。結論：該法靈敏度高，分離效果好，定量準確，適用于魷魚油中膽固醇的含量測定。

氣相色譜法，膽固醇，內標法，魷魚油

膽固醇是一種具脂類性質的環戊烷多氫菲衍生物，不溶于水，易溶于乙醚、石油醚、氯仿等溶劑。它廣泛存在于動物體內，是動物組織細胞不可缺少的重要物質，不僅參與形成細胞膜，而且是合成膽汁酸、維生素D以及甾體激素的原料。蝦蟹類養殖中，由于蝦蟹類不能自身合成膽固醇，必須通過添加富含膽固醇的餌料來提高蝦蟹養殖的品質和產量［1-2］。富含天然膽固醇的魷魚油是蝦蟹養殖的一種重要的飼料添加劑。魷魚油中膽固醇的準確測定，對飼料添加劑的工業化生產有著重要的指導意義。目前，膽固醇的測定已有諸多報道，采用的方法有比色法、酶法、氣相色譜法（GC）、液相色譜法和薄層層析法等，涉及的基體有雞蛋、奶茶、餅干、食用油等［3-6］。通常，基體組成及其復雜程度對目標物的準確定量影響較大。油樣中膽固醇總量的準確測定取決于皂化處理條件［7］。因此，本文詳細探討了皂化液濃度、皂化時間、皂化溫度及不同萃取劑對魷魚油中膽固醇測定的影響，并采用正交實驗確定了最優的皂化處理條件，以三十二烷為內標物建立了膽固醇的氣相色譜分析法，該法快速、靈敏、準確，測試結果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

膽固醇標準品 純度＞96%，上海博奧生物科技有限公司；正三十二烷內標標準品 純度＞97%，美國Acros Organics公司；無水乙醇、正己烷、石油醚（重蒸餾，餾分為30～60℃）、氫氧化鉀、氯化鈉 均為分析純。

氣相色譜儀 7890A，帶FID檢測器和自動進樣器，美國Agilent公司；漩渦振蕩器 廣州正一科技公司；離心機，恒溫水浴鍋，氮吹儀，50mL圓底燒瓶，容量瓶等玻璃儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準儲備液的配制 分別準確稱取100mg和1000mg正三十二烷內標物于100mL容量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，得到1mg/mL和10mg/mL的內標儲備液。準確稱取50mg膽固醇于50mL容量瓶中，用1mg/mL的內標儲備液稀釋至刻度，得到1mg/mL的膽固醇標準儲備液。

1.2.2 樣品處理 稱取魷魚油樣品約 200mg于50mL圓底燒瓶中，加入1mol/L的 KOH乙醇溶液4.0mL及10mg/mL的正三十二烷內標液0.1mL，振蕩混勻，接上冷凝管，置于65℃水浴中皂化30min（每隔5min振蕩一次）后取出，經流水冷卻后，加入10mL乙醚，旋渦混勻1min，加入3mL飽和食鹽水，旋渦混勻1min。取上層乙醚萃取液1.5mL于2mL離心管中，加入少量無水硫酸鈉，旋渦混勻1min，離心分離。取上清約1mL，按選定色譜條件進樣分析，內標法定量。

1.2.3 分析方法 色譜柱：HP-5毛細管色譜柱，30m ×0.32mm×0.25μm；載氣：氮氣；柱流速：2mL/min（恒流）；氫氣：30mL/min；空氣：350mL/min；尾吹氣：20mL/min；柱溫：200℃保持1min，以10℃/min升到300℃，保持3min；進樣口溫度：250℃；檢測器溫度：300℃；分流比：20∶1；進樣量：1μL。

1.2.4 單因素實驗 考察不同萃取劑、溫度、時間、KOH乙醇液濃度對魷魚油中膽固醇總量測定的影響。

1.2.5 正交實驗 在單因素實驗的基礎上，設計了L9（34）正交實驗，確定油樣最優處理條件，實驗設計見表1。

表1 正交實驗因素水平表

2 結果與討論

2.1 GC分離

取1.2.1中1mg/mL的膽固醇標準儲存液1mL，按1.2.2中樣品處理方法處理，并用上述GC條件進行分析，膽固醇與內標正三十二烷的分離結果見圖1。由圖1可以看出，膽固醇先于正三十二烷出峰，二者保留時間接近，且能達到基線分離。

2.2 樣品前處理條件

2.2.1 萃取劑的選擇 文獻報道能有效萃取膽固醇的常見溶劑有正己烷、石油醚和乙醚［3-4］。本文以魷魚油樣品皂化后膽固醇的檢出量作為指標，對以上三種萃取劑進行了對比。在1.2.2的處理條件下，測得的結果見表2。從表2可以看出，對于魷魚油樣品，3種萃取劑對膽固醇的提取效果差異不大，其中乙醚的提取效果最佳，石油醚略大于正己烷。

圖1 膽固醇標準品氣相色譜圖

表2 膽固醇提取效率的比較

2.2.2 皂化條件的優化 魷魚油中膽固醇通常以游離態和膽固醇酯兩種形式存在，油樣皂化完全與否將直接影響膽固醇總量的測定［7］。通常，皂化效果與堿液濃度、皂化時間和皂化溫度有關。本文以乙醚為萃取劑，單因素實驗考察了不同皂化溫度、皂化時間以及KOH乙醇液濃度對膽固醇總量測定的影響。

在1mol/L的KOH乙醇液，皂化時間60min時，考察了不同溫度（50、65、80、95℃）對膽固醇總量測定的影響，結果見圖2。從圖2可以看出，不同溫度對膽固醇測定值影響較大，65℃時測定的膽固醇含量最高。皂化本身為水解反應，從化學熱力學的角度來看，該反應為放熱反應，溫度太高將不利于反應的進行，溫度太低則會降低反應速率。

圖2 不同溫度對皂化的影響

在1mol/L的KOH乙醇液，皂化溫度為65℃時，考察了不同時間（5、15、30、45、60min）對膽固醇總量測定的影響，結果見圖3，從圖3可以看出，皂化時間在30～45min左右，膽固醇測定值可達到最高。

圖3 不同時間對皂化的影響

在皂化溫度65℃，時間30min時，考察了不同KOH乙醇液濃度（0、0.1、0.5、1、2mol/L）對膽固醇總量測定的影響，結果見圖4。從圖4可以看出，KOH乙醇液濃度在0.1～0.5mol/L時，膽固醇測定值較高，KOH濃度增大，膽固醇測定值降低。這可能是由于高濃度的KOH乙醇液時生成的鉀皂較多，并形成膠束包裹了一定含量的膽固醇。

圖4 不同KOH濃度對皂化的影響

2.2.3 正交實驗結果 結果表明，RA＞RD＞RC＞RB，皂化溫度對油樣中膽固醇得率影響最大，其次是萃取劑和KOH乙醇液濃度，皂化時間對油樣中膽固醇得率影響最小，最佳條件為：0.5mol/L KOH乙醇液，65℃水浴中皂化30min，乙醚為萃取劑，該結果與單因素實驗基本吻合。

表3 正交實驗結果

2.3 標準工作曲線與檢測限

將1.2.1中膽固醇標準儲存液用1mg/mL的內標液稀釋成一系列濃度不同的標準溶液，濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL。各濃度標準溶液均取1mL，通氮氣流吹干，然后按1.2.2中樣品處理方法處理，進GC檢測，以標準物與內標物的質量比為橫坐標，對應峰面積比為縱坐標，制作內標標準曲線，見圖5。從圖5可以看出，當膽固醇濃度在0.1～1mg/mL范圍內，其線性回歸方程Y=0.569X-0.0059，相關系數R2=0.9992。按信噪比為3計算檢出限，該方法膽固醇的最低檢出限為2.21ng。

2.4 方法精密度研究

稱取魷魚油6份（每份約200mg），每份樣品加入0.1mL的10mg/mL內標液，按2.2.3得到的最優方法處理，膽固醇的測定結果見表4。從表4可以看出，最優條件下膽固醇的含量為29.01±0.56mg/g，相對標準偏差為1.93%（n=6）。

圖5 膽固醇檢測標準曲線圖

表4 方法精密度研究

表5 方法添加回收率實驗結果

2.5 方法添加回收率

本實驗在魷魚油樣品中加入膽固醇標準液，設置10、15、20mg/g三個濃度的添加水平。按2.2.3的最優方法處理，先測定樣品中膽固醇的本底含量，再分別測定添加膽固醇標準后，樣品中膽固醇的含量，并計算添加回收率，結果見表5。從表5中可以得知，方法添加回收率在89%～110%之間，說明方法具有較高的準確度。

3 結論

魷魚油中膽固醇通常以游離態和膽固醇酯兩種形成存在，油樣皂化完全與否將直接影響膽固醇總量的測定。本文從單因素條件分別考察了萃取劑、KOH乙醇液濃度、皂化時間和溫度對膽固醇總量測定的影響，并通過正交實驗設計確定了最優的油樣處理條件；此外，還建立了以正三十二烷為內標物的膽固醇GC/FID分析方法，該方法靈敏、準確。在最優條件下：采用乙醚為萃取液、0.5mol/L KOH乙醇液、皂化溫度65℃、皂化時間30min時，測定的膽固醇總量為29.01±0.56mg/g。

［1］黃磊，詹勇，許梓榮.蝦蟹類膽固醇需要量的最新研究［J］.飼料研究，2004（11）：41-43.

［2］汪留全，李海洋，胡王.飼料中膽固醇水平對幼蟹生長和飼料利用率影響的研究［J］.淡水漁業，2004，34（1）：13-15.

［3］張晶，湯均，譚瑩，等.氣相色譜-氫火焰離子化檢測器測定奶茶飲料中的膽固醇［J］.中國衛生檢驗雜志，2009，19（1）：106-107.

［4］金米聰，王立，符展明.毛細管氣相色譜法同時測定雞蛋中的膽固醇和α-維生素E［J］.色譜，2001，19（5）：478-480.

［5］鮑忠定，許榮年，張頌紅.毛細管氣相色譜法測定油中植物甾醇和膽固醇［J］.分析化學研究簡報，2002，30（12）：1490 -1493.

［6］彭春喜，賴毅東.GC-MS法測定食品中膽固醇含量的研究［J］.食品科學，2007，28（5）：281-284.

［7］Bao-Shyung Hwang，Jih-Terng Wang，Youk-Meng Choong. A simplified method for the quantification of total cholesterol in lipids using gas chromatography［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2003，16：169-178.

Determination of cholesterol in liquid oil by gas chromatography

LI Wei1，CHENG Hua-yong1，*，ZHANG Kai1，WANG Yong-hua2，YANG Bo1
（1.School of Biological Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；2.School of Food Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510641，China）

Objective：Using dotriacontane as the internal standard，to establish an internal standard method for cholesterol determination in squid oil by gas chromatography（GC）.Method：The oil sample was saponified with 0.5mol/L alcoholic KOH，65℃ water bath heating，30min，then extracted with ether.The impact caused by the different saponification conditions on the determination of cholesterol was studied.ln addition，the best saponification conditions were chosen by orthogonal experiments.Results：The experimental results showed a good linear relation（R=0.9992），the total cholesterol content of squid oil was 29.01±0.56mg/g.The detection limit of the method was 2.21ng，The recoveries of cholesterol were 92.14%～102.45%，RSD＜5%（n=3）.Conclusion：The method of determination of cholesterol in squid oil by GC had high sensitivity，good separation and quantitative accuracy.

GC；cholesterol；internal standard；squid oil

TS225.2+4

A

1002-0306（2011）01-0284-04

2009-11-30 *通訊聯系人

李偉（1985-），男，碩士研究生，主要從事色譜分析和酶工程方面的研究。

廣東省省級科技計劃項目（G02B2061700）資助。