實時熒光PCR法檢測食物中榛子過敏原成分

孫 敏，梁君妮，徐 彪，高宏偉，林 超，劉彩霞

（1.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島266002；2.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東煙臺264000）

實時熒光PCR法檢測食物中榛子過敏原成分

孫 敏1，梁君妮2，徐 彪1，高宏偉1，林 超1，劉彩霞1

（1.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島266002；2.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東煙臺264000）

榛子是最常見的食品過敏原之一，選擇針對榛子不同基因的引物和探針，進行驗證、比對和條件優化，建立榛子過敏原的實時熒光PCR檢測方法。經實驗比較，針對榛子熱休克蛋白設計合成的引物和探針具有相對較高的靈敏性，檢測限可達0.11ng DNA，而且和常見的食物種類無交叉反應，適于榛子過敏原的檢測。該方法的建立，對于加強食品過敏原的標識管理，保護消費者利益、促進進出口貿易具有重要意義。

實時熒光PCR，過敏原，檢測

榛子，又稱榛栗、山板栗、尖栗等，其富含蛋白質、油脂（大多為不飽和脂肪酸）、胡蘿卜素、維生素、礦物質等，有“堅果之王”的美稱。榛子既可直接食用，也可作為食品配料用于制作各種糕點、糖果。榛子雖營養豐富，但同時也是最常見的食品過敏原之一。研究表明，37%的食物過敏者對榛子過敏，53%的樺樹花粉過敏患者對榛子過敏［1］。國際食品法典委員會在《預包裝食品通用標簽標準》中明確規定，包括榛子在內的堅果及其制品在食品標簽中應始終加以說明。美國、歐盟、日本、新西蘭、澳大利亞等國家和地區均將榛子列為強制標識的食品過敏原［2-3］。本研究選擇針對榛子不同基因的3組引物和探針，進行驗證、比對和條件優化，最終建立了榛子的實時熒光PCR檢測方法，為食品中榛子過敏原的檢測監管提供了有效的工具。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同品系的榛子 由遼寧省經濟林研究所惠贈；含有、可能含有以及不含榛子成分的食品共10種 從當地超市購買，作為本實驗的供試材料，用于分析方法的可行性和靈敏性；胡桃、山核桃、花生、腰果、杏仁、開心果、葵瓜子、芝麻、栗子、大豆、大麥、小麥、燕麥、玉米、大米等 從當地超市購買，用于分析引物的特異性；CTAB提取緩沖液 每升含有CTAB 20g、NaCl 81.9g、Tris 12.1g、Na2EDTA 7.5g；CTAB沉淀緩沖液 每升含有CTAB 5.0g、NaCl 2.5g；蛋白酶K（5U/μL）、PCR Master Mix 購自天根生化科技有限公司；NaCl、Tris、EDTA、氯仿、異丙醇 均為市售分析純。

研磨儀 IKA A11，德國；熒光 PCR儀 ABI PRISM 7900，美國；高速冷凍離心機 Eppendorf 5810R，德 國；核 酸 蛋 白 分 析 儀 Eppendorf Biophotometer，德國；超純水儀 Millpore Simfilter，美國；冷凍研磨儀 SPEX6870，美國；恒溫干燥箱SANYO mov-212F，日本。

表1 引物和探針序列

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 稱取待測樣品100g，用潔凈研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分研磨混勻。烘焙食品等榛子分布不均勻的樣品建議取200g樣品。

1.2.2 模板DNA提取 稱取200mg粉碎好的樣品轉入50mL離心管中，采用 CTAB法提取基因組DNA。使用核酸蛋白分析儀測定OD260和OD280，通過OD260/OD280值確定核酸濃度和純度。

CTAB法提取基因組 DNA的具體步驟為：在50mL離心管中加入5mL CTAB提取緩沖液，20μL蛋白酶K，充分混勻，65℃溫育過夜（每30min混勻一次）；4000r/min離心20min，取上清液700μL，加入等體積三氯甲烷，渦旋混勻；12000r/min離心5min，取上層水相到2mL Eppendorf離心管中，加入兩倍體積的CTAB沉淀緩沖液，渦旋混勻，室溫下靜置60min；12000r/min離心 5min，棄去上清，加入 350μL 1.2mol/L氯化鈉溶液，渦旋混勻，加入350μL三氯甲烷，渦旋混勻；12000r/min離心5min，取上層水相到1.5mL Eppendorf離心管中，加入0.8倍體積異丙醇溶液，渦旋混勻，室溫靜置 60min；12000r/min離心5min，棄去上清液，加入70%乙醇500μL，渦旋清洗沉淀；12000r/min離心5min，棄去上清液，放入通風櫥中干燥過夜（或者在60℃烘箱中干燥）；加入100μL 0.1TE緩沖液，在65℃水浴溶解DNA，所得溶液即為樣品DNA溶液。

1.2.3 引物和探針 參照文獻，選擇特異性引物和探針，委托金思特科技（南京）有限公司合成。引物為PAGE級，經聚丙烯酰胺凝膠電泳純化；探針為HPLC級，經高效液相層析純化。引物和探針序列如表1。

1.2.4 實時熒光PCR反應 使用ABI PRISM 7900實時熒光PCR儀進行PCR擴增。所有PCR反應均設置空白對照（以水代替DNA模板）和陽性對照。

1.2.4.1 反應體系 實時熒光PCR采用25μL反應體系，體系中包括2.5×PCR反應預混液10μL，20×探針增強溶液1.25μL，10pmol/μL上游和下游引物各1μL，10pmol/μL探針1μL，DNA模板2μL，超純水8.75μL。

1.2.4.2 反應條件 PCR反應條件隨引物和探針不同略有改變，第1組和第2組引物探針的反應程序相同，第3組引物探針的退火溫度稍低，見表2。

表2 實時熒光PCR反應參數

1.2.5 引物特異性實驗 選擇常見的食品原料，包括糧食（大豆、玉米等）、動物組織（牛、羊、豬等）、堅果（胡桃、山核桃、花生、腰果、杏仁等），提取DNA，按照1.2.4中的方法，進行實時熒光PCR反應，以確定引物、探針和實驗方法的特異性。

1.2.6 PCR檢測靈敏度實驗 使用核酸蛋白分析儀測定榛子DNA溶液的濃度，然后進行10倍系列稀釋，每個稀釋度取2μL，按照1.2.4中的方法，進行實時熒光PCR反應，以確定方法的敏感性。

2 結果與分析

2.1 有效性分析

2.1.1 原料榛子 為了驗證引物和探針的有效性，我們收集了7個榛子樣本，以確定方法的適用范圍。7個樣品中，平榛1種和平歐雜交榛6種（遼榛2號、遼榛3號、遼榛4號、達維、金鈴、薄殼紅）。純化得到的榛子DNA溶液，經核酸蛋白分析儀測定OD260和OD280，確定樣本濃度在90～125ng/μL，純度在1.71～1.84之間不等，均滿足PCR檢測需要。按照1.2.4中的方法，分別使用3組引物和探針，對7個榛子樣本進行檢測。實驗數據表明，3組引物和探針都有效，7個樣本均產生典型的陽性擴增，Ct值見表3。值得注意的是，使用第3組引物和探針時，空白對照（水）有非特異性擴增。

表3 榛子樣本的實時熒光PCR擴增結果

2.1.2 榛子制品 自超市購買10種食品（4種食品的標簽標示為：含有榛子成分；3種食品的標簽標示為：本生產線還生產含有堅果的產品；3種食品無相關標示），提取核酸，按照1.2.4中的方法，分別使用第1組和第2組引物和探針，進行實時熒光PCR反應。實驗結果顯示，2組實驗結果一致，10種食品中有6種含有榛子成分，包括標簽標示為可能含有痕量榛子成分的產品，見表4。

表4 不同食品的實時熒光PCR擴增結果

表5 不同品系榛子等量DNA的實時熒光PCR擴增結果

2.2 敏感性分析

分別使用3組引物和探針對7個品系的榛子樣品進行PCR擴增，結果表明對于同一樣品，在使用等量DNA的情況下，第1組引物和探針的Ct值最小，即靈敏度最高，見表3。使用第1組引物和探針，取等量DNA（200ng）作為擴增模板，檢測不同品系的榛子時，各品系間Ct值無明顯差異，見表5。為了進一步確定第1組引物和探針的靈敏性，隨機取一種榛子DNA溶液（薄殼紅）進行10倍系列稀釋，按1.2.4中的方法進行檢測。結果表明：可檢測的最低限度是0.11ng DNA。以檢測樣品模板數的對數為橫坐標，循環域值（Ct值）為縱坐標繪制標準曲線，曲線斜率是-3.629，R2為0.9991，在0.11～110ng間熒光定量PCR有良好的線性關系，見圖1。

圖1 榛子（薄殼紅）DNA溶液實時熒光PCR擴增的標準曲線

2.3 特異性分析

按照1.2.4的方法，我們分別使用3組引物和探針，檢測了大豆、玉米、大麥、小麥、燕麥、大米、牛、羊、豬、雞、胡桃、山核桃、花生、腰果、杏仁、開心果、葵瓜子、芝麻、栗子的DNA。第1組和第2組引物探針檢測上述物種的結果均為陰性，與預期相符，表明該2組引物和探針有良好的特異性，與上述物種沒有交叉反應；第3組引物探針有非特異性擴增。

3 討論

本研究共篩選了3對引物和探針。第1組引物和探針針對熱休克蛋白設計，熱休克蛋白又稱應激蛋白（stress protein，SP），是細胞在應激原特別是環境高溫誘導下所生成的一組蛋白質，該蛋白在從細菌至人類的整個生物界（包括植物和動物）中普遍存在。而且在進化過程中高度保守。第2組和第3組引物和探針針對榛子過敏原蛋白設計。文獻報道，榛子中含有多種過敏原蛋白：Cor a1（樺樹花粉過敏原同源蛋白）［7］、Cor a2（肌動蛋白結合蛋白）［8］、Cor a8（脂質轉移蛋白）［9］、Cor a9（球蛋白樣種子儲藏蛋白）［10］、Cor a11（豌豆球蛋白）［11］。其中Cor a1是榛子中最主要的過敏原蛋白。經實驗比對，第1和第2組引物探針有較好的特異性，至于靈敏性，第1組引物和探針優于第2和第3組。故本研究推薦使用第1組引物和探針，第2組引物探針可作為備選，用于陽性確認。

食物過敏至今尚無有效療法，各過敏原引發過敏反應的最低量尚無定論。在許多情況下，極微量的過敏原即可造成嚴重后果。目前，預防食物過敏的唯一途徑是嚴防有過敏體質的人接觸過敏原。榛子過敏原實時熒光PCR檢測方法的建立，對于加強食品過敏原標識管理，改進食品安全，保護消費者利益，完善我國的標簽技術壁壘同時跨越國外的標簽壁壘，促進進出口貿易具有重要意義。

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Detection of hazelnut allergens by real time PCR assay

SUN Min1，LIANG Jun-ni2，XU Biao1，GAO Hong-wei1，LIN Chao1，LIU Cai-xia1
（1.Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao 266002，China；2.Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yantai 264000，China）

Hazelnut is one of the most common allergens.After experimenting on primers and probes specific to different genes of hazelnut and optimizing experimental parameters，a real time PCR assay for detecting hazelnut allergen was established.The primers and probes targeting hsp1 gene were proved to be preferable，which had a sensitivity up to 0.11ng purified DNA and had no cross-reactions with other species.This assay may provide a potential tool for food allergens supervision，which is of importance in protecting consumers’right and promoting exportation.

real time PCR；allergen；detection

TS255.7

A

1002-0306（2011）01-0293-04

2010-01-07

孫敏（1976-），女，碩士，工程師，主要從事食品和動植物產品檢測技術研究工作。