苦瓜渣酶解制備多肽的研究

鐘維庚，阮美娟，殷利娟，薛 楠

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

苦瓜渣酶解制備多肽的研究

鐘維庚，阮美娟，殷利娟，薛 楠

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

以苦瓜飲料加工所產生的苦瓜渣為原料酶解制備多肽，通過對比實驗確定纖維素酶輔助酶解2h，在單因素實驗的基礎上，采用正交實驗優化得出木瓜蛋白酶酶解條件為：［E/S］=3.0%、溫度50℃、pH6.5、時間2.5h。葡聚糖凝膠G-25層析法測定結果顯示，酶解液中多肽（＜5000Da）主要含有三個組分，分子量分別為：1500、810、430Da。

苦瓜渣，纖維素酶，木瓜蛋白酶，多肽，葡聚糖凝膠G-25

苦瓜（Momordica charantia L.）屬葫蘆科苦瓜屬，為一年生攀緣性草本植物［1］?，F代藥理研究結果表明，苦瓜具有降血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、免疫調節等多種藥理活性［2］，其中降血糖活性最為顯著，國內外學者對其降血糖活性成分進行了大量的研究，報道苦瓜中存在植物胰島素多肽［3］、皂苷［4］等功能成分。其中苦瓜中植物胰島素多肽的分離方法已經申請了專利［3，5］。在我國的果蔬加工過程中產生下腳料被廢棄，造成了嚴重的浪費，因此研究下腳料的深加工技術將成為我國食品加工行業的一大課題［6］。本實驗利用苦瓜飲料加工中所產生的苦瓜渣進行酶解制備多肽提取液，并對其中的多肽分子量分布進行初探，為進一步研究和充分利用苦瓜作為藥理活性物質提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦瓜渣 苦瓜飲料加工榨汁后的渣；纖維素酶酶活力1萬u/mL；木瓜蛋白酶 80萬u/g；牛血清白蛋白V、L-氧化型谷胱甘肽 Roche公司；桿菌肽、卵清蛋白 Sigma公司；L-還原型谷胱甘肽 日本；葡聚糖凝膠G-25 Pharmacia公司；其它所用化學試劑均為分析純。

精密pH酸度計，電熱恒溫水浴鍋，高速組織搗碎機，真空旋轉蒸發儀，杯式超濾器，10kDa超濾平膜，紫外可見分光光度計，數顯恒流泵、自動部份收集器，層析柱（50cm×1cm）。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦瓜渣主要成分分析 水分：直接干燥法（GB/T5009.3-2003）；蛋白質：凱氏定氮 法（GB/T5009.5-2003）；粗纖維：酸堿處理法（GB/ T5009.10-2003）。

1.2.2 多肽得率的測定［7］采用雙縮脲法，以牛血清白蛋白V為標準繪制標準曲線，精確稱取牛血清白蛋白V 0.5000g，配制成5mg/mL標準蛋白溶液，取6支試管，編號1～6，依次加入標準蛋白溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，加蒸餾水補足至2.0mL，即蛋白質含量分別為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg，各加入4.0mL雙縮脲試劑，混勻后室溫靜置15min，于540nm下測定其吸光值，根據吸光值（y）與蛋白質含量（x）繪制標準曲線。建立的回歸方程為 y=0.0252x-0.0022，r=0.9998。

1.2.3 酶解工藝研究

1.2.3.1 酶解工藝流程 苦瓜渣加3倍水→搗碎→纖維素酶酶解→木瓜蛋白酶酶解→沸水浴10min滅酶→過濾→酶解液→超濾（10kDa超濾平膜）→多肽得率測定

1.2.3.2 纖維素酶輔助酶解效果實驗 以多肽得率為考察指標，按表1方案進行纖維素酶輔助酶解效果實驗。木瓜蛋白酶酶解條件均為：加酶量（E∶S）2.5%、pH6.5、55℃、時間2.5h。

表1 纖維素酶輔助酶解效果實驗方案

1.2.3.3 木瓜蛋白酶酶解工藝條件的確定 根據單因素實驗結果，選定木瓜蛋白酶添加量、作用溫度、pH、時間4個因素各3個水平，按表2方案進行正交優化實驗。

表2 正交實驗因素水平

1.2.4 凝膠過濾層析法測定酶解液肽分子量分布

1.2.4.1 標準洗脫曲線的制作 分子量對照品各10mg，共同溶于4mL洗脫液中，制成分子量對照品標準溶液。

將已處理好的葡聚糖凝膠（Sephadex G-25）裝柱，用pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液作洗脫液，洗脫至基線平穩，加入標準溶液0.2mL，流速為0.3mL/min；紫外檢測波長為220nm；記錄最大吸收峰出現時洗脫液的流出體積（mL），以洗脫液的流出體積為橫坐標，各對照品分子量對數（lgM）為縱坐標，繪制標準洗脫曲線。

1.2.4.2 酶解液樣品肽分子量測定 經10kDa超濾平膜超濾后的酶解液樣品上樣0.2mL，按上述條件進行操作，用自動部分收集器收集不同組分，記錄各吸收峰出現時洗脫液的流出體積（mL）。通過標準洗脫曲線所得回歸方程計算酶解液中肽分子量分布。

2 結果與分析

2.1 苦瓜渣主要成分分析

苦瓜渣主要成分分析結果見表3。

表3 苦瓜渣主要成分分析結果

2.2 酶解工藝結果

2.2.1 纖維素酶輔助酶解效果研究結果 纖維素酶輔助酶解效果研究結果見圖1。

由圖1可知，2號實驗的多肽得率明顯高于1號實驗，說明用纖維素酶對苦瓜渣進行預處理，對后續木瓜蛋白酶酶解苦瓜渣蛋白制備多肽具有明顯的促進作用，這是因為纖維素酶可以有效地分解纖維素，使細胞壁破裂，有利于細胞內物質的分離和提取。圖1結果還表明，纖維素酶解作用時間2h時最佳，大于2h后多肽得率無明顯增加，因此選取纖維素酶作用時間為2h。

圖1 纖維素酶作用時間對多肽得率的影響

2.2.2 木瓜蛋白酶正交實驗 木瓜蛋白酶正交實驗結果與分析見表4和表5。

表4 正交實驗結果L9（34）

表5 正交實驗方差分析結果（p＜0.05）

由表4、表5數據可知，加酶量（E∶S）、溫度、pH三個因素對多肽得率均有顯著影響（p＜0.05），其影響順序依次為：木瓜蛋白酶添加量＞pH＞溫度＞時間，作用時間無顯著影響；最佳組合為：A2B1C3D1，即木瓜蛋白酶添加量（E：S）為3.0%、溫度50℃、pH6.5、時間2.5h。對優化條件進行驗證實驗，多肽得率為47.02%。

2.3 酶解液中多肽分子量分布

2.3.1 標準洗脫曲線 標準洗脫曲線見圖2。

圖2 標準洗脫曲線

回歸方程為y=-0.0223x+4.3148，r=0.9992，說明線性關系很好，可以根據此回歸方程計算出樣品物質的分子量。

2.3.2 酶解液樣品肽分子量測定 經10kDa超濾膜超濾后的酶解液經Sephadex G-25凝膠過濾分離，結果見圖3。

圖3 酶解產物（經10kDa超濾膜超濾）的Sephadex G-25凝膠洗脫圖譜

從圖3中可知，酶解液有四個明顯的洗脫峰，第1個峰的洗脫體積在27mL處，說明是柱前峰，第2、3、4三個峰的洗脫體積分別是51、63、75mL，根據回歸方程計算得三個峰的分子量分別為 1500、810、430Da。

3 結論

3.1 纖維素酶輔助酶解有助于提高多肽得率，其對苦瓜渣進行預處理條件為：加酶量（E∶S）為5%，溫度50℃，pH5.5，作用時間2h。

3.2 木瓜蛋白酶正交實驗優化出酶解條件為：加酶量（E∶S）為3.0%、溫度50℃、pH6.5、作用時間2.5h。

3.3 利用葡聚糖凝膠G-25層析測定酶解液中肽分子量分布，測得酶解液中含有三個小分子肽組分，分子量分別為：1500、810、430Da。

［1］張德純.苦瓜［J］.中國蔬菜，2008（8）：63.

［2］田亞維.苦瓜的研究概述［J］.醫學信息，2002，10（15）：619-671.

［3］Khanna Pushpa，Jain S C，Panagariya A，et al.Hypogly-cemic activity of polypeptide from a plant source［J］.J Nat Prod，1981，44（6）：648-655.

［4］Cotlikar M M，Rajorama M R，et al.Indian J Pharm［J］，1966，28（5）：129.

［5］徐光明 .天然苦瓜素降糖藥及其制備方法［P］. CN98110802，1999.

［6］牛廣財，孟憲軍，周麗萍.我國果蔬加工的現狀及發展前景［J］.糧油加工與食品機械，2003（2）：61-62.

［7］史鋒.生物化學實驗［M］.杭州：浙江大學出版社，2002：78-79.

Preparation of peptides from the residues of bitter gourd by enzymatic hydrolysis

ZHONG Wei-geng，RUAN Mei-juan，YIN Li-juan，XUE Nan
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The residues of bitter gourd beverage processing were taken as the main material of the preparation of the peptides，through the contrast test the cellulase hydrolysis time：2h was obtained.Concluded in the orthogonal test based on the single-factor test，the optimum enzymolysis condition of papain：［E/S］=3.0%，temperature 50℃，pH 6.5，reaction time 2.5h.lt was shown in the test result of sephadex G-25 chromatography that the peptides（＜5000Da）in enzymatic hydrolysate contained three main components，with molecular weights of：1500，810 and 430Da.

residues of bitter gourd；cellulase；papain；peptides；sephadex G-25

TS255.1

B

1002-0306（2011）01-0240-03

2010-01-26

鐘維庚（1984-），男，在讀碩士研究生，研究方向：農副產品深加工技術。