油茶餅粕蛋白提取及抗氧化酶解產物的制備

林秀椿，高剛峰，陳美高，倪 莉

（1.福州大學生物科學與工程學院食品技術研究所，福建福州350108；2.三明市林業科技推廣中心，福建三明365000）

油茶餅粕蛋白提取及抗氧化酶解產物的制備

林秀椿1，高剛峰2，陳美高2，倪 莉1

（1.福州大學生物科學與工程學院食品技術研究所，福建福州350108；2.三明市林業科技推廣中心，福建三明365000）

測定油茶餅粕的基本組成；確定茶粕蛋白提取的方法和工藝及其測定方法；通過微生物發酵、酶解等方法生產茶粕蛋白多肽，測定經處理后蛋白分子量分布情況，并測定其清除DPPH·和羥自由基能力。實驗表明，茶粕營養豐富，通過堿液水浴浸提可獲得18.70%蛋白質，浸提液酶解后可制備具有抗氧化能力的酶解產物，抗氧化能力隨著水解時間呈先增后減的趨勢，而茶粕經發酵后能得到較大比例的低分子量產物。油茶餅粕的經濟價值還有待進一步開發。

油茶餅粕，蛋白質，酶解，抗氧化肽

油茶（Camellia Oleifera Abel）系山茶科山茶屬植物，是一種常綠、長壽、果實含油率高的中國特有的油料樹種，也是與油棕、橄欖、椰子齊名的四大木本食用油源樹種之一［1］。油茶餅粕又稱茶餅、茶粕、枯餅等，榨取茶油后剩下的渣餅即是油茶餅粕，其數量相當于茶油的三倍，我國油茶餅粕的年平均產量約為40萬t［2］。由于我國油茶茶籽主要采用傳統榨油工藝制油，所生產的茶粕中茶皂素、單寧等抗營養因子含量過高，不適宜直接用于動物生產，大部分被用作清塘劑、肥料、燃料，甚至廢棄，少量用于茶皂素的提取，極少部分用作飼料。有研究報道茶粕營養豐富，因而茶粕的廢棄是資源的極大浪費，甚至對環境也構成了極大壓力。目前關于茶粕的研究較少，少數幾篇油茶餅粕蛋白提取的研究主要是采用堿提酸沉的方法獲得蛋白質，由于不同的蛋白等電點不同，因而該法一般不能得到茶粕中全部的蛋白質。本研究充分利用了茶籽油產品的副產物油茶餅粕，擬通過發酵、酶解等樣品處理方式從中獲得抗氧化產物，提高其經濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶餅粕 沈郎食用油公司提供，粉碎過篩待用；蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D 丹麥NOVE公司；紅曲霉、米曲霉、構巢曲霉 實驗室分離制備；無水乙醇、HCl、NaOH、石油醚等 均為分析純。

HH-8型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；KDN-16C型數控消化爐 上海新嘉電子有限公司；V-1200型可見光分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；MA35型水分快速測定儀 上海精密科學儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品基本成分測定

1.2.1.1 水分含量測定 使用快速水分測定儀測定茶粕的水分含量。

1.2.1.2 蛋白質含量測定 參考文獻［4］，采用半微量凱氏定氮法測定茶粕蛋白質含量。

1.2.1.3 總糖含量測定 根據文獻［5-6］，采用蒽酮-硫酸法測定茶粕樣品總糖含量。

1.2.1.4 脂肪含量測定 索氏提取法測定茶粕樣品脂肪含量。

1.2.1.5 總酚含量測定 參考中國藥典中鞣質含量測定方法。

1.2.1.6 灰分含量測定 根據文獻［4］所述方法測定茶粕灰分含量。

1.2.1.7 粗纖維含量測定 參考國標GB/T5515中粗纖維含量測定方法。

1.2.2 茶粕蛋白的提取 采用蒸餾水、乙醇水和氫氧化鈉溶液三種不同溶劑水浴提取茶粕中的蛋白質，對比不同溶劑浸提的蛋白提取率；此外還對比了水浴前未經處理和高壓處理之后的提取效率。

1.2.3 提取工藝條件的優化 分別考察提取溫度、提取時間、料液比和提取液濃度等因素對茶粕蛋白提取的影響，設計正交實驗確定提取茶粕蛋白最優條件，因素水平表如表1所示。

表1 因素水平表

1.2.4 茶粕蛋白浸提液中蛋白質含量測定 對比茶粕蛋白浸提液中蛋白質含量測定的三種方法：考馬斯亮藍法、福林酚法和凱氏定氮法。

1.2.5 茶粕蛋白水解產物的制備

1.2.5.1 茶粕的酶解工藝 根據確定的提取茶粕蛋白最優工藝對茶粕進行提取蛋白處理，酶解蛋白質浸提液，工藝流程如下：

茶粕浸提液→調pH→加酶恒溫水解→滅酶→酶解液

1.2.5.2 茶粕的發酵工藝 采用微生物發酵法制備茶粕蛋白的水解產物，將產酶和酶解兩個步驟相結合。選取3株產蛋白酶活力較高的菌種紅曲霉、米曲霉、構巢曲霉。

茶粕培養基制備→滅菌→接種→發酵→烘干、粉碎→浸提液

1.2.6 茶粕蛋白水解產物的分離和抗氧化性質的研究

1.2.6.1 隆丁區分法測定茶粕蛋白水解產物的高、中、低分子蛋白分布 其測定原理是高分子含氮物質在酸性溶液中易為單寧所沉淀，磷鉬酸可同時沉淀高、中分子含氮物質，低分子含氮物質則不為上述試劑所沉淀。

1.2.6.2 茶粕蛋白水解產物抗氧化活性測定 參照文獻［7］，通過使用不同酶對蛋白質的作用得到茶籽多肽對DPPH·和羥自由基清除作用的測定，量化茶籽蛋白多肽抗氧化能力。

茶粕蛋白水解產物DPPH·清除能力測試見表2，清除率計算公式如下：

式中：Ca-2mL DPPH溶液+2mL待測溶液的吸光值；Cb-2mL待測溶液+2mL乙醇的吸光值；C0-2mL DPPH溶液+2mL蒸餾水的吸光值。

表2 茶籽蛋白酶解物DPPH·清除能力測定

茶籽蛋白水解產物羥自由基清除作用的測定按表3的程序操作，添加后振蕩混合后靜置60min，在510nm波長處測吸光值，清除率計算如下式：

式中：Ao-未加被測物吸光度值；As-加入被測物后吸光度值；Ai-樣品自身空白吸光值。

表3 羥自由基清除能力測定操作程序（mL）

2 結果與分析

2.1 茶粕基本成分分析

對茶粕基本組成成分進行分析，其中粗蛋白含量9.78%，總糖含量32.02%，粗脂肪含量8.48%，三大營養物質占50.28%，干重為56.03%，其他數據如表4所示，因此可以說茶粕蛋白中具有相當可觀的營養價值有待開發。然而，茶粕中還含有兩大抗營養因子茶皂素和單寧，這是茶粕不能被用作動物飼料的重要原因。

2.2 茶粕蛋白提取方法的確定

通過蒸餾水、50%的乙醇溶液、氫氧化鈉溶液3種不同的浸提液對茶粕蛋白提取，結果如表5所示，堿提所得蛋白含量明顯高于其他兩種方法，堿提蛋白質含量達到15.25%，而水提和醇提分別為9.66%、9.55%。

表4 茶粕的基本組成成分（%）

表5 不同提取茶粕蛋白方法的比較

2.3 提取茶粕蛋白最優條件的確定

經過料液比、堿液濃度、提取溫度、提取時間四個因素的單因素實驗，初步確定提取參數的范圍，設計正交實驗采用L9（34）正交表進行實驗，各因素對其影響的主次順序為提取時間＞堿液濃度＞提取溫度＞料液比。實驗結果可知最優水平組合為：提取料液比2%，堿液濃度3%，提取溫度80℃，提取時間120min。在此最佳工藝條件下重復實驗，計算其平均值18.70%。

表6 提取茶粕蛋白最佳條件正交實驗結果

2.4 蛋白提取液中蛋白質含量測定方法的對比

結合表7中數據，綜合考慮測定蛋白質含量測定過程中的可操作性、重現性和標準曲線的可靠性，福林酚法測定提取液中蛋白質含量是較佳的選擇。

表7 蛋白提取液中蛋白質含量測定方法的對比

2.5 茶粕蛋白水解物制備

按照確定的最優工藝提取茶粕蛋白，在各酶最適作用條件下（如表8），分別添加蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D至蛋白濃度為0.88mg/mL的提取液中進行水解，獲得酶解產物。

表8 酶解處理表

2.6 茶粕蛋白水解物的鑒定和分離

2.6.1 茶粕蛋白水解產物的高、中、低分子蛋白分布

隆丁區分法可以初步確定茶粕蛋白水解產物的高、中、低分子蛋白分布，如圖1所示，茶粕蛋白酶B酶解液中接近一半是中分子蛋白，22.39%是低分子蛋白，可能包括一些低分子蛋白、肽類物質和游離氨基酸；高壓處理后再經蛋白酶B作用的酶解液中高分子蛋白含量和中分子蛋白含量分別降低26.07%和38.72%，低分子蛋白含量明顯增大，增量達到96.10%，這驗證了高壓處理有效促進了酶解的結論；發酵后低分子蛋白含量達到49.38%，但是高分子蛋白含量達到48.15%，這可能是由于菌體本身蛋白含量比較高，因此高分子蛋白含量較高。

圖1 茶粕蛋白水解產物的高、中、低分子蛋白分布

2.6.2 不同蛋白酶解液的抗氧化活性 通過測定茶粕中蛋白酶解液的DPPH·和羥自由基清除活性，實驗結果表明茶粕中含有抗氧化性物質，由圖2可知，清除能力為蛋白酶B＞蛋白酶C＞蛋白酶A＞蛋白酶D＞空白，即蛋白酶B所水解出來的多肽清除DPPH·的能力最強，而空白是不經酶解直接將蛋白浸提液進行DPPH·清除實驗，也有一定的清除能力，說明浸提液中本身也含有少量具有抗氧化能力的成分，經過酶解后其抗氧化能力得到了很大的提高，其中經過蛋白酶B酶解后其抗氧化能力提高5.8倍，達到83.33%。

圖2 不同蛋白酶解液的抗氧化活性比較

2.6.3 抗氧化活性與水解時間的關系 以蛋白酶B為例，研究抗氧化活性與水解時間的關系。隨著酶解時間的推移，DPPH·的清除能力也是隨之而變化的，總體的趨勢是隨著酶解時間的增加，抗氧化性能先增高再降低，從圖3中的趨勢可以看到，并不是水解程度越高抗氧化活性就越高，這說明蛋白水解物的抗氧化活性成分可能是由幾個氨基酸排列形成的具有活性的肽類物質。

圖3 水解時間與DPPH·清除活性的關系

3 結論

本研究通過測定茶粕中的基本組成，明確了茶粕可觀的營養價值。通過采用堿提、水提和醇提三種方法，從而篩選出適用于茶粕蛋白提取的方法，結果驗證了茶粕蛋白中大部分蛋白質易溶于堿液。設計正交實驗優化茶粕蛋白提取的工藝條件，最優條件為：提取料液比為2%，堿液濃度為3%，提取溫度為80℃，提取時間為120min，其提取效果可以達到18.70%，而在水浴前對茶粕進行高壓處理有助于蛋白更好地溶出。按照最優工藝條件對茶粕樣品進行提取蛋白，分別選用蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D四種酶對蛋白提取液進行酶解，測定四種酶的DPPH·和羥自由基清除率，蛋白酶B的效果最好；隨著酶解時間的推移，DPPH·的清除能力先增高再降低。酶解后接近一半是中分子蛋白，22.39%是低分子蛋白。此外，發酵后低分子蛋白含量達到49.38%，但是高分子蛋白含量達到48.15%，這可能是由于菌體本身蛋白含量比較高?？傊?，油茶籽粕作為茶油提取的下腳料，來源充足，具有豐富的營養價值，因而開發其經濟價值有廣闊的前景。

［1］鐘海雁，謝碧霞，王承南.我國油茶加工利用研究現狀及分析［J］.林業科技，2001，15（4）：6-8.

［2］國家統計局.中國統計摘要［M］.北京：中國統計出版社，1993：67.

［3］佟云偉，陳鳳香，楊波濤.不同食用植物油氧化穩定性的研究［J］.中國油脂，2009（2）：8.

［4］無錫輕工大學，天津輕工業學院.食品分析［M］.北京：中國輕工業出版社，2007.

［5］白玲，黃健.基礎生物化學實驗［M］.上海：復旦大學出版社，2004.

［6］文赤夫，董愛文，李國章，等.蒽酮比色法測定紫花地丁中總糖及還原糖含量［J］.現代食品科技，2005，21（3）：122-123.

［7］唐勇，趙靖，徐靜，等.植物總抗氧化能力的微孔板定量測定及評價［J］.第三軍醫大學學報，2008，30（6）：517-520.

［8］伍曉春，熊筱娟，陳武.油茶餅粕中植物蛋白的提取分析［J］.宜春學院學報，2008，4（30）：29-30.

Study on extraction of protein and preparation of antioxidative peptide from Camellia Oleifera Abel

LIN Xiu-chun1，GAO Gang-feng2，CHEN Mei-gao2，NI Li1
（1.Institute of Food Science and Technology，Fuzhou University，Fuzhou 350108，China；2.Forestry Scienceamp;Technology Promotion Center，Sanming 365000，China）

Determined the basic composition of the oil-tea Camellia seed cake，found method and technology to extract protein，produced protein peptides through enzymolysis and fermentation，and analysed the distribution of different molecular weight proteins，then determined their inoxidabilities.Experimental data showed that，oil-tea Camellia seed cake had rich nutrition ingredients，through alkaline bath 18.70%protein can be obtained.Enzymatic hydrolysis of leaching liquor turned out to be antioxidative peptides，and DPPH· scavenging activities first increased and then decreased under different hydrolysis time，while the fermentation result got larger ratio of low molecular weight products.The economic value of oil-tea Camellia seed cake still needs further development.

oil-tea Camellia seed cake；protein；enzymolysis；antioxidative peptides

TS272

B

1002-0306（2011）01-0219-04

2009-12-28

林秀椿（1984-），女，碩士，研究方向：食物資源開發與利用。

福建省林業廳科研計劃項目基金資助（閩材料2009［8］號）。