一株降解南瓜多糖芽孢桿菌的分離鑒定

張明麗，唐夢瑤，牛天貴，李全宏

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

一株降解南瓜多糖芽孢桿菌的分離鑒定

張明麗，唐夢瑤，牛天貴，李全宏*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

南瓜多糖具有降血糖功能，但由于其分子量大、結構復雜等特點，不利于南瓜多糖的加工利用。實驗直接從南瓜樣品中分離得到一株芽孢桿菌，命名為J-6菌株，該菌能夠有效地降解南瓜多糖，酶活可達3.268U/mL。通過形態觀察、生理生化實驗、16S rDNA同源性序列分析，初步確定J-6菌株屬于芽孢桿菌屬。

南瓜多糖，降解，芽孢桿菌，16S rDNA

南瓜是重要的藥食兩用植物，其營養豐富，含有糖類、脂肪、粗纖維、多種氨基酸、維生素及礦物質等。南瓜多糖已被證實具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗微生物、免疫調節等功效［1-4］，其加工利用已逐步成為關注的重點。但是，研究發現南瓜多糖是以葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖為單糖組成的酸性雜多糖，分子量從數萬到數千萬道爾頓不等，糖苷鍵類型和空間結構復雜［5］，而目前尚缺乏降解南瓜多糖的專一性酶，因此，亟待尋求一種方法，能夠安全高效地降解南瓜多糖。南瓜本身營養豐富且全面，其中碳水化合物含量尤其高，能夠滿足某些微生物生長利用的需要，所以本研究嘗試直接從南瓜上分離菌株，利用其產生的復合酶系實現南瓜多糖的降解。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種來源 菌種由腐爛的南瓜上分離得到，共35株；南瓜多糖 由本實驗室制備；斜面培養基（g/L） 牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，食鹽5.0，瓊脂15， pH7.0～7.2；篩選培養基（g/L） （NH4）2SO42，MgSO4·7H2O 0.2，NaH2PO40.5，KH2PO40.5，CaCl20.1，碳源10，pH7.0～7.2。

YT-CJ-1N超凈工作臺 北京亞泰科隆有限公司；DHP-9082型電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；XMTB數顯調節儀 北京市長風儀器儀表公司；T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；DNAout試劑提取盒 四川省綿陽高新區天澤基因工程有限公司；PTC-200DNA Engine cycle BIO-RAD；XSP-2CA顯微鏡 上海永亨光學儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 降解南瓜多糖菌株的分離、篩選 菌株通過稀釋涂布平板的方法，從南瓜樣品制備的菌懸液中得到，純化后保藏。根據菌株在篩選用的固體培養基上的生長情況，生長良好的菌種進入復篩，接種于篩選用液體培養基，以多糖降解酶的酶活為指標，篩選出酶活最高的菌株作為實驗的目標菌株。

1.2.2 多糖降解酶活的測定［6］向試管加入0.5mL底物溶液，0.4mL磷酸鹽緩沖液（pH7.0），50℃預熱10min后加入0.1mL粗酶液，50℃反應15min后加入3mL DNS試劑，沸水浴顯色10min后，迅速放入冰水浴中冷卻，蒸餾水稀釋至20mL，測540nm處吸光值，以蒸餾水做空白，三次平行取算術平均值。每份酶液100℃滅活10min后加入底物體系中，其他步驟與酶活測定步驟相同。

多糖降解酶的酶活定義：50℃下，1min內1mL粗酶液降解1mL南瓜多糖（0.1%，m/v）產生還原糖的毫克數為一個酶活單位（U），計算公式為：式中：Ea為多糖降解酶的酶活，U；V1為比色液的最終體積，mL；C為從標準曲線上查得的反應液中葡萄糖的濃度，mg/mL；V2為底物的體積，mL；V3為酶液的體積，mL；T為酶解反應的時間，min。

1.2.3 平均聚合度的測定［7］平均聚合度的計算公式如下：

1.2.4 菌種的鑒定

1.2.4.1 形態觀察 將菌種接種于牛肉膏蛋白胨培養基平板上，37℃培養48h后觀察菌落形態、色澤，顯微鏡觀察細胞形狀以及革蘭氏反應結果。

1.2.4.2 生理生化鑒定 參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》［8］，主要是唯一碳源、唯一氮源、淀粉水解、葡萄糖產氣、V-P反應、甲基紅反應等。

1.2.4.3 細菌16S rDNA基因序列的測定 基因組的提取使用細菌DNAout試劑盒提取，16S rDNA的擴增選用16S rDNA細菌通用性引物27f/1492r［5′端引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；3′端引物：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′］。擴增反應采用50μL體系：10×Taq聚合酶反應緩沖液5μL，dNTP 4μL，5′端引物1μL，3′端引物1μL，菌體DNA 1μL，TaqDNA聚合酶1μL。PCR反應采用冷啟動，條件為：94℃預變性5min，按94℃變性1min；55℃退火30s，72℃延伸1min進行35個循環，最后一輪反應在72℃延伸5min。PCR產物經質量分數1%瓊脂糖凝膠電泳檢查，用凝膠回收純化試劑盒回收擴增到的目的片段，由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果在GenBank數據庫中進行同源性檢索。

2 結果與分析

2.1 南瓜多糖降解菌株的篩選、分離

將在牛肉膏蛋白胨培養基上分離純化得到的35株菌，接種在篩選培養基平板上，37℃培養48h觀察其生長情況。結果表明，在這35株菌種中，有10株生長明顯。將這10株菌接種到篩選用液體培養基中，37℃下轉速為150r/min搖床培養48h后，測定多糖降解酶的酶活力和發酵液中糖的平均聚合度，選出多糖降解酶活力最高并且糖平均聚合度最低的一株菌，命名為J-6。結果見圖1與圖2。

2.2 J-6菌株鑒定

J-6菌株為需氧的G+菌（見圖3），有運動性，染色后在顯微鏡下能清楚地觀察到芽孢。在蛋白胨營養瓊脂培養基上培養后，菌株菌落濕潤光滑、不透明、有鋸齒狀邊緣。生理生化的測定結果表明，該菌菌株J-6對很多碳源都不能利用，但可以利用麥芽糖，能利用硫酸銨、磷酸氫二銨作為氮源，氧化酶陽性，能水解淀粉和油脂等（表1）。

圖1 不同菌株的酶活比較

圖2 不同菌株發酵液中糖成分的平均聚合度

圖3 J-6在光學顯微鏡下的革蘭氏染色圖

經PCR擴增后（擴增后的電泳圖譜見圖4），菌株J-6的16S rDNA序列全長有1394bp。用BLAST軟件將該序列與GenBank中已報道的16S rDNA序列進行同源性比較，發現J-6菌株與芽孢桿菌屬中的成員有較高的同源性，同源性為100%，包括有Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus vallismortis、Bacillus pumilus。

圖4 J-6基因擴增后的電泳圖譜

3 結論

本文直接從腐爛的南瓜樣品中篩選出一株能夠有效降解南瓜多糖的菌株J-6，該菌有運動性，內生芽孢，菌落表面濕潤光滑，邊緣不整齊，呈鋸齒狀。該菌能夠利用麥芽糖，但是不能利用葡萄糖、甘露醇等。該菌接種在篩選用液體培養基上，37℃下轉速為150r/min搖床培養48h后，酶活可達3.268U/mL，即1mL粗酶液酶解1mL0.1%南瓜多糖溶液15min，還原糖增加了49.02mg。下一步將優化該菌的發酵條件，包括培養基成分和培養條件。

表1 菌株J-6的生理生化實驗結果

生物體的16S rDNA在同一屬內極其保守，常作為物種鑒定的一個十分重要的指標。本文通過選擇一對通用引物，成功地對菌株J-6進行了16S rDNA擴增，并完成了測序。通過與GenBank數據庫中的序列比對，初步確定其為芽孢桿菌屬。其與Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus vallismortis和Bacillus pumilus有很高的同源性，但這四種菌表型相似，不易區分，僅從同源性上很難精確確定菌株J-6的分類地位。目前也有采用16S rDNA同源性分析以及部分基因特異性序列分析結合起來，利用特異性引物進行PCR擴增，進行菌株的確定。至于J-6是否是芽孢桿菌屬中的一個新菌，還需要應用DNA-DNA同源性分析等實驗進一步來鑒定。

［1］李全宏.南瓜降血糖成分分離技術及其功能研究［D］.北京：中國農業大學博士學位論文，2002.

［2］左耀明，葉士伶，萬小蘭，等.南瓜多糖的提取、分析和降血糖實驗研究［J］.食品科學，2001，21（12）：56-58.

［3］Li Quanhong，Fu Caili，Rui Yukui.Effects of protein-bound polysaccharide isolated from pumpkin on insulin in diabetic rats［J］.Plant Foods for Human Nutrition，2005，60（1）：13-16.

［4］ Fu Caili，ShiHuan，LiQuanhong.A review on pharmacological activities and utilization technologies of pumpkin［J］.Plant Foods for Human Nutrition，2006，61（2）：73-80.

［5］張凡華，李全宏，等.低分子量南瓜多糖的提取、純化及結構初步研究［J］.食品工業科技，2008，29（3）：93-95.

［6］武改蘭.微生物法制備南瓜戊糖的初步研究［D］.北京：中國農業大學碩士學位論文，2009.

［7］王杏文.木聚糖的高溫酸降解與酶降解［D］.南京：南京林業大學碩士學位論文，2004.

［8］布坎南R E，吉布斯N E.伯杰細菌鑒定手冊［M］.第8版.北京：科學出版社，1987.

［9］李超敏，石曉，竇會娟，等.一株蛋白酶產生菌的分離鑒定［J］.食品工程，2008（3）：48-50.

［10］權春善，王軍華，徐洪濤，等.一株抗真菌解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其發酵條件的初步研究［J］.微生物學報，2006，46（1）：7-12.

Screening and identification of bacillus for degradating pumpkin polysaccharide

ZHANG Ming-li，TANG Meng-yao，NIU Tian-gui，LI Quan-hong*
（College of Food Scienceamp;Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Pumpkin polysaccharide has been proved to have hypoglycemic function.However，because of its large molecular weight，complex structure and other characteristics，pumpkin polysaccharide can not be fully processed and utilized.An endospore-forming bacterium，designated strain J-6，was isolated from pumpkin.lt presented remarkable activity to degradate pumpkin polysaccharide，up to 3.268U/mL.The phenotypic and genotypic characteristics indicated that the strain J-6 belonged to the genus of bacillus.

pumpkin polysaccharide；degradation；bacillus；16S rDNA

TS255.1

A

1002-0306（2011）01-0159-03

2009-12-10 *通訊聯系人

張明麗（1986-），女，碩士研究生，研究方向：農產品加工及貯藏工程。

國家自然科學基金資助項目（30671469）。