豬胰臟淀粉酶的提取、部分純化與性質研究

閔玉濤，宋彥顯，徐鳳才，馬慶一，*

（1.中州大學，河南鄭州450044；2.鄭州輕工業學院，河南鄭州450002）

豬胰臟淀粉酶的提取、部分純化與性質研究

閔玉濤1，宋彥顯1，徐鳳才2，馬慶一2，*

（1.中州大學，河南鄭州450044；2.鄭州輕工業學院，河南鄭州450002）

以豬胰臟為原料，采用異丙醇沉淀、硫酸銨鹽溶鹽析、透析和反滲透系列方法對淀粉酶提取純化，并對其性質進行了研究。結果表明，制備的反滲透酶比活力達856U/mg，約為粗酶（146U/mg）的6倍，可替代市購粗淀粉酶用于實驗，其最適溫度和pH分別為37℃和6.9。

豬胰淀粉酶，鹽溶鹽析，透析，反滲透，比活力

我們的系列研究工作涉及到在一個模擬的人工胃腸中探討α-淀粉酶催化的第一步淀粉消化過程，實驗中需要大量的淀粉酶。目前，微生物發酵產酶是α-淀粉酶的主要來源，廉價的發酵法所生產的淀粉酶可以很容易地從市場上獲取。但我們遭遇到事先未預料到的困難：市售的粗酶含有大量的糖類，從而對實驗中用做分析跟蹤的硫酸苯酚測糖法造成嚴重干擾。從動物原料提取α-淀粉酶是一種傳統的制備方法。利用該法所得到的酶與微生物源酶在最適作用溫度、pH、抑制劑等方面有一定差異。盡管微生物發酵法頗具優勢，后來居上已成為生產淀粉酶的主要方法，但傳統的提取法仍然應用于某些場合，例如在研究人體生理和藥物的制備等科研工作中。哺乳動物提取酶由于與人體酶更相近，因而更適合采用。例如豬胰淀粉酶和人體內的淀粉酶一樣都是α-淀粉酶，其分子量均約為46kD，最適pH6.7～7.0。目前，我國動物來源的胰α-淀粉酶主要從國外進口，價格昂貴，且到貨周期長，給科研工作帶來極大的不便。豬胰臟來源廣泛，且由于口感不佳，在屠宰場經常被遺棄，價格低廉。從豬胰臟中提取α-淀粉酶在國內還鮮有報道，本文研究了從豬胰臟中提取α -淀粉酶，初步純化以及酶的性質等。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

新鮮豬胰臟 鄭州鄭榮屠宰場；所用試劑 均為國產分析純。

J-25立式高速低溫離心機（BECKMANCOULTER），UV754紫外分光光度計，磁力攪拌器，低溫層析柜，新飛BCD-245D冰箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 相關試劑的配制

1.2.1.1 3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑的配制［1］精確稱取3，5-二硝基水楊酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至100mL。

1.2.1.2 麥芽糖標準溶液的配制 將麥芽糖放置在烘箱中80℃烘干，準確稱取0.050g，加入蒸餾水，定容至50mL，配制成1000μg/mL的麥芽糖標準溶液。

1.2.1.3 1%可溶性淀粉溶液的配制 精確稱取可溶性淀粉1.0g于小燒杯中，加入40mL蒸餾水，在電爐上加熱至溶液透明，冷卻至室溫，轉移到100mL容量瓶中，用蒸餾水反復洗滌燒杯，一并轉移至容量瓶中，定容至100mL。

1.2.2 豬胰臟α-淀粉酶的提取、部分純化

1.2.2.1 豬胰臟 α-淀粉酶的提?。?］取新鮮豬胰臟，去除雜質后取100g，在絞肉機中攪碎成漿，加入160mL 7.5%異丙醇（磷酸鹽緩沖液配成），1gCaCl2，4℃下提取4h，再在4℃下5000r/min離心20min，上清液為粗酶液（酶①145mL）。

1.2.2.2 豬胰臟α-淀粉酶的部分純化 部分純化流程如圖1所示。

圖1 酶部分純化流程示意圖

1.2.3 豬胰臟α-淀粉酶的活性測定

1.2.3.1 酶液中蛋白含量測定 取一定量的酶①、酶②、酶③及反滲透酶，經適當稀釋，在 260nm和280nm波長處分別測定其吸光度值，然后利用Lowry -Kalckar公式［3］計算蛋白質的濃度。

1.2.3.2 酶比活力的測定 麥芽糖標準曲線的繪制：分別取麥芽糖標準溶液0、100、200、400、600、800μL，分別放入不同試管中，用水補至1000μL，加1mL DNS，置于沸水浴中加熱4min顯色，冰水浴中靜置4min冷卻，定容至10mL，在分光光度計上于540nm下讀取吸光度值，繪出標準曲線。酶比活力的測定：在6份600μL緩沖溶液中，分別加入200μL 1%的可溶性淀粉為底物，37℃恒溫水浴10min后，分別加入200μL酶①、酶②、酶③和反滲透酶稀釋液，用秒表開始準確計時，4min后分別加入1mL DNS，沸水浴加熱5min顯色，冰水浴靜置5min冷卻，用水補至10mL，分別于分光光度計上在540nm下測定吸光度值。同時以不加酶的作空白對照實驗，以扣除可溶性淀粉中原有還原糖的干擾。根據麥芽糖標準曲線算出生成產物的量，并計算出酶反應速度。酶活力定義：1%的可溶性淀粉為底物，pH6.9，溫度37℃下，每分鐘生成1μg麥芽糖所用的酶量為一個酶活力單位。

1.2.4 豬胰淀粉酶性質研究

1.2.4.1 最適酶用量的確定［4］按表1中順序添加試劑及適當稀釋酶液進行測定。取5組（每組7個）試管和一定稀釋倍數的α-淀粉酶，用來測定反應的初始速率。酶反應開始后，準確計時，每間隔1min，分別向每組中的一個試管內加入1mL DNS終止反應，將反應液置沸水浴5min，迅速冷卻，加蒸餾水稀釋到10mL，在540nm處，以空白作對照，測定吸光度值。

表1 最適酶量的確定實驗

1.2.4.2 酶活與溫度的關系 以1%可溶性淀粉為底物（200μL），在pH 6.9的條件下，加入200μL的酶，在20、30、35、40、45、50、60℃下分別反應5min后，加DNS終止反應，顯色后，用水將體積補至10mL，在540nm處測定其吸光度，同時用不加酶的體系作對照。

1.2.4.3 酶活與pH的關系 在37℃酶及底物用量均為200μL的條件下，改變pH（5、5.5、6、6.5、7.0、7.5、8.0），其它操作同1.2.4.2。

2 結果與討論

2.1 豬胰臟α-淀粉酶的提取和部分純化

由于酶是生物活性物質，高溫易變性失活，因此其提取全過程的溫度要控制在4℃以下，以保證酶具有足夠的活力。粗酶應用有機溶劑沉淀法、硫酸銨鹽溶鹽析、透析和聚乙二醇反滲透的方法進行不斷純化，得到比活力較高、貯藏時間長的反滲透酶液。利用酶蛋白質分子不能通過半透膜的性質，透析除去硫酸銨，從而得到提純的酶液。反滲透可以濃縮酶，提高其濃度，從而防止其失活，有利于酶的貯藏。

提取過程不能與金屬和玻璃制品接觸，以避免酶失活。在實驗過程中，酶稀釋液保藏于4℃的環境中，而且伴隨著酶的失活，其稀釋液要少量多次地配制，并經常檢測酶的活力。

2.2 豬胰臟α-淀粉酶活性測定

2.2.1 麥芽糖標準曲線的繪制 麥芽糖標準曲線如圖2所示，標準方程為：

y=0.0012x-0.0279（R2=0.998）。

圖2 麥芽糖標準曲線

2.2.2 酶液中蛋白含量測定 Lowry-Kalckar公式計算結果如表2所示。

表2 不同類型酶液蛋白質含量

2.2.3 透析酶比活力的比較 對同一種酶來說，比活力越高，表明酶越純。為檢測純化后酶的活性，對酶①、酶②、酶③以及反滲透酶的活力進行了比較測定。酶①、酶②、酶③以及反滲透酶分別稀釋100、200、2000、2500倍后催化淀粉的反應，經顯色后測得它們的A540分別為0.10、0.08、0.86、0.45，根據麥芽糖標準曲線算出生成產物的麥芽糖量分別為23.35、23.33、24.11、23.70μg。

由式（2）和式（3）計算酶的比活力大小，結果見表3。

表3 不同純度酶的比活力表

由表3可知，酶在純化過程中比活力越來越高，說明酶的純度在不斷提高。反滲透酶的比活力最高（856U/mg），是酶①（粗酶）比活力（146U/mg）的5.86倍。

2.3 酶性質的研究

2.3.1 最適酶量的確定 不同量的 α-淀粉酶在7min內的酶反應動力學進程曲線如圖3所示。酶活力測定就是要使酶反應的初速率（V0）達到最大速率Vm，即在過量底物存在下的零級反應期的速率，此時反應速率和酶濃度［E］之間有線性關系。確定用于動力學分析的最適酶量是重要的關鍵步驟，如果反應液中酶量太少，在反應一段時間后，吸光值將改變很少，以至于顯示底物濃度改變和抑制劑作用差異引起的變化很困難；另一方面，若是反應中酶量太多，將使反應進程太快，由于底物迅速消失，時間歷程曲線趨向平坦，反應達到平衡的時間過早出現，因此測不到產物生成量與酶反應時間成線性關系的這一段時間內的初速率，即得不到反應速率和酶量成正比關系的結果。為避免這兩種極端情況的出現，必須使測定的反應速率（以ΔA/min表示）的吸光度值在0.03～0.25/min之間［5］。

從圖3中可以看出，［E］越大，線性反應期越短。比較不同酶量反應進程曲線方程的線性時間范圍，發現即使在酶量為250μL時的反應進程曲線，在4min內也有較好的線性關系，這也說明所有酶量的酶反應進程曲線在4min反應時間內，皆有很好的線性關系，因此在4min內測得的速率為反應初始速率。比較反應的初始速率后，選定酶量為200μL，反應時間4min進行動力學常數的測定。

2.3.2 溫度與酶活性的關系 由圖4可知，α-淀粉酶在不同溫度下的活力不同，在35～40℃溫度范圍內保持較高的活力，其最適溫度為37℃。當溫度高于和低于37℃時，酶活力都變小。這是由于在酶反應的最初階段，酶蛋白的變性尚未表現出來，因此反應速率隨溫度升高而增加，但高于最適溫度37℃時，酶蛋白變性逐漸突出，反應速率隨溫度升高的效應將逐漸為酶蛋白變性效應所抵消，反應速率迅速下降。值得注意的是：最適反應溫度并非常數，在不同底物濃度、不同pH、不同反應時間的條件下，最適溫度也會有所差異。

圖3 不同酶量反應進程曲線

圖4 溫度與酶反應速度的關系圖

2.3.3 pH與活性的關系 由圖5可知，α-淀粉酶在不同的pH下活力不同，在6.5～7.0范圍內保持較高的活力，其最適pH為6.9。由于酶活力受pH的影響很大，在最適pH附近最為穩定，故在pH為6.9時，α-淀粉酶最有利于與底物結合并發生催化作用，活力最高。

圖5 pH與酶反應速度的關系

3 結論

3.1 采用異丙醇沉淀，硫酸銨鹽溶鹽析和透析相結合的方法純化α-淀粉酶，酶活力明顯提高。異丙醇沉淀、硫酸銨鹽溶鹽析、透析和反滲透每一步操作都使酶活有所增加，其中反滲透酶的比活力最高（856U/mg），是酶①即粗酶比活力（146U/mg）的5.86倍，可作為實驗用酶。

3.2 在35～40℃溫度范圍內保持較高的活力，其最適溫度為37℃；pH在6.5～7.0范圍內保持較高的活力，其最適pH為6.9。

［1］李巧枝.生物化學實驗技術［M］.北京：氣象出版社，2002：44-45.

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［3］徐朝暉，趙愛華，高先富.具降糖活性的牛蒡子提取物的化學成分［J］.中國天然藥物，2006，4（6）：444.

［4］劉睿，潘思軼，等.高粱原花青素對α-淀粉酶活力抑制動力學的研究［J］.食品科學，2005，26（9）：189-192.

［5］陳曾，劉兢，羅丹.生物化學實驗［M］.合肥：中國科技大學出版社，1994：26.

Study on isolation，purification and characterization of porcine amylopsin

MIN Yu-tao1，SONG Yan-xian1，XU Feng-cai2，MA Qing-yi2，*
（1.Zhongzhou University，Zhengzhou 450044，China；2.Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China）

The amylopin was extracted from porcine pancreas，partially purified and characterized by using a combination of precipitation with isopropanol，solving-precipitating with ammonium sulfate，dialysis and reverse osmosis.The results showed that the specific activity of amylopin from porcine pancreas was 856U/mg protein，almost 6 times as that of crude enzyme（146U/mg）.The amylopin can be a substitution of commercially available enzyme and used in our experiments.The optimum temperature and pH value were 37℃and 6.9 respectively.

amylopin；salt solvent and salting-out；dialysis；reverse osmosis；specific activity

TS201.2+5

A

1002-0306（2011）01-0169-04

2010-03-01 *通訊聯系人

閔玉濤（1978-），男，碩士研究生，助教，研究方向：食品生物技術。