L.PARACASEI HD1-7與S.ALBULUS1-25原生質體融合選育產天然防腐劑的優良菌株

雷 虹，張鐵丹，金忠斌，莊海霽，何 欣，張基亮，平文祥，周東坡

（黑龍江大學生命科學學院微生物黑龍江省高校重點實驗室，黑龍江哈爾濱150080）

L.PARACASEI HD1-7與S.ALBULUS1-25原生質體融合選育產天然防腐劑的優良菌株

雷 虹，張鐵丹，金忠斌，莊海霽，何 欣，張基亮，平文祥*，周東坡*

（黑龍江大學生命科學學院微生物黑龍江省高校重點實驗室，黑龍江哈爾濱150080）

為獲得更具優良應用特性的微生物源天然防腐劑，采用原生質體融合技術，以Lactobacillus paracasei HD1-7和Streptomyces albulus 1-25為親株選育優良菌株，研究了L.paracasei HD1-7和S.albulus 1-25原生質體制備與再生條件，通過表型、抑菌譜、抗藥性和總DNA含量比較等手段篩選鑒定融合子，最終選育出3株以L.paracasei HD1-7為受體、獲得來自S.albulus1-25的抑酵母菌基因的融合子。

L.paracasei HD1-7，S.albulus1-25，天然防腐劑，原生質體制備，融合子鑒定

在談防腐劑色變的年代，天然食品防腐劑由于安全無毒，甚至有的對人體有保健作用而受到人們的廣泛關注［1-3］。在各種天然源的食品防腐劑開發過程中，人們把目光轉向微生物。通過微生物代謝生產天然防腐劑，由于周期短、基因改造易操作等優勢而成為天然防腐劑研究的主流方向［4-5］，具有廣闊開發的前景。S.albulus 1-25菌株代謝產生ε-polylysine，ε-PL具有抑菌譜廣（對G+和G-細菌、真菌均有抑菌效果）、水溶性好、安全性高、熱穩定性好、抑菌 pH范圍廣、應用范圍廣等特點［6-7］。但S.albulus 1-25菌株產生的ε-PL存在分子量大、抑菌效果稍弱的缺點，生長速度慢，產酸少，培養過程中易染菌。因此，進行菌株的改造是必然之勢。具有自主知識產權的L.paracasei HD1-7菌株產生的副干酪乳桿菌素具有在酸性條件下對大多數的 G+和G-細菌有很好的抑菌效果，菌株生長周期短，產酸多，生長競爭力強等優點。但副干酪乳桿菌素存在于中性及堿性條件下不抑菌、對真菌無抑制能力等缺點［8-10］。也就是說，2株菌在培養和產物特性的方面具有很好的互補性。原生質體融合技術可在不知道雙親株遺傳背景的情況下，實現雙親基因組融合、DNA交換、重組并產生新性狀。原生質體融合技術具有廣泛適應性和隨機性，可實現常規雜交方法無法做到的種間、屬間、門間甚至跨界的遠緣雜交，并可以大幅度提高親本之間的重組頻率，集中雙親株優良性狀的機會更大［11-13］。因此，本課題采用L.paracasei HD1-7與S.albulus 1-25原生質體融合育種方法，是選育優良天然防腐劑產生菌株的理想策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

親本菌株L.paracasei HD1-7 黑龍江大學微生物重點實驗室分離，對潮霉素的最高耐藥濃度為5000μg/mL，對卡那霉素的最高耐藥濃度為10μg/mL；S.albulus 1-25 黑龍江大學微生物重點實驗室保藏，對潮霉素（Hym）的最高耐藥濃度為10μg/mL，對卡那霉素（Km）的最高耐藥濃度為100μg/mL；指示菌株 Bacillus subtilis、Escherichia.coli、Saccharomyces cerevisiae 本院微生物重點實驗室保存；Staphylococcus aureus、Micrococcus flavus 黑龍江省微生物研究所提供；Bacillus megaterium、Listeria sp.、Salmonella sp.、Proteus vulgaris、Shigella sp.、Bacillus cereus 哈醫大二院贈送；培養基 M6培養基［14］，酵母膏-麥芽粉培養基［15］，S培養基［16］，種子培養基［6］；L.paracasei HD1-7再生培養基 a.再生培養基1-改良M6培養基，在M6培養基的基礎上加入2.5%明膠，蔗糖0.5mol/L，5mL 2%的無菌牛血清白蛋白；b.再生培養基2-乳酸菌原生質體再生固體培養基［12］；c.再生培養基3-改良MRS再生培養基［12］；溶菌酶（lysozyme） 上海藍季科技發展有限公司；Marker-DL-2000（Cat#MD 114）、2×Taq PCR MasterMix（Cat#KT-201） TIANGEN公司；P緩沖溶液［17］，HM液［18］。

1.2 實驗方法

1.2.1 L.paracasei HD1-7原生質體的制備與再生L.paracasei HD1-7菌株在M6液體培養基中，37℃培養20h，4000r/min離心10min，棄上清液收集菌體后，用 HM液洗滌2次，再用 HM液稀釋制成108cfu/mL菌懸液。加入溶菌酶，在適宜的溫度條件下水浴酶解，用平皿裂解法［21］統計原生質體的制備率；采用雙層平板法［21］再生原生質體。

原生質體制備率（%）=（酶解前的菌落數-酶解后的菌落數）/酶解前的菌落數×100%

再生率（%）=［從平皿上算得的總菌數-總菌數×（1-制備率）］/（總菌數×制備率）×100%

1.2.2 S.albulus 1-25原生質體的制備 從S.albulus斜面上刮取全部孢子，用無菌水制成粗制孢子懸液，激烈振蕩后用塞有脫脂棉的一次性注射器過濾到無菌離心管中，6000r/min離心10min，使孢子沉淀，棄上清，加入4mL無菌水輕微振蕩后，取2mL孢子懸液接種于50mL種子培養基中，30℃振蕩培養48h。

以10%的接種量將種子液接入到25mL添加10.3%蔗糖的S培養基中，30℃振蕩培養。培養液6000r/min離心10min，收集S.albulus 1-25菌絲體，并用15mL蔗糖溶液洗滌沉淀2次，將菌絲體懸于4mL溶菌酶溶液中，水浴酶解，吹吸，保溫15min，補加5mL P緩沖液，用差速離心法（3500r/min，7min；6000r/min，10min）除去未酶解的菌絲體，收集原生質體。血球計數計算原生質體形成量。

1.2.3 L.paracasei HD 1-7與S.albulus 1-25的原生質體融合 取雙親株原生質體各1mL混合，加入2mL 50%的PEG（MW2000）溶液，20℃水浴3min，取出6500r/min離心10min，HM液離心洗滌2次，用HM液稀釋10-4～10-6，涂于改良的M6平板上，37℃培養，計算原生質體融合率。

原生質體融合率（%）=（再生平皿上的總菌落數-雙親裂解剩余菌落數）/［單方（較少方）原生質體再生數］×100%

1.2.4 融合子的篩選與鑒定 將再生菌落用無菌牙簽依次點接到分別含有50μg/mL的卡那霉素、潮霉素、卡那霉素和潮霉素及無抗生素的M6培養基上，在兩種抗生素選擇性培養基上都能生長或都不能生長的菌落可初步判斷為融合子。將獲得的融合子連續傳代10次，再檢測其抗藥性的穩定性。

以親株L.paracasei HD1-7作對照，采用雙層平板法［8］檢測融合子對 B.subtilis、S.aureus、M.flavus、E.coli、 S.cerevisiae、 L.plantarum、 S. albulus、 B. megaterium、Listeria sp.、Salmonella sp.、P.vulgaris、Shigella sp.、B.brevis的抑菌能力；以B.subtilis為指示菌，檢測融合子在pH在3、5、7條件下的抑菌效果。

提取S.albulus 1-25、L.paracasei HD1-7及融合子R1、R2、R3的總DNA進行電泳檢測［19-20］，比較其DNA總量，鑒定是否為融合子。

2 結果與討論

2.1 L.paracasei HD1-7原生質體制備與再生條件的確定

2.1.1 酶解溫度對原生質體制備的影響 酶解溫度可直接影響到酶促反應的速率和原生質體化的程度，因為它直接關系到溶菌酶的解離基團的狀態和活性基團的作用。如圖1所示，30℃和37℃條件下原生質體的制備率均較高，但37℃時再生率更高，為25.9%，因此確定37℃為最佳酶解溫度。

圖1 酶解溫度對L.paracasei HD1-7原生質體制備和再生的影響

2.1.2 酶濃度對原生質體制備的影響 原生質體形成率在一定范圍內與溶菌酶的濃度成正比。但溶菌酶濃度過高，雖然原生質體形成率高，而由于溶菌酶中往往含有一些對原生質體有害的酶類（如過氧化物酶、核糖核酸酶等），因此，當達到一定濃度時，必然會嚴重地影響原生質體的活性；而且酶量過大會使細菌脫壁太徹底，失去了原生質體再生時合成細胞壁的引物，易使菌體凝集，降低原生質體的再生率；溶菌酶濃度低，則原生質體形成率低，影響融合［21-23］。從圖2可以看出，隨著溶菌酶濃度的增加，原生質體形成率不斷提高，但再生率卻隨著酶濃度的增加依次下降，當溶菌酶濃度為2mg/mL時再生率最高，為22.7%，因此確定2mg/mL為最佳酶濃度。

2.1.3 酶解時間對原生質體制備的影響 圖3表明，酶解時間越長，原生質體制備率越高，而再生率越低。酶解1～5h時的制備率從68.1%、69.5%升高到72.95%，再生率從21.5%、23.2%降低到9.2%。原因

同溶菌酶濃度過高一樣，降低了原生質體的活性，因此確定酶解時間為3h。

圖2 酶的濃度對L.paracasei HD1-7原生質體制備和再生的影響

圖3 酶解時間對L.paracasei HD1-7原生質體制備和再生的影響

2.1.4 再生培養基對原生質體再生的影響 再生培養基是原生質體進行再生過程的最重要的外界環境因素之一，它對原生質體既有維系保護的作用，又有支持的功效和營養功能，它直接關系到再生率的高低。如圖4所示，再生培養基1-改良M6培養基的再生率最高達28%。明膠和牛血清白蛋白的作用是既可起到對原生質體保護劑的作用，同時也可以起到原生質體擴張劑的作用，刺激原生質體的再生過程，因此在L.paracasei HD1-7生長良好的M6培養基的基礎上，加上明膠、牛血清白蛋白和0.5mol/L蔗糖創造的高滲環境，很適宜原生質體再生。

圖4 不同再生培養基對L.paracasei HD1-7原生質體再生的影響

2.1.5 再生溫度對原生質體再生的影響 再生溫度對再生率的影響效果與原來培養細胞時的溫度有關，一般認為最佳的再生溫度低于菌體適宜培養溫度。從圖5可以看出，35℃條件下的再生率最高達43.7%，因此確定35℃為最佳再生溫度。

經以上各條件摸索，確定L.paracasei HD1-7的最佳原生質體條件為：37℃酶解、溶菌酶濃度為2mg/mL、酶解時間為3h、改良M6培養基為再生培養基、35℃再生，在此條件下可使原生質體的制備率達70%以上，再生率達40%以上。

2.2 S.albulus 1-25原生質體制備條件的確定

圖5 再生溫度對L.paracasei HD1-7原生質體再生的影響

2.2.1 S.albulus 1-25的生長曲線 由圖6可知，S.albulus 1-25菌株在0～12h為延遲生長期，12～36h為對數生長期，36～60h為穩定生長期，培養64h后進入衰退期。

圖6 S.albulus 1-25菌株的生長曲線

2.2.2 菌齡對原生質體制備的影響 一般認為菌體生長至對數生長期后期制備原生質體最適宜，菌齡對S.albulus 1-25原生質體形成量的影響見圖7，培養40h時，形成的原生質體最多，為4.675×107cfu/mL。因此，確定最佳菌齡為40h，即為穩定生長期的初期。

圖7 菌齡對S.albulus 1-25原生質體形成量的影響

2.2.3 甘氨酸對原生質體制備的影響 放線菌在加入甘氨酸的培養基中培養后，易于使細胞壁的網狀結構松動，釋放原生質體。甘氨酸對S.albulus 1-25原生質體形成量的影響見圖8，隨著加入甘氨酸量的增多，原生質體形成量不斷增多，直至添加量為2.0%時，達到最高值5.275×107cfu/mL。添加甘氨酸后，發酵液的狀態也有所改變，菌絲結塊、掛壁現象減少，菌絲分散更加均勻。

圖8 甘氨酸添加量對S.albulus 1-25原生質體形成量的影響

2.2.4 酶解溫度對原生質體制備的影響 不同的酶具有各自不同的最適溫度，同時還要注意菌株生長的最適溫度，以避免因溫度不當而導致原生質體活性降低，甚至破壞，因此確定酶解溫度通常要二者兼顧，這對水解細胞壁是至關重要的。酶解溫度對S. albulus 1-25原生質體形成量的影響見圖9，35℃酶解時原生質體形成率最高，為4.975×107cfu/mL，因此確定為最佳酶解溫度。

圖9 酶解溫度對S.albulus 1-25原生質體形成量的影響

2.2.5 酶濃度對原生質體制備的影響 原生質體制備時，酶的濃度要適當。酶量過低，作用不徹底，不利于原生質體形成；濃度過高，又會影響原生質體數量和活性，致使再生頻率下降。酶濃度對S.albulus 1-25原生質體形成量的影響見圖10，可看出隨酶濃度增加，原生質體形成量不斷增加，酶濃度達到2.0mg/mL后，原生質體形成量不再增加，為1.34×108cfu/mL，因此確定最佳酶濃度為2.0mg/mL。

圖10 酶濃度對S.albulus 1-25原生質體形成量的影響

2.2.6 酶解時間對原生質體制備的影響 充足的酶解時間是細菌原生質體化的必要條件，原生質體形成率隨酶解時間延長而增加，但再生率會由于隨酶解時間過長導致細胞壁脫壁徹底無法再生而降低。酶解時間對S.albulus 1-25原生質體形成量的影響見圖11，酶解180min后，原生質體的數量大大增加，達到1.74×108cfu/mL。為避免酶解時間過長，對原生質體破壞過度，影響融合，確定酶解時間為180min。

圖11 酶解時間對S.albulus 1-25原生質體形成量的影響

經以上各條件摸索，確定最佳酶解條件：菌齡為40h，甘氨酸添加量為2.0%，酶解溫度為35℃，酶解時間為 180min，溶菌酶濃度為 2.0mg/mL，可使S.albulus 1-25原生質體形成量達1.7×108cfu/mL。

2.3 融合子的篩選及鑒定

檢出和鑒別融合重組體細胞的主要依據是親本的遺傳標記，同時還要結合DNA的含量和孢子形態等遺傳學和形態學方面特性加以確定。本課題結合了親本抗藥性標記、菌體形態、菌落形態、DNA含量、穩定性等方面對融合子進行了鑒定，以確保獲得的融合子為穩定遺傳的目的重組子。

2.3.1 融合子的篩選 本實驗的目的是只篩選L.paracasei HD1-7作為受體的融合子。由于L.paracasei HD1-7和S.albulus 1-25的菌體形態、菌落形態相差懸殊，因此非常容易區分L.paracasei HD1 -7作為受體的再生菌落。而且改良的M6雙層再生平板及37℃再生培養溫度等均是L.paracasei HD1-7作為受體的融合子的最佳再生條件，S.albulus 1-25作為受體的融合子生長會很緩慢，一般在培養3d后才出現。因此，篩選時只選擇前3d出現的菌落形態類似L.paracasei HD1-7的菌株進行鑒定。

抗藥性標記篩選結果見表1，先后對12478個再生菌落進行抗藥性標記的篩選，獲得帶有雙標記的融合子465個，融合率為3.7%，經10代抗藥性穩定性檢測，有65個重組體能夠保持雙標記抗生素抗性，占初篩融合子的1.4%，融合率為0.52%。

表1 融合子篩選結果

2.3.2 融合子的抑菌能力 首先以B.subtilis（G+細菌）、E.coli（G-細菌）和S.cerevisiae（真菌）為指示菌對穩定的重組體進行抑菌能力測定，結果有3個重組體（命名為R1、R2、R3）從親株S.albulus 1-25獲得了對酵母菌的抑菌基因，使其抑菌范圍擴寬。這3株融合子對其他指示菌的抑菌效果見表2，由表可知R3對多個菌株的抑菌能力均超過了親株。抑菌最適pH實驗結果（圖12）表明，3株融合子在中性條件下仍不具抑菌活性。

2.3.3 融合子與親株的形態學特征比較 融合子與親株的形態學見表3，結果表明融合子在表型上均發生了變化，菌體和菌落面積均變大。

2.3.4 總DNA含量比較進一步鑒定融合子 提取S.albulus 1-25、L.paracasei HD1-7、融合子R1、R2、R3的總DNA，計算得到A260/A280值均在1.8±0.2范圍內，純度達到標準。由表4可看出，融合子R1、R2、R3的A260值大于雙親株的A260值，而又介于雙親株的A260值和之間，說明融合子R1、R2、R3的DNA總量較親株增多，確實發生了融合，是重組體。

由電泳圖13可觀察到，融合子總DNA的亮度遠遠大于親株L.paracasei HD1-7總DNA，也說明了融合子R1、R2、R3的DNA總量較親株增多，進一步證明了R1，R2，R3為融合子。

3 結論

選用溶菌酶濃度為2mg/mL，酶解溫度為37℃，酶解時間3h，使L.paracasei HD1-7原生質體產量最高，制備率達70%以上；再生培養基為改良的M6培養基，再生溫度37℃，此時再生率達40%以上。采用S.albulus 1-25穩定生長初期的菌絲，添加量2.0%的甘氨酸，溶菌酶濃度2.0mg/mL，酶解溫度35℃，酶解時間 180min，使原生質體形成達到最高 1.74× 108cfu/mL。兩親株都隨著酶濃度、酶解溫度和時間的增加，原生質體形成率不斷提高，但原生質體再生率升高到一定程度會下降。

重組子R1、R2、R3具有雙親株的優良性狀，獲得了來自S.albulus 1-25的抑酵母菌基因，使其抑菌范圍擴寬，且為遺傳穩定性菌株。

表2 重組體對各指示菌的抑菌效果

表3 融合子與雙親株的形態學特征比較

表4 雙親株和融合子總DNA紫外檢測結果

圖12 重組體在pH為3、5、7條件下的抑菌效果（B.subtilis）

圖13 重組體總DNA的電泳圖

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LEI Hong，ZHANG Tie-dan，JIN Zhong-bin，ZHUANG Hai-ji，HE Xin，ZHANG Ji-liang，PING Wen-xiang*，ZHOU Dong-po*
（Key Laboratory of Microbial，College of Life Science，Heilongjiang University，Harbin 150080，China）

ln order to obtain microbial preservative with excellent applicability，L.paracasei HD1-7 and S.albulus 1-25 were used as parents to construct strains through protoplast fusion technique.Optimal protoplast fusion conditions were systematically investigated.Through phenotype characteristic，antibacterial spectrum，drug resistance property and DNA content，3 optimal fusants were identified.The fusants had the gene of inhibiting yeast from S.albulus 1-25.

L.paracasei HD1-7；S.albulus 1-25；biopreservative；protoplast fusion；fusant identification

TS202.3

A

1002-0306（2011）01-0146-06

2010-02-04 *通訊聯系人

雷虹（1971-），女，博士，副教授，碩導，研究方向：食品微生物。

黑龍江省科技廳重大攻關項目（GA07B401）；黑龍江省科技廳重大攻關項目（GB05B401）；哈爾濱市科技局科技攻關項目（2009AA3CN079）；黑龍江省科技廳青年基金項目（QC03C24）。