葡萄糖/葡萄糖氧化酶抗菌紙及抗菌性研究

虢 杰，楊仁黨，*，李雪云

（1.華南理工大學制漿造紙國家重點實驗室，廣東廣州510640；2.廣東省造紙技術與裝備公共實驗室，廣東廣州510640）

葡萄糖/葡萄糖氧化酶抗菌紙及抗菌性研究

虢 杰1，2，楊仁黨1，2，*，李雪云1，2

（1.華南理工大學制漿造紙國家重點實驗室，廣東廣州510640；2.廣東省造紙技術與裝備公共實驗室，廣東廣州510640）

葡萄糖氧化酶是氧化葡萄糖的專一催化酶，具有脫氧、殺菌的功能。通過定性和定量抗菌實驗方法研究了葡萄糖/葡萄糖氧化酶體系在以淀粉作為載體和不混合淀粉時施涂于紙張表面的抗菌效果。定性抗菌實驗表明，葡萄糖/葡萄糖氧化酶抗菌紙具有良好的抗菌效果。而定量檢測結果表明，pH等于5.5時，35℃反應10min，不添加淀粉時，葡萄糖氧化酶最小的抑菌濃度約為70U/m2，葡萄糖足量時，酶用量越高，抗菌率越好；添加0.7g/m2淀粉后，最小抑菌濃度提高到約650U/m2。淀粉對葡萄糖/葡萄糖氧化酶體系的抗菌效果有較大影響，主要原因是淀粉能夠促進細菌的繁殖。

葡萄糖/葡萄糖氧化酶，抗菌紙，抗菌性，定性與定量抗菌實驗

抗菌紙是各種具有抑制危害紙品微生物能力的功能性紙張的統稱［1］，其抗菌效果來源于抗菌劑。一般來講，抗菌劑在低濃度時只有抑菌作用，而濃度增大或作用時間延長時，可起到殺菌作用［2］?？咕堄糜谑称钒b時，可以使被包裝的食品、果蔬等延長保質期而不變質。也就是說，食品用抗菌包裝紙基本功能是：防止微生物的污染和昆蟲的侵入，保護商品在生產和銷售過程中不變質［3-4］。目前，超市里的生鮮食品，為了保持新鮮，延遲變質時間，通常添加一些化學物質或采用特殊的包裝技術來延長貨架期，如添加二氧化氯做為保鮮劑，采用真空預處理和氣調包裝技術都能達到較好的延長貨架期的目的［5-9］。但這些常規方法也存在不足的地方，有些生產成本較高，有些保鮮效果一般，貨架存放時間較短，影響產品的經濟性。葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶，能專一地將β-D-葡萄糖（Glucose）氧化成為葡萄糖酸和過氧化氫，在食品保鮮、醫藥檢測等許多方面得到廣泛的應用［10-12］，其化學反應機理如下：

此外，Mattila Tiina和M.Sandholm［13］的研究結果顯示，葡萄糖/葡萄糖氧化酶的組合具有明顯的細菌生長抑制作用。盡管在生鮮產品如牛肉、雞等表面噴灑葡萄糖氧化酶能起到抑菌、抗菌效果，延長產品的貨架時間，但工藝要求嚴格，質量難以保證。本文將葡萄糖/葡萄糖氧化酶施涂于紙張表面，并探討其抗菌性，為開發生鮮產品抗菌保鮮包裝紙提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

β-D-葡萄糖（Glucose） 分析純；葡萄糖氧化酶（GOD） 活性245U/mg，sigma公司產品，購自廣州杰順生物科技有限公司；玉米原淀粉 水分90%；實驗菌 大腸桿菌（Enterobacter cloacae）；培養基0.5%氯化鈉，0.5%牛肉膏，1.5%蛋白胨，1%瓊脂粉加去離子水配制而成；肉湯培養基 將所有成分溶于去離子水中，定容至1000mL，調節pH為7.2～7.4，121℃下高壓滅菌20min取出，置于無菌室保存待用；瓊脂肉湯培養基 步驟同上，在無菌室中操作，將滅完菌后的瓊脂肉湯培養基溶液倒入滅菌平皿制成平皿培養基，培養基冷卻凝固后翻轉放置，1d后觀察是否有雜菌，如果沒有則可放于無菌室待用。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗菌紙制備 將去離子水配好的Glucose溶液、GOD溶液和糊化淀粉溶液在pH5.5和35℃恒溫下反應預定時間后，全部施涂于直徑9cm的過濾紙表面上，用刮棒刮平，使液體均勻吸收且不流出來，放入干凈托盤中，在30℃真空干燥箱干燥一夜。

1.2.2 菌液制備 采用美國AATCC 100兩步法［14］在37℃下活化菌種，制取所需濃度的菌液。

1.2.3 細菌培養與檢測

1.2.3.1 抑菌環實驗法定性檢測［15-16］用接種環將大腸桿菌菌液接種到制備好的培養基上并涂勻，覆蓋上事先剪好的圓形紙片，將培養皿倒置在37℃的培養箱中培養19h取出，根據抑菌環的大小來測定抗菌性能。

1.2.3.2 吸收法定量檢測［14，16］將抗菌紙和對照樣紙片放入三角燒瓶中后吸收定量的菌液，37℃下恒溫培養20±2h，或者不培養固定時間直接用肉湯培養基溶液把紙片上的細菌洗滌下來，稀釋適當濃度后接種到平皿培養基上，然后倒置在37℃的培養箱中培養19h取出，進行計數。計算公式為：

細菌減少百分率（抗菌率）（%）=（“0”接觸時間試樣上細菌數-定期培養試樣上細菌數）/“0”接觸時間試樣上細菌數×100%

或細菌減少百分率（%）=（“0”接觸時間對照樣上細菌數-定期培養試樣上細菌數）/“0”接觸時間對照樣上細菌數×100%

或細菌減少百分率（%）=［（“0”接觸時間試樣上細菌數+“0”接觸時間對照樣上細菌數）/2-定期培養試樣上細菌數］/［（“0”接觸時間試樣上細菌數+“0”接觸時間對照樣上細菌數）/2?×100%

如果“0”接觸時間試樣上的細菌數和“0”接觸時間對照樣上的細菌數差別較大時，取較大值；如果兩者差別不大時，取平均值。

2 結果與討論

2.1 抑菌環法定性抗菌效果

取葡萄糖用量3500、21000μmol/m2絕干紙，葡萄糖氧化酶用量3500、7000、21000U/m2（如表1中實驗號1～6所示），pH 5.5，35℃下反應10min后施涂于濾紙上，用抑菌環法定性檢測抗菌效果。

表1 不同比例葡萄糖/GOD/淀粉組合的抗菌效果

從表1看出，濾紙面積3.14cm2，1、3、5號抑菌環面積分別為7.61、4.90、2.17cm2，抗菌、抑菌效果很明顯，其葡萄糖用量為3.78g/m2，葡萄糖氧化酶用量分別為21000、7000、3500U/m2。因為葡萄糖氧化酶作為催化劑，其用量決定催化能力，從而影響生成產物量和抗菌效果；而葡萄糖用量0.63g/m2時，無論葡萄糖氧化酶用量是3500U/m2或是21000U/m2，都沒有明顯的抑菌環出現。

同樣取葡萄糖用量21000μmol/m2，葡萄糖氧化酶用量如表1中實驗號7～9所示，淀粉用量0.7g/m2。與1、3、5號對比，相同的葡萄糖和葡萄糖氧化酶用量時，7、8、9號的抑菌環面積都相對較小，抗菌效果不如未添加淀粉的明顯，加入淀粉載體后大大降低了抗菌效果。

2.2 葡萄糖/葡萄糖氧化酶的抗菌性定量分析

為了對葡萄糖/葡萄糖氧化酶的抗菌效果進行更準確的數據分析，采用定量吸收法檢測。首先優化葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的反應時間，實驗中取葡萄糖用量350μmol/m2，葡萄糖氧化酶用量350U/m2，反應時間和抗菌率見表2。催化反應1min，抗菌紙的抗菌率為3.4%，反應5min為23.2%，比反應1min的效果有很大提高，這說明1min的反應很不完全；反應10min時抗菌率也比反應5min的效果有明顯提高。對于以下實驗，反應時間選擇10min。

表2 不同GOD/葡萄糖催化反應時間的抗菌率

2.2.1 葡萄糖與抗菌率的關系 圖1表示葡萄糖氧化酶用量350U/m2時，葡萄糖用量與抗菌率的關系?？咕孰S著葡萄糖用量的增加而提高，葡萄糖用量低于150μmol/m2，對細菌沒有抗菌效果，葡萄糖用量840μmol/m2，抗菌率達到80%。葡萄糖是反應物，其用量直接影響生成物的量。繼續增加葡萄糖用量，抗菌率沒有明顯提高。由于酶用量的限制，即使繼續增加葡萄糖用量，抗菌率也基本保持不變。一定的酶濃度時，葡萄糖濃度在一定范圍內，對抗菌率有很大的影響。

圖1 葡萄糖用量對抗菌效果的影響

2.2.2 葡萄糖氧化酶與抗菌率的關系 用固定的過量葡萄糖，檢測葡萄糖氧化酶對抗菌效果的影響（圖2）。葡萄糖用量2800μmol/m2，葡萄糖氧化酶用量很低時，抗菌率隨著葡萄糖氧化酶用量的增加快速上升。當葡萄糖氧化酶濃度大于70U/m2時，檢測結果顯示大腸桿菌的生長受到抑制，在抗菌紙上培養20h后，大腸桿菌的數目比未培養20h的對照樣上的細菌數目減少，此時的酶濃度可以認為是最小抑菌濃度（MIC）。當酶用量達到350U/m2，抗菌率達到84%，酶用量550U/m2時，抗菌率91%，之后抗菌率雖然隨著酶用量的增加繼續提高，但增速與前面的相比明顯減慢。

圖2 葡萄糖氧化酶用量對抗菌效果的影響

2.2.3 淀粉對抗菌效果的影響 淀粉是目前常用的表面施膠劑，可以利用淀粉作為載體把葡萄糖/葡萄糖氧化酶施涂到紙基表面。實驗中，葡萄糖用量與葡萄糖氧化酶用量比為2∶1，溶液在相同的溫度和pH條件下反應10min后，與糊化淀粉溶液混合均勻施涂到濾紙表面，抗菌率如圖3所示。

葡萄糖氧化酶用量700U/m2時，未添加淀粉的抗菌紙抗菌率為95%，添加0.7g/m2淀粉后抗菌紙的抗菌率只有2%，淀粉施膠劑對葡萄糖/葡萄糖氧化酶體系的抗菌性能有很大影響。最小抑菌濃度也有明顯變化，未添加淀粉時為70U/m2，添加0.7g/m2淀粉時提高到650U/m2。從曲線可以看出，用淀粉作為載體，繼續增加葡萄糖和葡萄糖氧化酶用量可以提高抗菌效果。但是，由于淀粉是細菌生長的營養物，會促進細菌的生產，從而會影響抗菌紙的抗菌效果，這與抑菌環定性分析結果相符。

圖3 淀粉用量對抗菌效果的影響

3 結論

定性和定量抗菌實驗表明，葡萄糖/葡萄糖氧化酶抗菌紙具有良好的抗菌性能。當pH為5.5，35℃下催化反應10min時，反應較充分，抗菌效果與葡萄糖、葡萄糖氧化酶和淀粉施載體用量有關。

葡萄糖氧化酶濃度一定時，葡萄糖濃度在一定范圍內，對抗菌率有很大的影響，超過此范圍，抗菌率基本保持不變。葡萄糖用量充分時，抗菌率隨著葡萄糖氧化酶用量的增加而提高，酶用量550U/m2時，無淀粉施涂的抗菌紙抗菌率可超過90%。

不添加淀粉時，葡萄糖氧化酶最小抑菌濃度約為70U/m2；用0.7g/m2淀粉施膠后，最小抑菌濃度提高到約650U/m2，淀粉對葡萄糖/葡萄糖氧化酶體系的抗菌效果有較大的影響。添加淀粉后，葡萄糖/葡萄糖氧化酶體系的抗菌效果變差，主要原因是淀粉促進了細菌的生長，因此今后可以選用其它的不會促進細菌繁殖的合成化合物如聚乙烯醇作為載體等進行研究。

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Study on glucose/glucose oxidase antibacterial paper and its antimicrobial property

GUO Jie1，2，YANG Ren-dang1，2，*，LI Xue-yun1，2
（1.State Key Laboratory of Pulpamp;Papermaking Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；2.Guangdong Public Laboratory of Process Technology and Equipment Team，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

Glucose oxidase is specific for β-D-glucose，and of oxygen removal and antibacterial functions. Antimicrobial effects of paper coated via glucose/glucose oxidase with/without starch were investigated by means of qualitative and quantitative assay.Qualitative assay phenomenon showed that glucose/enzyme paper was capable of inhibiting bacteria growth to betterextent.The experimentalresults from quantitative assay demonstrated that minimal inhibition concentration（MlC）was about 70U per square meter under the conditions of pH 5.5，35 centigrade，10 minutes reaction time，and without starch.And that if the dosage level of enzyme rises with saturation of glucose，the germproof effects could be more remarkable.However，MlC was up to round 650U per square meter with 0.7 gram per square meter starch addition.The starch hereby imposed a significant negative effect on the antibacterial properties of glucose/enzyme paper.This owes to starch nutriment contributing to bacteria growth.

glucose/glucose oxidase；antibacterial paper；antimicrobial property；qualitative and quantitative assay

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0124-04

2009-12-25 *通訊聯系人

虢杰（1985-），男，碩士研究生，主要從事造紙技術與特種紙方面的研究。