多酚類單體物質抗氧化活性的研究

王 俏，鄒 陽，鐘 耕，2，*，羅金華

（1.西南大學食品科學學院，重慶400716；2.西南大學食品科學學院實驗教學示范中心，重慶400716；3.重慶市生物技術研究所，重慶401123）

多酚類單體物質抗氧化活性的研究

王 俏1，鄒 陽1，鐘 耕1，2，*，羅金華3

（1.西南大學食品科學學院，重慶400716；2.西南大學食品科學學院實驗教學示范中心，重慶400716；3.重慶市生物技術研究所，重慶401123）

以抗壞血酸作為對照，采用鄰苯三酚自氧化法，鄰二氮菲-Fe2+法和DPPH法評價了茶多酚（兒茶素80.9%）、蘆丁-NF11、黃岑甙、柚皮甙四種多酚類黃酮清除自由基的能力和對油脂的抗氧化能力，并簡述了多酚單體抗氧化活性的強弱與其結構的關系。結果顯示：在清除超氧陰離子自由基（-·）和清除羥基自由基（·OH）能力上，茶多酚、蘆丁的作用都強于黃岑甙與柚皮甙；在清除DPPH自由基方面，茶多酚、蘆丁、黃岑甙作用較明顯，都超過了60%，而柚皮甙的清除率最弱；在抗油脂自動氧化能力方面，蘆丁作用最強，黃岑甙最弱。多酚單體的抗氧化活性主要取決于其B環上的鄰二羥基結構。

多酚單體，抗氧化能力，自由基

多酚類化合物是指其分子結構中有若干酚性羥基的植物成分的總稱，多酚可分為兩類，一類是多酚的單體，即非聚合物，包括各種黃酮類化合物、綠原酸類、沒食子酸和鞣花酸，也包括一些接有糖苷基的復合類多酚化合物；另一類則是由單體聚合而成的低聚或多聚體，統稱單寧類物質，包括縮合單寧中的原花色素和加水分解型單寧中的沒食子單寧和鞣花單寧等［1］。多酚類化合物由于具有良好的清除自由基的能力，而作為抗氧化劑被廣泛應用于食品和醫學領域，近十幾年來對這類化合物的研究一直是抗氧化劑研究領域的熱點［2-4］。生物體內自由基主要包括超氧陰離子自由基（·）、羥自由基（·OH）、分子氧（O2）、單線態氧（1O2）、過氧化氫（H2O2）以及脂質過氧化物（R、RO、RO、ROH）等，其中，超氧陰離子自由基（·）在體內最先形成；·OH作用最強，攻擊力最強，毒性最大，而各種脂質過氧化自由基在體內發生鏈鎖反應（Chain Reaction）而持久存在，是導致衰老和許多疾病發生的直接原因［5-7］。國內外對多酚類物質抗氧化的研究較多，但以多種多酚混合體系的抗氧化研究居多，對多酚類物質單體的抗氧化性的研究以及多酚單體結構與抗氧化能力的關系也有一定的研究［8-10］。本文選用已知結構的多酚單體類黃酮物質茶多酚（兒茶素）、蘆丁-NF11、黃岑甙、柚皮甙等，并以抗壞血酸為對照，研究其對超氧陰離子、·OH自由基、DPPH自由基的清除能力，嘗試比較不同結構的多酚類單體物質對不同自由基的清除效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶多酚（兒茶素80.9%，質量分數，下同）、蘆丁-NF11（97.84%）、柚皮甙（98.33%）、黃岑甙（95.51%）購自成都超人植化開發有限公司，低溫、避光、隔氧存放；DPPH·（1，1-二苯基苦基苯肼） 成都科龍化工試劑廠；鄰苯三酚、鄰二氮菲、Tris、抗壞血酸、硫酸亞鐵、硫代硫酸鈉、碘化鉀、可溶性淀粉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸、過氧化氫、無水乙醇、甲醇、乙酸、三氯甲烷 除注明外，所用試劑均為分析純。

紫外可見分光光度計 成都廣普科學儀器有限公司；PHS-25型酸度計 成都方舟科技開發公司；分析天平 寧波萊?？萍加邢薰?；電熱恒溫水浴鍋 金壇市富化儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱上海?，攲嶒炘O備有限公司；臺式離心機 上海安寧科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 清除超氧陰離子自由基（O-2·）作用 取4.5mL 50mmol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖溶液，分別加入4.2mL不同濃度的樣品溶液，25℃保溫20min，再加入同樣預熱的0.3mL 3mmol/L的鄰苯三酚啟動反應，準確反應5min后，加入濃度為10mol/L的HCl溶液0.1mL終止反應，在波長325nm下測定吸光值A。同時設置空白對照（加入4.2mL的蒸餾水代替樣品溶液），再以相同濃度的VC作對比實驗，空白對照管以緩沖溶液調零，樣品管分別以10mmol/L HCl代替鄰苯三酚的不同濃度樣品液調零［11］。超氧陰離子清除率按下式計算：

1.2.2 清除·OH自由基作用 取1mL 0.75mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液于試管中，依次加入2mL 0.2mol/L的磷酸緩沖液（pH=7.4）和0.5mL蒸餾水，充分混勻，加入1mL新配制的0.75mmol/L硫酸亞鐵溶液，混勻后加入1mL新配制的0.01%的雙氧水，于37℃水浴加熱60min后，在536nm測吸光值 A損傷。樣品管以0.5mL樣品代替損傷管中的蒸餾水在536nm處測A樣品。未損傷管以1mL蒸餾水代替損傷管中雙氧水，操作方法同損傷管，可測得536nm未損傷管的吸光值A未損傷，以VC做對照［12］。

1.2.3 DPPH法測定抗氧化能力

1.2.3.1 溶液制備 準確稱取 20mg DPPH·，用95%乙醇定容于250mL容量瓶中，得到濃度為2× 10-4mol/L的DPPH·溶液，置于冰箱保存。

1.2.3.2 抗氧化活性測定 精確吸取不同濃度的樣品溶液3mL，分別與3mL 2×10-4mol/L的DPPH·溶液混合，搖勻后避光放置30min。以相對應的溶劑（2mL蒸餾水與2mL無水乙醇的混合溶液）為對照，用分光光度計分別測定上述溶液在517nm處的吸光度值（Ai），以相同濃度的VC溶液做對照。

精確吸取不同濃度的樣品溶液3mL，分別與3mL蒸餾水混合均勻后，以蒸餾水為對照，用分光光度計分別測定各混合液在波長517nm處的吸光度值（Aj），以相同濃度的VC溶液做對照。

精確吸取2×10-4mol/L的DPPH·溶液3mL，與水混合均勻后，以相對應的溶劑（2mL蒸餾水與2mL無水乙醇的混合溶液）為對照，用分光光度計測定上述溶液在517nm處的吸光度值（A0），將以上數據代入下列公式計算其清除率。

其中：Ai為多酚樣品溶液和VC溶液與等體積DPPH·溶液混合后在波長517nm處的吸光度值；Aj為多酚樣品溶液和VC溶液與等體積溶劑混合后在波長517nm處的吸光度值；A0為DPPH·溶液與等體積溶劑混合后在波長517nm處的吸光度值［13］。

1.2.4 抗油脂自動氧化能力的測定

1.2.4.1 過氧化值（POV）的測定 準確量取豬油2g，置于250mL碘量瓶中，加入30mL乙酸與三氯甲烷混合液（3∶2），使油脂完全溶解，然后加入1mL飽和碘化鉀溶液，立即加塞搖勻，在溫度15～25℃避光靜置5min，取出加入50mL水搖勻，用硫代硫酸鈉標準溶液進行滴定至淡黃色時，加入1%淀粉指示劑1mL，繼續滴定至藍色消失為止，同時作空白對比實驗［14］。POV（meq/kg）按下式計算：

式中：C-硫代硫酸鈉標準溶液的濃度，mol/L；V1-油樣消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積，mL；V0-空白消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積，mL；M-樣品質量，g。

1.2.4.2 對油脂的抗氧化作用 稱取已測定POV的豬油3份，每份20g，置于250mL的錐形瓶中，第1份加入3mL無水乙醇作為空白，第2份加入3mL 0.1% VC，第3份加入3mL 0.1% 多酚單體樣品，充分振搖后，置65±1℃恒溫干燥箱中，每隔2d取2.0g油樣用硫代硫酸鈉滴定法測定POV值。每次取樣后充分振搖錐形瓶，以混入足夠的空氣［15］。

1.2.5 數據處理 每個實驗重復三次，以平均值±標準差表示，方差分析采用DPS7.05統計軟件［16］。

2 結果與分析

2.1 多酚單體對超氧陰離子（O2-·）的清除作用

鄰苯三酚在堿性條件下迅速自氧化，自氧化過程中產生O2-·，O2-·又加速鄰苯三酚自氧化速率，同時產生有色中間物質，有色中間產物的積累在滯后30～45s與時間成良好的線性關系，一般維持4min，隨后減慢。有色中間產物在325nm有強烈的光吸收。由于自氧化的速率依賴于O2-·的濃度，消除O2-·則抑制自氧化反應，阻止中間產物的積累，從而評價受試物清除O2-·的能力。因此本實驗采用鄰苯三酚自氧化法測定，結果見表1。

表1 茶多酚、蘆丁、黃岑甙、柚皮甙和VC對O-2·的清除率（%）

表2 茶多酚、蘆丁、黃岑甙、柚皮甙和VC對·OH的清除率（%）

表3 茶多酚、蘆丁、黃岑甙、柚皮甙和VC對DPPH·的清除率（%）

由表1可知，多酚單體中茶多酚和蘆丁以及VC對超氧陰離子都具有較強的清除能力，清除率都超過了50%，且清除率隨多酚單體的濃度的增加而增大，黃岑甙與柚皮甙對超氧陰離子也具有一定的清除能力。在濃度相同的情況下，茶多酚和蘆丁清除能力強于黃岑甙和柚皮甙，且隨著濃度的加大，清除率差別越明顯（p＜0.01）。

在結構上，茶多酚、蘆丁、柚皮甙、黃岑甙的A環上都有羥基，在B環上，茶多酚、蘆丁、柚皮甙都有羥基，而且茶多酚與蘆丁都有鄰二羥基，柚皮甙有一個羥基，黃岑甙沒有羥基，而清除超氧陰離子（O-2·）的能力依次是茶多酚＞蘆?。捐制み埃军S岑甙。因此說明可能是多酚單體物質結構的B環上的羥基對清除超氧陰離子（O-2·）起著很重要的作用，而且B環上有鄰二羥基的多酚單體的抗氧化活性更強，C環上有3-OH的存在也會使多酚的抗氧化活性增強。

2.2 多酚單體對·OH的清除作用

·OH是活性氧中最活潑的氧自由基之一，它幾乎能與活細胞中任何分子發生反應，可介導機體組織脂質過氧化，蛋白質解聚、聚合，核酸斷裂和多糖裂解等生化過程，引發組織細胞病變而導致各種疾病發生和加速機體衰老。減少此類自由基，即可達到防衰老、防心血管疾病、抗癌的作用。多酚單體和VC對·OH的清除作用見表2。

由表2可知，茶多酚和蘆丁及VC都對·OH自由基具有較強的清除能力，在濃度為0.1mg/mL時，蘆丁的清除能力最強（p＜0.05），而茶多酚和VC的清除能力相當（p＞0.05），清除率隨多酚單體的濃度的增加而增大，茶多酚最強，蘆丁次之。茶多酚與蘆丁的清除能力強于VC、柚皮甙和黃岑甙，VC對·OH自由基的清除能力強于柚皮甙和黃岑甙，而柚皮甙稍強于黃岑甙。

在結構上，茶多酚、蘆丁的A環上都有兩個羥基，柚皮甙的A環上有一個羥基，有一個羥基接上了糖苷基，黃岑甙的A環上有兩個羥基，還有一個羥基也接上了糖苷基，在清除·OH自由基方面，茶多酚與蘆丁能力都比柚皮甙和黃岑甙強，柚皮甙與黃岑甙的能力相當，依次是茶多酚＞蘆?。捐制み埃军S岑甙。綜上說明，可能是多酚單體物質結構的A環上的羥基對清除·OH自由基起了重要的作用，而且羥基接上了糖苷基以后會降低多酚單體的抗氧化活性［17］。

2.3 多酚單體對DPPH·的清除作用

DPPH·是一種人工合成的穩定自由基，分子結構中含有3個苯環，1個N原子上有1個孤對電子，其乙醇溶液呈紫色，在517nm處有較強吸收，當DPPH溶液中加入能清除自由基（使DPPH·孤對電子被配對）的樣品時，溶液的517nm處的吸光度變小，吸光度變小的程度與自由基清除程度呈定量關系。因而測定試樣DPPH·清除率可用于簡便、準確地評價其抗氧化能力。

從表3可以看出，在相同濃度下，茶多酚、蘆丁和黃岑甙對DPPH·都具有較強的清除能力，隨著濃度的增加，多酚單體對DPPH·的清除率逐漸增大。在四種多酚單體中，茶多酚對DPPH·的清除率最高，柚皮甙對DPPH·的清除率最低，茶多酚、蘆丁、黃岑甙對DPPH·的清除作用都好于VC（p＜0.05）。

表4 茶多酚、蘆丁、黃岑甙、柚皮甙和VC對油脂的抗氧化作用（meq/kg）

清除DPPH·的能力依次是茶多酚＞蘆?。军S岑甙＞柚皮甙，從四種多酚單體的結構來看，茶多酚與蘆丁的B環上都有鄰二羥基結構，而且茶多酚的C環上有3-OH的存在，蘆丁、黃岑甙、柚皮甙的C環上沒有3-OH結構；而蘆丁、黃岑甙在C環的Δ2-3位置有雙鍵及C4有酮基，柚皮甙只有一個C4有酮基，說明多酚單體物質結構的C環上的3-OH結構可能對多酚單體清除DPPH·起了重要的作用，C環的Δ2-3位置有雙鍵及 C4有酮基對多酚單體清除DPPH·起了一定的作用［18］。

2.4 多酚單體對油脂的抗氧化作用

食用油脂由于含有不飽和脂肪酸，易與空氣中的氧氣發生氧化和分解反應，導致其褪色、褐變，其中維生素、必需脂肪酸等營養成分遭到破壞，不但影響食品風味，也降低了食用價值，甚至可引起食物中毒。如果在油脂中添加抗氧化劑，就可以大大減少油脂的氧化酸敗，提高保質期。本實驗以豬油為實驗材料，實驗結果見表4。

由表4可知，四種多酚單體的POV值均低于空白對照組的值，多酚單體具有明顯的抗氧化活性。四種多酚單體對豬油的抗氧化效果有一定的差異，其中蘆丁與柚皮甙對豬油的抗氧化效果（p＞0.05）好于茶多酚與黃岑甙（p＜0.05）；放置2d時，茶多酚與黃岑甙抑制豬油氧化的能力沒有顯著差異（p＞0.05）。四種多酚單體對豬油的抗氧化效果總體均好于VC，但黃岑甙在第8d的抗氧化效果與VC沒有極顯著差異（p＞0.05）。

多酚單體的基本化學結構骨架是由15個碳以A、B、C三個環合脂鏈形式組成的黃烷結構及其衍生物［1］，見圖1。

圖1 幾種多酚單體結構

有關多酚類化合物的結構和抗氧化活性關系的理論和實驗研究已有一些報導［19-20］，這些報導對這類化合物的構-效關系做出了一些解釋，由于環上取代基的性質和取代位置（尤其是羥基的取代模式）以及C環上C2-C3成鍵情況（單鍵或雙鍵）不同，因而它們表現出的抗氧化活性也有所差異。而且目前常用的抗氧化活性評價方法有很多，由于不同評價體系的反應原理和評價的側重點不同，不同體系的評價結果有時會存在較大差異，因此一種體系的評價結果往往不足以說明多酚類化合物的抗氧化活性強弱，所以采用多種不同體系進行綜合評價，來充分驗證多酚的抗氧化活性。

3 結論

3.1 在三種不同的清除自由基的方法中，四種多酚類黃酮都對自由基具有一定的清除能力，且清除率隨多酚單體濃度的增加而增大，茶多酚和蘆丁清除自由基的作用尤為明顯，說明茶多酚與蘆丁都具有較強的抗氧化能力。在抗油脂自氧化能力方面，四種多酚單體都具有一定的抗油脂自氧化能力，在一定程度上降低油脂POV隨時間延長而升高的程度。

3.2 多酚類化合物具有的抗氧化活性主要是通過酚羥基與自由基反應形成穩定的半醌式自由基結構，其抗氧化活性的強弱與羥基是否能形成穩定的自由基結構有關。在三種不同的清除自由基實驗中，茶多酚與蘆丁的清除自由基活性都是最高的，黃岑甙與柚皮甙的抗氧化活性比較低。在抑制豬油氧化的實驗中，黃岑甙的抑制能力最低，可能是由于黃岑甙的B環上沒有羥基。而茶多酚的抑制能力比蘆丁及柚皮甙都低，可能是其機理的不同造成的，有待進一步深入研究：

從四種多酚類黃酮類的結構來看，茶多酚有5個羥基，蘆丁有四個羥基，黃岑甙和柚皮甙有兩個羥基，可以說明多酚物質的抗氧化活性與羥基的數目有很大的關系。

茶多酚與蘆丁的B環上都有鄰二羥基結構，而且A環上也有兩個羥基，說明B環上的鄰二羥基結構及A環上的羥基對清除自由基起了主要的作用，C環的3-OH結構、C環的Δ2-3位置有雙鍵及C4有酮基也對多酚單體的抗氧化作用也起了一定的作用。

對于糖苷基來說，蘆丁的C環上的羥基也接上了糖苷基，但是與柚皮甙和黃岑甙在A環上有糖苷基比較起來，蘆丁的抗氧化活性比后兩者都強，可以說明糖苷基的存在雖然會降低多酚單體的抗氧化活性，但是與其存在的位置也有重要的關系，糖苷基在A環上的多酚單體比在C環上的活性更低。

3.3 多酚單體的結構對不同游離基的清除作用能力是有差異的，這種構效關系還需要進一步深入研究，以便更好地發揮抗氧化物質的效果。

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Study on the antioxidant activities of polyphenol monomer

WANG Qiao1，ZOU Yang1，ZHONG Geng1，2，*，LUO Jin-hua3
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400716，China；2.Experimental Teaching Demonstration Center of Food Science College，Southwest University，Chongqing 400716，China；3.Biotechnology Institute of Chongqing，Chongqing 401123，China）

The antioxidant activity of TP（80.9%Gatechin），rutin-NF11，baicalin，naringin was studied in vitro using three models of antioxidant including scavenging oxygen free radicals（·），hydroxyl free radicals（·OH），and DPPH·free radicals and the activity of inhibiting autoxidation in lard.The antioxidant activity of TP，rutin，baicalin，naringin was compared with VC，and the relationship between the capacity of antioxidation of polyphenol monomer and the structure group of the polyphenol monomer was also analyzed.The results showed that TP，rutin，baicalin had strong antioxidative activities on scavenging DPPH· free radicals，and the inhibition rate was higher than 60%.The TP and rutin had stronger antioxidation on scavenging oxygen free radicals（·）and hydroxyl free radicals（·OH）than baicalin and naringin.Rutin had stronger activity on inhibiting autoxidation in lard than those of TP，baicalin and naringin.The antioxidant activity of polyphenol monomer mainly depended on the O-dihydroxy on the benzene ring B.

polyphenol monomer；antioxidation；free radical

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0137-05

2010-01-06 *通訊聯系人

王俏（1987-），女，碩士研究生，從事現代食品加工理論與技術研究。

國家農業科技成果轉化資金項目（2009GB2F100311）；重慶市科技攻關項目（CSTC，2009AC5183）資助。