微生物β-D-葡萄糖苷酶對玫瑰香(MUSCAT)葡萄結合態香氣物質的影響

郭慧女，康文懷，徐 巖，喻曉蔚

（江南大學生物工程學院釀造科學與酶技術中心，教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇無錫214122）

微生物β-D-葡萄糖苷酶對玫瑰香(MUSCAT)葡萄結合態香氣物質的影響

郭慧女，康文懷，徐 巖*，喻曉蔚

（江南大學生物工程學院釀造科學與酶技術中心，教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇無錫214122）

β-D-葡萄糖苷酶是風味修飾中的關鍵酶，對葡萄酒香氣的提升具有十分重要的作用。利用篩選的產β-D-葡萄糖苷酶的黑曲霉、海藻曲霉、魯氏毛霉，結合固相微萃取、氣質聯用等技術，對β-D-葡萄糖苷酶促進玫瑰香葡萄結合態香氣的釋放進行了研究。研究結果表明，不同微生物來源的β-D-葡萄糖苷酶對糖苷類香氣物質的水解能力不同，產物也存在顯著差異，黑曲霉作用產生的香氣物質含量遠高于其他兩種菌株，其中萜烯類香氣物質最為豐富，占總香氣含量的85.91%。因此，來源于黑曲霉的β-D-葡萄糖苷酶對糖苷類風味物質的作用最顯著，可以改善葡萄酒的風味。

β-D-葡萄糖苷酶，玫瑰香葡萄，結合態香氣

葡萄酒的香氣主要來自于葡萄的揮發性化合物［1］。香氣化合物的重要組成部分是來自葡萄漿果的結合態糖苷類物質，此類結合態香氣成分，通過水解可釋放出香氣化合物或能產生香氣化合物前體物質［2］。葡萄果實中，除可被感知的游離態香氣外，還有以葡萄糖苷鍵形式存在的結合態香氣，如單萜烯基-β-D-葡萄糖苷，這些風味前體物的含量相對于揮發性的萜烯醇要豐富得多，這些物質本身無香味、不揮發［3］。糖苷類化合物通過酸解或酶解可以釋放揮發態化合物［4］，在葡萄酒釀造條件下，酸解發生緩慢，對溫度，pH等有嚴格要求，且會影響分解出的物質的性質及其香氣，不適于應用在葡萄酒釀造工業中［5］。而酶解則是一種更接近于自然、溫和的方法，極具商業化應用前景，因此一般采用酶解的方法來分解風味前體物［6］。β-D-葡萄糖苷酶是芳香成分水解作用最明顯的關鍵酶［7］，該酶與萜烯類前體有密切關系，結合態香氣物質在糖苷酶的作用下可釋放配糖基，產生游離態芳香成分，即產生大量濃郁的具有天然特征香氣的物質［8］。Barbagallo［1］等人對結合態香氣水解后產生的萜烯類化合物對果汁增香的作用做了詳細闡述。Pogorzelski［8］對酶水解果汁中糖苷鍵前體物質的重要性及其在葡萄酒中的應用前景做了闡述。Belancic［9］等人對來源于酵母的β-D-葡萄糖苷酶作用在麝香葡萄中萜烯類化合物香氣物質影響進行了研究。Cabaroglu［10］等人對來源于黑曲霉的β-D-葡萄糖苷酶作用于釀酒條件下水解糖苷類化合物的各種條件進行了報道研究。Arevalo-Villena［11］等人對β-D-葡萄糖苷酶對白葡萄酒中的增香作用做了詳細闡述。國內的研究尚停留在游離態，而結合態香氣比游離態香氣成分豐富得多［12］，但β-D-葡萄糖苷酶作用于葡萄結合態香氣的研究國內還未見報道。來源于自然界的β-D-葡萄糖苷酶存在著顯著的生物多樣性，而從各類微生物中分離得到的β-D-葡萄糖苷酶之間也呈現多樣性［13］，且不受季節氣候的影響，生產周期短，價格優廉。本實驗結合GC/MS對不同來源的β-D-葡萄糖苷酶作用結合態香氣物質后進行定性定量分析，為今后進一步研究β-D-葡萄糖苷酶對結合態香氣物質的影響和香氣形成機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄 采自國內山東地區自建葡萄園，樹齡五年以上，2009年8月于葡萄成熟期采收，其葡萄品種為濃香型玫瑰香葡萄（Muscat），隨機采摘2kg葡萄樣品于-20℃下保存備用；分離篩選菌株的葡萄和土壤樣品 采自山東煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司的葡萄基地，依照Flachner B的方法［14］，以對硝基苯-β -D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）為底物進行初篩，并利用搖瓶發酵，通過測定酶活進行復篩，共篩選出了3株產β-D-葡萄糖苷酶酶活力較高的菌株，經18S鑒定，分別為黑曲霉（Aspergillusniger）、海藻曲霉（Aspergillus phoenicis）、魯氏毛霉（Mucor rouxianus）；p-NPG、2-辛醇（純度＞99%） sigma公司；甲醇、戊烷 色譜純，TEDIA試劑公司。

紫外分光光度計 尤尼科上海儀器有限公司；固相萃取小柱（SPE） Waters公司；氣相色譜（Gas chromatograph，GC）6890N與質譜 5975 均購于Agilent公司；Beckman AVANTIJ-E離心機。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶活的測定 酶活的測定采用Belancic A的方法［9］，即以p-NPG為底物，在β-D-葡萄糖苷酶作用下水解成對硝基苯酚和葡萄糖，利用對硝基苯酚在堿性條件下顯色的原理，通過比色法來測定β-D-葡萄糖苷酶的酶活。1mL酶液1min水解產生1μmol的對硝基苯酚的酶活力，定義為一個酶活力單位。

1.2.2 葡萄結合態香氣的萃取 稱取適量玫瑰香葡萄，除梗、破碎、離心，獲取上清液，在-20℃下保存備用。

結合態香氣成分（糖苷類物質）的萃取采用Mateo J J［15］的方法，即取適量葡萄汁，利用C18萃取小柱吸附糖苷類物質，再用甲醇進行洗脫，并冷凍干燥。獲得的結合態香氣成分用緩沖溶液（pH=5.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液）復溶至樣品原體積。

1.2.3 酶促水解 粗酶液的制備：以麩皮等為搖瓶發酵培養基［16］誘導產酶，8d后將發酵液離心，取上清液備用。

首先以未加酶的樣品做對照，其次將黑曲霉、海藻曲霉、魯氏毛霉產β-D-葡萄糖苷酶的粗酶液以等酶活力單位的量（1U/mL）添加至經處理的含有結合態香氣成分的8mL樣品中，放入15mL頂空瓶中，40℃反應72h，72h后取出加2.4g NaCl，及5μL內標（2-辛醇，濃度為126.5mg/L），依次編號為CK（對照）、AN-L1（黑曲霉）、AP-L2（海藻曲霉）、A-L3（魯氏毛霉），每個樣品重復二次。

1.2.4 HS-SPME條件 頂空固相微萃?。℉ead-Space Solid Phase Extration）的萃取條件為：45℃預熱2min，萃取吸附45min，GC解析5min（250℃），用于GC-MS分析。

1.2.5 GC-MS分析

1.2.5.1 GC條件 樣品經DB-WAX毛細管柱（60m ×0.25mm×0.25μm，Jamp;W Scientific）分離；進樣口溫度250℃，不分流；載氣為氦氣，流速為2mL/min；柱溫升溫程序為：初始溫度50℃，保持2min，以4℃/min升至230℃，保持15min。分離后的樣品通過Agilent MSD 5975檢測。

1.2.5.2 MS條件 EI電離源，電子能量70eV；離子源溫度230℃；掃描范圍30.00～500.00amu。

1.2.6 定性和半定量分析 物質定性通過與NIST05a.L Database（Agilent Technologies Inc.）進行檢索比對，并通過計算相應的保留指數（RI）進行確認。

待定物質含量采用半定量分析方法進行，內標為2-辛醇（2-octanol）。其計算公式為Xi=（Ai/As）×Cs，其中Xi為待測物含量，Cs為內標物的濃度，As為內標物峰面積，Ai為待測物峰面積。

2 結果與分析

2.1 不同微生物來源β-D-葡萄糖苷酶酶活的比較

從大量的土壤及葡萄樣品中篩選得到三株能產β-D-葡萄糖苷酶且酶活較高的菌株。為研究不同菌株所產酶活的情況，選用麩皮誘導培養基，經搖瓶發酵培養8d后，發酵液經離心獲得上清液以測定其酶活，結果見表1。

表1 不同菌株產β-D-葡萄糖苷酶酶活的比較

由表1可知，不同菌株粗酶液中的酶活存在顯著差異，酶活由高到低依次為黑曲霉、魯氏毛霉、海藻曲霉。黑曲霉所產的酶活較高，且黑曲霉是公認的安全菌株。許多作者對黑曲霉產β-D-葡萄糖苷酶的情況進行了研究，Barbagallo［17］對黑曲霉和酵母產β-D-葡萄糖苷酶的篩選、性質及其在釀酒工藝的應用進行了比較，研究結果表明，黑曲霉在適合釀造的pH條件下，雖然受到糖的抑制作用，但仍表現出相對較高的酶活力。但該研究并未對β-D-葡萄糖苷酶水解后香氣物質的變化情況進行詳細研究。

為進一步研究β-D-葡萄糖苷酶對葡萄酒香氣的影響，以等酶活力單位的量（1U/mL）分別將黑曲霉、魯氏毛霉、海藻曲霉的酶液添加到含有結合態香氣物質的溶液中，以研究不同微生物來源的β-D-葡萄糖苷酶對玫瑰香葡萄結合態香氣的影響。

表2 四種樣品中被檢測并鑒定出的萜烯類化合物及其含量

2.2 β-D-葡萄糖苷酶對萜類物質的影響

2.2.1 檢測并鑒定出的萜烯類化合物 葡萄中萜烯類物質主要包括單萜烯、倍半萜烯及二萜烯類化合物，在葡萄或葡萄酒中主要以結合態的形式存在。采用HS-SPME和GC-MS技術分析了β-D-葡萄糖苷酶對結合態香氣的影響，研究結果表明，經β-D-葡萄糖苷酶酶促水解后被檢測并鑒定出的萜烯類香氣有玫瑰醚、順式-氧化里那醇、橙花醚、里哪醇、β-檸檬醛等11種（見表2），它們具有愉悅的風味特征，構成了玫瑰香葡萄品種的特征香氣，如經來源于黑曲霉的β-D-葡萄糖苷酶作用后，產生大量的順、反-香葉醇，具有玫瑰香及桃子香。

CK（未添加酶）樣品僅發現一種萜烯類香氣物質，但其含量非常低，僅為1.28μg/L，這可能是由于自然水解作用產生的。添加β-D-葡萄糖苷酶后，各樣品中萜烯類含量明顯增加。如AN-L1樣品（黑曲霉）中的含量為783.26μg/L，是未加酶樣品的612倍，這說明經酶促水解作用后，釋放出了大量萜烯類物質。同時，AP-L2、A-L3樣品中的萜烯類物質含量遠低于AN-L1，其含量分別是AN-L1（黑曲霉）的34.12% 和10.59%，這說明添加的不同β-D-葡萄糖苷酶的酶活盡管相同，但酶促水解產生的萜類物質含量差異顯著。

Gueguen［12］研究了用固定化的β-D-葡萄糖苷酶水解葡萄酒和果汁中的結合態香氣物質，結果表明，經β-D-葡萄糖苷酶水解后，產生了香葉醇、橙花醇、里哪醇等揮發性的萜烯類化合物，其結果與本論文的研究結果相近，表明這幾種化合物在玫瑰香葡萄結合態香氣中占有重要地位。

此外，不同β-D-葡萄糖苷酶作用后，其釋放出的萜類物質種類及含量也存在顯著差異。AN-L1（黑曲霉）中萜類物質含量較高的依次是反-香葉醇、順-香葉醇、β-香茅醇，其中香葉醇占其總香氣成分的84.09%；AP-L2（海藻曲霉）中含量較高的依次是橙花叔醇、順-香葉醇、反-香葉醇，其中橙花叔醇占其總香氣成分的47.15%；A-L3（魯氏毛霉）含量較高的依次是β-香茅醇、α-檸檬醛、順-香葉醇，其中β-香茅醇，α-檸檬醛分別占其總香氣成分的24.22%和20.74%。表明不同微生物中分離得到的β-D-葡萄糖苷酶之間呈現多樣性，其作用后產生的特征萜烯類香氣是不同的，這為實現葡萄酒香氣的定向修飾特征提供了依據。

2.2.2 揮發性萜烯物質的GC-MS總離子流色譜圖

萜烯類物質的保留時間主要集中在16～36min，如圖1所示。從圖中可以明顯看出，各個樣品中的香氣物質得到了較好地分離。各物質成分通過NIST05a質譜庫檢索，并比較文獻中的保留指數（RI），共鑒定得到的萜烯類物質11種（詳見圖1），以及其他一些醇類、酯類、酸類、酮類、芳香族等化合物。

2.3 β-D-葡萄糖苷酶對其他香氣物質的影響

在葡萄或葡萄酒中，除萜類物質外，許多醇類、酯類等物質也以糖苷的形式存在。因此，利用β-D-葡萄糖苷酶也可促進其水解，產生具有香味的物質。利用GC-MS技術檢測到的化合物有醇類、酯類、酸類、酮類、芳香族化合物等。醇類物質是賦予葡萄酒香氣的重要揮發性物質；酯類物質大多具有水果香氣；其他化合物雖然相對含量較少，但考慮到這些化合物的閾值，也可能是葡萄酒的重要風味物質。

各物質含量見圖2所示。經不同的β-D-葡萄糖苷酶水解后，樣品香氣特征存在顯著差異。其中加入AP-L2（海藻曲霉）產β-D-葡萄糖苷酶的樣品產醇類物質較豐富，含量達579.32μg/L，是加入ANL1（黑曲霉）產β-D-葡萄糖苷酶的樣品產醇類物質的10倍，是加入A-L3（魯氏毛霉）產β-D-葡萄糖苷酶的樣品產醇類的19倍。另外，加入AP-L2（海藻曲霉）產β-D-葡萄糖苷酶的樣品產酯類物質也很豐富，含量達257.74μg/L，分別是AN-L1（黑曲霉）和A-L3（魯氏毛霉）的16倍和90倍。

圖2 不同來源β-D-葡萄糖苷酶對香氣物質的影響

上述結果表明，加入AP-L2（海藻曲霉）產β-D -葡萄糖苷酶的樣品中醇類、酯類的香氣物質含量最為豐富。另外，檢測到芳香族化合物、酸類、酮類等微量成分，其中加入AN-L1（黑曲霉）產β-D-葡萄糖苷酶的樣品中芳香族化合物、酸類、酮類物質最多，分別為14.06、29.96、13.12μg/L。綜上所述，結合態的香氣物質含量豐富，種類多樣。

3 討論與結論

β-D-葡萄糖苷酶來源非常廣泛，其酶的特性也差異顯著。許多植物材料中如杏仁、葡萄、木瓜等中均含有β-D-葡萄糖苷酶，但在葡萄酒環境中，基本不表現活性［18-19］。霉菌、酵母菌、乳酸菌等也是 β-D -葡萄糖苷酶的重要來源［19-20］。本論文首先通過酶活力的高低，自行篩選出了三株產β-D-葡萄糖苷酶的菌株，并將其應用于玫瑰香葡萄的結合態，結合固相微萃取、氣質聯用等技術，經β-D-葡萄糖苷酶作用發生水解斷裂產生典型的萜烯、醇類、脂類等化合物，釋放出令人愉快的香氣物質。說明β-D-葡萄糖苷酶對于增加葡萄結合態香氣物質具有顯著的作用。進一步的研究結果表明，葡萄中糖苷類風味物質經酶促水解作用后，其產生的萜烯類化合物種類和含量上差異顯著，且香氣特征存在差異。此類萜烯類化合物可以賦予葡萄酒特有的果香，而該差異性為實現葡萄酒香氣的定向修飾特征提供了依據。

綜上所述，來源于黑曲霉、海藻曲霉、魯氏毛霉的β-D-葡萄糖苷酶，其酶活力及其作用效果是不同的。研究結果表明，經三種酶作用后，其萜烯類物質及醇類、酯類等其他物質均有顯著的增加，尤其以來源于黑曲霉的酶作用效果最為明顯。黑曲霉作為一種安全菌株，其所產的β-D-葡萄糖苷酶在葡萄酒環境中具有較好的穩定性，對修飾葡萄酒風味具有潛在的應用前景。

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Effects of β-D-glucosidases from microorganism on the bound aroma compounds in Muscat grape

GUO Hui-nv，KANG Wen-huai，XU Yan*，YU Xiao-wei
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Center of Brewing Science and Enzyme Technology，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

β-D-glucosidases is the key enzyme in improvement mechanism of flavor，and it is important to improve the wine aroma.The purpose of this study was to verify the effects of β-D-glucosidases from different strains（Aspergillus niger，Aspergillus phoenicis，Mucor rouxianus）on the bound aroma in Muscat grape by gas chromatography-tradem mass spectrometry（GC-MS）.The results showed that there were significantly differences in hydrolysing glusidically bound compounds and production among the different strains，β-D-glucosidases from Aspergillus niger had much more aroma compounds than others.Terpenoids were the most abundant，accounting for 85.91%of the total concentration.Therefore，β-D-glucosidases from Aspergillus niger may make the most significant improvement to hydrolyse glycoconjugated aroma compounds，and it can improve the flavor of wine.

β-D-glucosidases；Muscat；bound aroma

TS262.6

A

1002-0306（2011）01-0081-05

2010-01-05 *通訊聯系人

郭慧女（1983-），女，碩士研究生，主要從事工業微生物育種及其在釀酒科學、酶工程領域的研究。

教育部長江學者和創新團隊發展計劃（NCET04-0498）。