食源性致病菌PCR檢測中常用的靶基因及其參考引物

宋 艷，李建林，鄭鐵松

（南京師范大學金陵女子學院，江蘇南京210097）

食源性致病菌PCR檢測中常用的靶基因及其參考引物

宋 艷，李建林，鄭鐵松*

（南京師范大學金陵女子學院，江蘇南京210097）

PCR方法檢測食源性致病菌在敏感性、特異性與速度上都具有很大優勢，在其應用過程中，選擇的靶基因和由此設計的引物序列直接影響方法的特異性和靈敏性。綜述了大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌及其他常見的食源性致病菌在PCR檢測中常用的靶基因及其參考引物，以供相關研究者借鑒。

PCR，食源性致病菌，靶基因，引物

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈式反應，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。利用PCR方法對食品致病菌進行檢測在敏感性、特異性與速度上都具有很大優勢。隨著對一些主要食品微生物遺傳性質了解的逐漸深入，許多致病菌的遺傳背景進一步明了，PCR技術在食品檢測中也更加顯示出其應用前景。PCR技術檢測食源性致病菌的特異性，取決于所選擇的擴增靶序列是否為其待檢菌高度保守的特異性片斷。因此，選擇靶序列和由此設計的引物序列直接影響方法的特異性和靈敏性，隨著PCR技術在食源性致病菌中的廣泛應用，對此也就提出了更高的要求。本文綜述了在食源性致病菌PCR檢測中常用的靶基因及其參考引物，以供相關實驗工作者借鑒。

1 概述

1.1 PCR及引物

PCR（Polymerase Chain Reaction）是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，又稱為基因的體外擴增法。PCR用到的引物是根據目標細菌基因組DNA特異性保守序列（檢測靶點）而設計出來的寡核苷酸序列。PCR原理是首先將靶DNA雙鏈加熱變性為單鏈，加入兩段人工合成的引物；引物與互補的DNA單鏈堿基互補結合后，在有DNA聚合酶和4種dNTP底物存在的情況下，引物沿模板DNA鏈按5′→3′方向延伸，自動合成新的DNA雙鏈。新合成的DNA雙鏈又可作為擴增的模板，繼續重復以上的DNA多聚酶鏈反應。經過25～35次循環，可將靶DNA序列擴增近百萬倍。因此檢測靶點與根據檢測靶點所設計的恰當序列的引物，對于PCR檢測的準確性和敏感程度來說是至關重要的。而且在近年的研究實踐中發現，檢測靶點的特異性不強是導致其PCR檢測結果出現假陰性或假陽性結果的主要原因。

1.2 引物在PCR中的作用

引物對PCR擴增的特異性起著關鍵的作用，引物的優劣直接關系到PCR擴增的特異性和成功與否。靶序列的選擇是決定PCR結果的關鍵因素，選擇是否準確則取決于對所檢測對象的遺傳背景的了解。引物序列則決定PCR產物的大小、位置、產量以及擴增區域的Tm值和擴增產量有關的重要物理參數。好的引物設計可以避免背景和非特異性產物的產生，得到的引物產量也可接近反應指數期的產量理論值，而差的引物可能會很少產生目的產物甚至沒有，也可能會產生非特異性產物。顯然靶序列的選擇和引物的設計是PCR檢測實驗成功與否的關鍵。據目前研究報道來看，引物基本上是根據待檢測菌的一段已知序列設計的，并且大多數是根據屬特異靶序列設計的。

1.3 引物選擇設計的原則

PCR引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片斷，使其能有效擴增模板DNA。靶基因的選擇原則包括：各菌種（或屬）的擴增靶基因應具有種屬特異性，即種（或屬）共有，而種（或屬）間特異；各個靶基因應沒有或有很小的同源性，因為靶基因有較長同源序列的片段在退火時形成的非特異性互補會降低多重PCR擴增效率。

引物設計遵循以下原則：a.引物長度：特異性一般通過引物長度和退火溫度控制。引物長度太短會降低序列的特異性；引物越長則擴增退火時被引發的模板越少，而且錯配的可能性也會增加。引物長度通常在20～25bp。b.引物與引物之間避免成穩定的二聚體或發夾結構，否則將導致引物雙鏈體產物和天然模板之間的競爭，從而影響擴增成功。c.GC的合理含量和Tm值：Tm值在55～65℃，合理的GC含量一般為40%～60%。d.引物位點的選擇也很重要，對于同源性不高的基因來說，不同菌株內的目的基因序列可能不同，所以要選取各基因序列的相同序列來設計引物。

2 檢測大腸桿菌的靶基因及其參考引物

2.1 大腸桿菌及其類型

大腸桿菌是人和動物腸道的正常菌群，當機體抵抗力下降或其侵入腸外組織器官時，可作為條件致病菌而引起腸道外感染，食品衛生學意義上的大腸桿菌嚴格稱為致病性大腸埃希菌，常被作為衛生監督的指示菌。致腹瀉大腸桿菌其致病機制幾乎均與毒力島基因或獲得性質粒有關［1］，基因和質粒攜帶的基因可編碼產生毒素和致病因子。按其產生特異性毒力因子的能力以及引起腹瀉的類型等可分為四類：腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸產毒素大腸桿菌、腸侵染性大腸桿菌，此外還有腸聚集性大腸桿菌和彌散粘附性大腸桿菌。

2.2 檢測常用靶基因

2.2.1 rfbE rfbE是編碼大腸桿菌O157∶H7菌體抗原特異合成酶，并參與O抗原脂多糖的生物合成的基因，與Stx、eae、hlyA等其它毒力基因相比，rfbE特異性更強。所有的O157∶H7產毒或不產毒株，進行PCR擴增后此片段都可擴出，其他非O157∶H7株都為陰性，有較好的特異性［2］。

2.2.2 Stx Stx是EHEC的志賀樣毒素基因。此基因也被作為檢測大腸埃希菌O157∶H7的靶基因，是因為絕大多數的大腸埃希菌O157∶H7菌株都具有志賀樣毒素基因。此基因可以檢測所有的產志賀毒素的菌株，而不產生志賀毒素的大腸埃希菌如腸產毒性大腸埃希菌和腸侵襲性大腸埃希菌均不能擴增出相應的PCR產物［4］。

2.2.3 fliC fliC是H7鞭毛抗原基因，所有O157∶H7的產毒或不產毒株都能擴出此段序列，其他非O157∶H7株均為陰性。若利用rfbE基因、fliC基因和Stx，設計3對引物，在檢測其血清分型的同時，也可以檢測菌株能否產生高致病性的志賀毒素，在食品安全的監測與控制方面會具有更重要的意義。

2.2.4 per per是編碼糖胺合成酶（perosamine synthetase，per）的序列。糖胺合成酶是大腸桿菌O157∶H7型合成O型抗原的重要因素，一旦其基因發生變異就能使大腸桿菌O157∶H7的O型抗原合成中斷。該基因可以特異性擴增大腸桿菌O157∶H7型。

2.2.5 hlyA hlyA是EHEC的溶血素基因，位于一個60MD的大質粒上，而幾乎所有的O157∶H7菌株都有一個這樣的質粒。通過對hly的PCR檢測，除常見的O157∶H7血清型外，也可檢出其他血清型大腸埃希菌。

常用到的檢測靶基因及參考引物見表1。

表1 檢測大腸桿菌的靶基因及其參考引物［3-6］

3 沙門氏菌常用的靶基因及參考引物

在食物中毒中沙門氏菌屬是最常見的致病菌，在公共衛生、食品衛生、畜牧獸醫和出入境檢驗檢疫中有著十分重要的意義，常污染各種肉、魚、蛋、乳類食品而引起食物中毒，其中以肉類占多數。沙門氏菌抗原構造包括菌體（O）抗原、鞭毛（H）抗原和Vi抗原，分型主要依靠O、H抗原。用來設計PCR引物的基因（見表2）主要分三類，即屬特異性基因、血清群特異性基因和血清型特異性基因。

3.1 inv

inv基因序列是一組基因，包括invA、invB、invC、invD、invE等，它編碼吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白。其中invA是編碼沙門氏菌的侵襲蛋白的基因，侵襲基因使細菌具有侵襲宿主上皮細胞的能力，只存在于致病性沙門菌中的獨特的保守基因序列，invA基因也是毒力島SP11基因之一，沙門菌的粘附和穿入宿主細胞就是由其介導的。Rahn等［7］根據invA基因設計引物，PCR檢測沙門氏菌均得到特異擴增片斷，而非沙門氏菌則無特異擴增。

3.2 傷寒沙門菌鞭毛抗原（sef）

鞭毛是細菌重要的毒力因子之一，它為細菌的運動提供動力，可以作為在細胞表面的黏附素，決定了細菌在細胞表面吸附及以后的侵入和定居過程?？梢杂胹efA基因（編碼鞭毛的抗原）設計引物用PCR方法檢出沙門菌，根據該序列設計內、外引物進行套式PCR，特異擴增出傷寒沙門氏菌，而包括副傷寒沙門氏菌在內的其他沙門氏菌，以及非沙門氏菌屬的其他細菌都無法擴增。Soumet等根據沙門菌屬隨機克隆序列、傷寒沙門菌的fliC基因和腸炎沙門菌的sefA基因設計了三對引物，應用多重PCR結果可特異性檢出傷寒沙門菌和腸炎沙門菌，敏感性可達95%［8］。

表2 沙門氏菌常用的靶基因及參考引物［11-15］

3.3 ViaB

致病的傷寒沙門菌都具有Vi抗原，Vi多糖抗原為N-乙酰半乳糖胺糖醛酸多聚物，Vi抗原產物由染色體中ViaA和ViaB兩組基因所控制，其中ViaB基因被認為是Vi抗原表達的特異結構基因。

正在我糾結的時候，兩邊的比賽火熱地進行。沈宜修端莊大方，她的幾個女兒都是一等一的美人，陳圓圓欲語還休，猶抱琵琶半遮面雙眼如迷霧般朦朧，柳如是一身男裝打扮清爽利落粉雕玉琢，一時間覺得滿屋光華照人，看得我驚呆了。在這個緊要關頭，我不能亂了陣腳，趕緊先找到男主角再說。我的目光在人群里搜索，看得出來，和我一樣眼神飄忽的女子還不少，難道都在找楊公子？

除此以外，主要編碼菌毛亞單元的fimA、沙門氏菌侵襲基因正調節蛋白hilA、質粒毒力相關的SPV基因、編碼組氨酸轉運操縱子hut基因、沙門菌外膜蛋白基因ompC、腸毒素基因stn基因、質粒編碼菌毛的pef基因、染色體復制起點的DNA序列、16S～23S rDNA之間的區域也常被作為沙門氏菌PCR檢測靶點Yeh等人［9］則提出，利用fimY基因進行檢測具有很好的特異性，使運動性和非運動性的沙門氏菌都能得到擴增。Lim等根據編碼O4抗原的rfbJ基因、編碼H：i抗原的fliC基因和編碼H：1，2抗原的fljB基因設計三對引物對鼠傷寒沙門菌進行特異性PCR擴增［10］。

4 金黃色葡萄球菌檢測常用的靶基因

金黃色葡萄球菌是一群常堆積成葡萄串狀革蘭氏陽性球菌。金黃色葡萄球菌引起的食物中毒主要是由其在繁殖過程中分泌到菌體細胞外的腸毒素引起的，其食物中毒常發生在春秋季節。引起食物中毒的食品，主要為肉、奶、魚、蛋類及其制品等動物性食品為主。

4.1 nuc

nuc是編碼金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因。目前認為金黃色葡萄球菌的熱穩定性核酸酶由葡萄球菌核酸酶編碼其產物是耐熱核酸酶。為Ramesh采用多重PCR通過擴增金黃色葡萄球菌的nuc和ail基因，可以將其從牛奶中檢測出來［16］。

4.2 sea seb sec sed see

sea seb sec sed see是其編碼腸毒素的基因［17］，腸毒素可分為A、B、C、D、E及H6種血清型，是食物中毒導致急性胃腸炎的主要因素。有1/3金黃色葡萄球菌產生此蛋白質性毒素。

4.3 Coa

金黃色葡萄球菌能產生血漿凝固酶，它是一種能使含有枸椽酸鈉或肝素抗凝劑的人或兔血漿發生凝固的酶類物質，致病菌株多能產生此類物質，常作為鑒別葡萄球菌有無致病性的重要標志［18］。

其他如能增強金黃色葡萄球菌的耐藥性的輔助基因femA，金黃色葡萄球菌編碼表皮剝脫毒素表皮剝落毒素eta etb也常用到，見表3。

表3 金黃色葡萄球菌檢測常用的靶基因及參考引物［18-23］

5 志賀氏菌檢測常用的靶基因及引物

志賀菌屬是主要的腸道病原菌之一，屬革蘭氏陰性桿菌，是人類細菌性痢疾最常見的病原菌，通稱痢疾桿菌。志賀氏菌作為侵襲性病原菌，其致病性主要由毒力質粒所介導。它主要的致病因素有：侵襲力、內毒素和Vero毒素。

志賀菌的致病性主要與其毒力基因的表達產物相關，其中福氏志賀氏菌的侵襲性質?？乖璈的基因ipaH、編碼侵襲性質?；騣al、志賀菌腸毒素1基因ShET-1和志賀菌腸毒素2基因ShET-2是已確定的一組與疾病相關的致病基因。馬宏等［24］人建立了同時檢測ShET-1B、ShET-2、ipaH和ial4種毒力基因的多重PCR檢測方法。經對624株志賀菌毒力基因的鑒定，認為該方法具有靈敏、特異、穩定的特點。

此外，志賀氏菌中acrAB的表達受多種調節因子的調節，最主要的為AcrR抑制子與耐多藥（mar）操縱子。通過PCR檢測調控基因acrR、marOR的突變與志賀菌耐多藥之間的關系，為防治志賀菌耐多藥產生提供依據［25］，也可以作為志賀氏菌的靶基因。

表4 志賀氏菌檢測常用的靶基因及參考引物［12，26-27］

6 其他食源性致病菌PCR引物設計中用到的目的基因及其參考引物

見表5。

6.1 單核細胞增生性李斯特菌

單核細胞增生性李斯特菌是一種重要的人獸共患和食品衛生病原菌，該菌主要通過肉乳及其制品引起人的感染發病，能引起人和動物腦膜炎，敗血癥及孕婦流產等。hly編碼溶血素O的基因，溶血素為李斯特菌的主要致病因子，由hly基因編碼。hly基因在李斯特菌中是保守的片段。Inl是李斯特菌的內化基因，內化素是李斯特菌的表面蛋白，是侵襲性蛋白，能與上皮細胞、內皮細胞、肝細胞、單核吞噬細胞等多種真核細胞結合，繼而進入寄居細胞。Almeida則以Lm的inl作為靶基因進行PCR擴增，發現該基因是Lm所特有的基因片段，其他的李斯特菌則不具這個基因片段，同時選取了金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌作對照實驗結果均為陰性［28］。此外，編碼一種侵襲性蛋白P60的基因iap，也具有李斯特種屬特異性，相對保守高度特異［29］。

6.2 霍亂弧菌

霍亂弧菌是人類霍亂的病原體，在出入境的食品中也不允許被檢出?；魜y弧菌的致病因素主要包括毒素和定居因子，主要毒素有霍亂腸毒素、小帶聯結毒素、副霍亂毒素。檢測霍亂弧菌的常用的靶基因主要有編碼霍亂腸毒素的CTX基因、毒力調節基因toxR、調控編碼cT和TCP的基因、編碼外膜蛋白的ompW基因、毒素協同調節菌毛編碼基因TcpA、編碼小帶聯結毒素的基因、Zot及編碼TCP菌毛的TCP基因等。

6.3 副溶血弧菌

副溶血性弧菌是一種嗜鹽性弧菌，常呈多形態性，有鞭毛，無莢膜和芽孢，常存在于海產品及鹽漬食品中。目前認為副溶血弧菌的致病因子主要有三種，分別為不耐熱溶血毒素TLH、耐熱直接溶血毒素TDH和相對耐熱直接溶血毒素TRH［31］。位于染色體上編碼TLH的基因據推測是副溶血弧菌的特異性基因，還有編碼副溶血弧菌ToxR蛋白的基因及其開放閱讀框序列ORF。Bej等人根據副溶血性弧菌編碼不耐熱溶血素的tlh基因、耐熱直接溶血素的tdh基因和相對耐熱直接溶血素的trh基因設計引物，利用多重PCR檢測111份樣品中的副溶血性弧菌，其敏感性高，特異性強，而且能區分產毒株和非產毒株，遠優于傳統細菌學方法［32］。

6.4 化膿鏈球菌

通過分析化膿鏈球菌編碼M抗原蛋白emm基因的高變區5′末端序列，PCR技術以及基于核酸序列分析方法突破了傳統M分型系統的限制。對于化膿鏈球菌具有種特異性的基因還有Smez及目的基因為Spyl258轉錄調控序列［34］。

7 結語

引物的優劣直接關系到PCR的特異性與成功與否，是PCR反應成功擴增的一個關鍵。隨著分子生物學的迅速發展，各種微生物的基因序列的逐漸明了，使得引物設計有了更多選擇。例如近年發現由于轉錄調控子代表了細菌在適應環境和進化過程中的關鍵分子成分，因此，轉錄調控子序列很有可能具有種特異性和群特異性。有學者選擇轉錄調控子序作為目的序列，建立能特異性地檢測包括化膿鏈球、無害李斯特氏菌、單核增生李斯特菌、出血敗血性巴斯德氏菌以及金黃色葡萄球菌在內的多種細菌的PCR檢測方法。近年來對食品病原細菌致病機理的研究陸續發現許多與致病相關的基因，這些基因大多都是該菌所特有的，此外一些編碼獨特酶或其他代謝產物的基因也高度保守。隨著這些新的保守基因的發現和研究，PCR檢測病原細菌的靶基因會有更多選擇，必將推動這一檢測技術進一步發展和應用。

表5 其他食源性致病菌PCR引物設計中用到的目的靶基因及參考引物［12-13，15，29-31，33-35］

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Molecular targets and primers-associated for the PCR detection of foodborne pathogen

SONG Yan，LI Jian-lin，ZHENG Tie-song*
（Jinling College，Nanjing Normal University，Nanjing 210097，China）

The PCR detection of foodborne pathogen is rapid，accurate，specific and sensitive.Molecular targets and primers-associated could effect the specification and sensitivity of PCR detection directly.The paper reviewed the studies on the molecular targets and primers-associated for the PCR detection of Escherichia coli，Salmonella，Staphylococcus aureus，Shigella and other foodborne pathogen，which would be a great pool of information resources to select specific targets for the PCR detection.

PCR；foodborne pathogen；molecular target；primers

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0371-06

2009-12-08 *通訊聯系人

宋艷（1984-），女，在讀碩士研究生，主要從事食品生物技術及食品安全方面的研究。