內毒素加肥甘飲食建立大鼠濕熱模型的效果研究*

★ 李華鋒 張競之 區鴻斌

(廣州醫科大學第二附屬醫院中醫科 廣東 廣州 510260)

濕熱證是臨床上常見的病證，包括外感濕熱病證和內傷濕熱病證。對于濕熱證的動物模型研究，目前應用較多的造模方法主要有兩種，一是濕熱環境+高脂飲食+細菌感染，二是高脂飲食+內毒素。前者多用于濕熱證急性造模，缺點是長期的濕熱環境可能造成動物的大量死亡，而且急性模型的應用限制性也很大。對于第二種方法，目前的研究都是以兔為動物模型，沒有用大鼠做為動物模型，而大鼠在炎癥因子的信號傳導通路及因子的活化表達上與人更為接近，能否以大鼠為模型制造出更接近人體的濕熱證模型，國內外尚無相關研究。本實驗即從這一思路入手，分別用肥甘飲食、內毒素、肥甘飲食+內毒素的方法建立大鼠的濕熱模型，以比較不同方法造模的效果差別，并探討大鼠濕熱模型成模的機制及改進手段。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 80只6～8周齡SPF級Wistar大鼠，雌雄各半，體重80～100g，購自中山大學實驗動物中心。動物合格證號：粵檢證字SCXK(粵)-2004-0011。

1.1.2 材料和儀器 ELISA相關試劑盒購自武漢博士德公司，兔抗大鼠IL-2或NF-κB及羊抗兔二抗購自美國SantCruz公司，大腸桿菌內毒素購自Promega公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物分組及處理 80只大鼠，隨機分為4組，每組20只，雌雄各半。第1組(正常組)予正常飲食，第2組予肥甘飲食(5%豬油、3%雞蛋黃、5%蜂蜜摻入普通飼料)造模，第3組以內毒素(鼠尾靜脈注射大腸桿菌內毒素2μg/kg，每周2次)造模，第4組以肥甘飲食+內毒素造模。各組均造模6周后，取大鼠腹主動脈血檢測IL-2、NF-κB的表達水平。

1.2.2 ELISA測定IL-2、NF-κB的表達 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用抗IL-2或NF-κB單抗包被于酶標板上，標準品和待測樣品中的IL-2或NF-κB與單抗結合，加入生物素化的抗IL-2或NF-κB抗體，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Steptavidin與生物素結合，加入酶底物OPD出現黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492nm波長處測吸光度值A，IL-2或NF-κB濃度與A值成正比，通過繪制標準曲線求出標本中的IL-2或NF-κB濃度。

2 結果

2.1 各種大鼠體內IL-2的表達 正常組、肥甘飲食組、內毒素組大鼠IL-2的表達均為低表達，且3組之間無明顯差別，肥甘飲食+內毒素組IL-2的表達較前3組明顯升高(P<0.05)，見表1、圖1。

2.2 各組大鼠體內NF-κB的表達 正常組、肥甘飲食組、內毒素組大鼠NF-κB的表達均為低表達，且3組之間無明顯差別，肥甘飲食+內毒素組NF-κB的表達較前3組明顯升高(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 各組樣本IL-2、NF-κB的表達

注：1)與第1組比較，差異無顯著性，P>0.05；2)與第1組比較，差異有顯著性，P<0.05；3)與第2組比較，差異有顯著性，P<0.05；4)與第3組比較，差異有顯著性，P<0.05。

圖1 ELISA檢測各組樣本

3 討論

目前對濕熱證本質的研究思路呈兩大趨勢：一是對臨床濕熱證患者相關指標進行檢測，力圖從免疫功能、微量元素、自由基水平、血脂代謝、電解質水平、致炎因子、脾胃功能等方面來揭示濕熱證的本質；二是運用傳統中醫理論造模，對模型從病理、生化、免疫、微量元素、胃腸動力等多角度，多側面探討證的本質。目前多強調“濕”性致病因子在濕熱中的作用，比如從電解質水平、水通道蛋白、殺菌通透性蛋白、血脂代謝、胃腸激素等方面探討其本質；對于“熱”性致病因子，目前僅認為與內毒素及其誘導的炎性細胞因子和抗內毒素、抗炎因子、體內氧化物與抗氧化物的活性失衡有關。但濕熱纏綿難愈，相互交蒸，難分難解，探討濕與熱兩類致病因子的相互作用是研究濕熱證的突破口之一。

在本研究中，通過用內毒素與肥甘飲食的方法建立大鼠濕熱模型，其中內毒素所啟動的炎癥因子可作為“熱”致病因子作用的靶點，而肥甘飲食導致的血脂紊亂則為“濕”性致病因子提供了作用平臺。本實驗觀察到，單用肥甘飲食或者單用內毒素的方法，是無法造成成功的濕熱證模型的，肥甘飲食組或內毒素組的大鼠體內炎癥水平與正常大鼠無明顯差別，說明單獨的“濕”或者單獨的“熱”都無法構成標準的濕熱證模型，只有在“濕”的基礎上啟動“熱”的因素，才能最終導致體內炎癥因子的活化和濕熱模型的成功建立，顯然這一結果也符合中醫學的理論，《臨證指南醫案》即指出：“初病濕熱在經，久則瘀熱入絡?！闭f明濕熱蘊蒸日久可以導致血瘀。

本實驗同時發現，IL-2和NF-κB的活化可以作為濕熱證建立的重要指標之一。NF-κB是一種具有多項轉錄調節作用的蛋白質，通過調節免疫和炎癥相關因子及炎癥遞質的表達，在炎癥和免疫反應中起樞紐作用。而作為NF-κB的下游炎癥因子，IL-2在被啟動基因轉錄后，最終可與大批細胞因子(如TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8等)、粘附分子、組織因子、血管緊張素原、誘生型一氧化氮合酶、誘生型環氧合酶、MCP-1等一起大量表達，通過促炎作用導致濕熱證和體內非特異性炎癥的發生發展。這與已有的研究是一致的[1]。究其原因，可能是因為在濕熱證動物模型中，生物致病因子能夠成功的模擬“熱”，亦即內毒素及其誘導的炎性細胞因子等可被認為是“熱”性致病因子，體內的炎癥水平必須要建立在血脂紊亂的基礎上才能導致機體內環境的紊亂和功能的失調，最終導致濕熱證的發生。

[1]Pahl HL. Activators and target genes of Rel/NF-kappB transcription factors[J]. Oncogene, 1999，18(49):6 853-6 866.