蛇床子素誘導Hela細胞凋亡及其機制研究

★ 王大維 梅麗君 溫成平

(浙江中醫藥大學 浙江 杭州 310053)

蛇床子，別名野胡蘿卜子，為傘形科植物蛇床子的干燥成熟果實，性溫，味苦辛，有小毒。主產于河北、浙江、江蘇、四川等地。具有溫腎壯陽，祛風燥濕，殺蟲之功效。用于陽痿，宮冷，寒濕帶下，風濕痹痛等，臨床以外用為主?，F代醫學研究表明，蛇床子素(osthole，OST)具有多種藥理作用，例如：抗骨質疏松癥，抗高血壓，抗心律失常，抗腫瘤，抗衰老，鎮痛消炎等。周俊等建立BALB /C 裸鼠的人肺腺癌和肺鱗癌模型，通過觀察瘤體的大小、重量和動物血清中腫瘤標志物DR270 的水平評價了蛇床子素的抗癌作用[1]。目前對于其抗癌機理則鮮有報道。本實驗以體外培養的Hela細胞為研究對象，觀察蛇床子素對Hela細胞的增殖抑制作用，并探討其誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 蛇床子素(西安原生工程技術有限公司，純度為98%，HPLC檢測)；人宮頸癌Hela細胞株為哈爾濱醫科大學贈送；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑、RPMI 1640干粉為SIGMA公司產品；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；細胞凋亡-DNA Ladder抽提試劑盒(碧云天生物技術研究所)；人轉化生長因子β1(TGF-β1)ELISA試劑盒(上海銳谷生物科技有限公司)；RT-PCR試劑盒(大連寶生物有限公司)。96孔細胞培養板(丹麥Duke公司); CO2培養箱(德國Heraeus公司)；光學顯微鏡(日本Olympus);酶聯免疫吸附檢儀(美國Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的體外培養 Hela細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養夜，置于37℃，CO2體積分數為5%的培養箱中常規培養。取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖 實驗分為空白組(只加試劑，不含細胞) 、陰性細胞對照組(按常規培養)和實驗組。收集對數生長期Hela細胞,接種于96孔細胞培養板中,每孔6000-8000個細胞(100μL)。培養板置于37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中常規培養24h后,實驗組中加入終濃度分別為40；80；120；160；200μg /mL的蛇床子素。每種濃度均設6個平行孔。繼續培養24h后每孔加入 5 mg/mL的MTT溶液20μL繼續孵育4h, 終止培養,小心吸棄上清,每孔加入二甲基亞砜150μL，搖床上振蕩5分鐘溶解藍紫色結晶。用酶標儀于570 nm處讀取各孔吸光度值(A570),以空白組A570均值調零，計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率(% )= (1-實驗組A570均值/對照組A570均值)×100%。

1.2.3 光學顯微鏡觀察細胞凋亡形態 將對數期Hela細胞接種于六孔板中，孔內預先放置蓋玻片，每孔接種約2×105個細胞，常規培養24h后用藥干預。實驗組蛇床子素的質量濃度分別為：40；80；110μg /mL。對照組不用藥。各設兩個復孔，繼續培養24h后，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min,雙蒸水清洗,然后進行常規HE染色,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,封片。倒置顯微鏡觀察，照相。

1.2.4 DNA ladder 法檢測細胞凋亡 細胞的培養分組及用藥同1.4。蛇床子素干預24h后，PBS清洗，按碧云天試劑盒說明書提取 DNA。取樣品于 2%瓊脂糖凝膠電泳 , 60V電泳 1 h,凝膠成像圖像分析系統照相記錄結果。

1.2.5 RT-PCR法檢測基因fas和bcl-2的表達 分別收集40;80;110μg /mL三種濃度蛇床子素作用24h后的Hela細胞,用Trizol試劑抽提細胞中總RNA,以隨機引物在逆轉錄酶的作用下合成cDNA,隨后進行PCR擴增。同時擴增管家基因β-actin作為內參。PCR反應條件：Fas: 94℃5min預變性；94℃30s, 58℃30s, 72℃1min, 共31個循環；72℃延伸10min。Bcl-2:56℃退火30s，其余同前。各目的基因產物長度如下：β-actin為171bp;fas為242bp;bcl-2為347bp。取PCR產物經2%瓊脂糖凝膠進行電泳,采用凝膠成像系統拍照并分析目的基因的相對表達量。

1.2.6 TGF-β1分泌水平的檢測 選取對Hela細胞沒有顯著抑制作用的藥物濃度(10μg /mL)干預24h后的培養上清為ost-La；洗去中藥后培養24h的上清為ost-Lb；不經藥物處理的Hela細胞培養24h的上清作為對照，稱為control-L。以定量Elisa法測定各上清中TGF-β1的含量。

2 結果

2.1 蛇床子素對Hela細胞的抑制作用 MTT試驗結果顯示，在藥物濃度為40～200μg /mL的濃度區間內，其抑制作用隨著質量濃度的提高而增強。

表1 蛇床子素對Hela細胞增殖的影響

注：與對照組比較，*P﹤0.01。

2.2 光學顯微鏡下觀察細胞形態變化 蛇床子素作用24h后，可觀察到細胞形態發生改變。其中40μg /mL劑量組的細胞形態變化不太明顯，但細胞已經縮小，胞質濃縮。80μg /mL劑量組細胞變圓并有部分脫落。110μg /mL劑量組可見染色質密集并邊緣化，且有凋亡小體出現，見圖1。

A.對照組；B.40μg /mL劑量組；C.80μg /mL劑量組；D.110μg /mL劑量組

M: marker C: 對照組 1～3: 40,80,110μg /mL蛇床子素

2.3 DNA Ladder 法檢測蛇床子素對Hela細胞凋亡的誘導作用 瓊脂糖凝膠電泳可見，對照組細胞只有分子量大的DNA，而110μg /mL劑量組細胞DNA呈典型的梯狀條帶。80μg /mL劑量組細胞的DNA也可見到梯狀條帶，而40μg /mL劑量組的則不明顯(見圖2)。

2.4 RT-PCR方法檢測蛇床子素對Hela細胞相關基因的mRNA調控作用 結果見表2 。在未經蛇床子素干預的Hela細胞中Fas表達相對較低，Bcl-2表達相對較高。經不同濃度的蛇床子素干預24h后的Hela細胞中則相反。其中Fas和Bcl-2基因的表達變化呈現明顯的濃度依賴性。

表2 蛇床子素對Hela細胞Fas和Bcl-2mRNA水平的影響(相對含量,

注：*P< 0.05 ;**P< 0.01均與0μg/mL劑量組相比。

2.5 蛇床子素對Hela細胞分泌TGF-β1的影響 經和未經藥物處理的Hela細胞培養24h所分泌的TGF-β1濃度見表3。

表3 蛇床子素對Hela細胞分泌TGF-β1的影響

注：與control-L相比，*P<0.01 。

3 討論

蛇床子化學成分復雜，藥理作用廣泛。目前認為其抗腫瘤的主要活性物質為蛇床子素。本實驗采用MTT法檢測不同濃度的蛇床子素對Hela細胞的增殖影響，發現蛇床子素也可以使Hela細胞的增殖明顯受到抑制，并且在40～200μg/mL內隨著濃度的增加，細胞增殖抑制率逐漸升高，表明有濃度依賴關系。MTT檢測結果與張宇潔、賀浪沖等[2]人的結果類似，但稍有不同。通過HE染色，光鏡下觀察發現，蛇床子素處理后Hela細胞形態改變明顯，其中蛇床子素為110μg/mL劑量時Hela細胞呈明顯的凋亡形態，并通過DNA Ladder實驗從生化方面進一步證實了凋亡的發生。

為了探討蛇床子素對Hela細胞凋亡的影響，本實驗測定了經和未經蛇床子素處理的Hela細胞中，Fas和Bcl-2mRNA的表達。結果表明，未經蛇床子素處理的Hela細胞Fas低表達，而Bcl-2高表達。經蛇床子素處理后結果相反，且表達量呈濃度依賴性。Fas和Bcl-2的表達呈負相關。Bcl-2蛋白在許多腫瘤細胞中高表達，在抑制凋亡中起重要作用[3]。Fas基因的產物Fas受體是Ⅰ型跨膜糖蛋白，當Fas與FasL結合后，此結

構域首先與接頭蛋白FADD結合，活化的FADD激活Caspase8和Caspase10進而激活一系列的效應因子使細胞發生凋亡[4]。因此認為Fas在蛇床子素誘導的Hela細胞凋亡過程中起到了促進作用，而Bcl-2起到了抑制作用。

TGF-β1能夠抑制免疫，對細胞的生長，分化，組織修復具有重要的調節作用[5]。在婦科腫瘤中，TGF-β過度表達可使腫瘤細胞易于逃避機體的免疫監視[6]。其中是促進還是抑制細胞的生長增殖主要取決于細胞類型，也與腫瘤的發展階段及其他具體條件有關[7]。目前對于TGF-β1與腫瘤凋亡的關系仍不十分清楚。本研究以10μg/mL的蛇床子素為干預因素，測定了未經干預和干預24h后以及干預后洗去蛇床子素再培養24h的培養上清中TGF-β1的含量。結果表明蛇床子素干預后Hela細胞分泌TGF-β1的量顯著降低。而洗去蛇床子素再培養的Hela細胞分泌TGF-β1的量極少。提示蛇床子素在抑制Hela細胞增殖的過程中TGF-β1的分泌減少起到一定的作用。

將TGF-β1和Fas聯系起來分析：Fas在多種腫瘤的生長和發展過程中是下調的，從而避免T細胞的攻擊。我們的實驗結果提示蛇床子素有可能通過升高Hela細胞Fas的表達，降低TGF-β1的分泌來降低免疫抑制，但需要體內實驗來進一步驗證。

綜上所述，蛇床子素在誘導宮頸癌Hela細胞凋亡的同時，可能會使宮頸癌Hela細胞的免疫抑制作用減弱。但是凋亡和腫瘤免疫是一系列復雜的過程，因此需要更廣泛和深入的研究。

[1]周俊，程維興，許永華，等. 蛇床子素對肺腺癌、肺鱗癌生長抑制作用的實驗研究[J]. 癌變·畸變·突變,2002,14(4):231-233.

[2]張宇潔，賀浪沖. 用細胞色譜模型篩選長春七抑制Hela細胞增殖的活性成分[J]. 中國藥學雜志，2005，40(6)：463-465.

[3]Eberstadt M, Huang B. NMR structure and mutagenesis of the FADD(Mortl) death-effector domain[J]. Nature, 1998,392:941-945.

[4]侯力，呂申，等. 細胞凋亡與腫瘤轉移[M]. 國外醫學--生理、病理科學與臨床分冊，2000:20(3):207.

[5]Nicholson DW, Thornberry NA. Caspase : killer proteases[J]. Trends Bichem Sci ,1997 ,22 (8) :299-306.

[6]翟凌，蔡麗瑛，安媛，等. 轉化因子β及其Ⅱ型受體在卵巢腫瘤中的表達及臨床意義[J]. 中國實用婦科與產科雜志，2005，21(9)：542-544.

[7]Kaminska,B.,A.Wesolowska, M.Danilkiewicz,TGF beta signalling and its role in tumour pathogenesis[J]. Acta Biochim Pol,2005,52(2): 329-37.