加減四君子湯胃內漂浮片的質量控制研究*

★ 樓婷婷 陳佳麗 袁強

(1.浙江中醫藥大學藥學院 浙江 杭州 310053；2.浙江中醫藥大學附屬第二醫院 浙江 杭州 310005)

加減四君子湯(JJSJZT)主要由人參、白術、茯苓、甘草、白芍、白花蛇舌草組成，臨床主要用于治療消化系統疾病，如慢性胃炎[1]、胃潰瘍[2]、十二指腸球部潰瘍[3]、胃竇炎、胃腸功能減退[4]等，加減四君子湯能一定程度抑制胃癌與癌前病變的發生[5]。本文根據各種藥物的有效部位及成分性質分別采用相應工藝條件提取，使其在充分發揮保留有效成分及保證療效的前提下提高了用藥效率。已有的研究表明[6-8]，胃內漂浮片可延長藥物在胃內的滯留時間，并持續均勻釋放所載藥物，延長藥物釋放時間，改善藥物吸收，提高生物利用度，使療效得到改善，故選擇胃內漂浮片為本藥劑型。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀；紫外可見分光光度計UV-2550(日本島津公司)；KQ5200超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)；十萬分之一電子天平(德國塞多利斯)；R204型旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司)；HH-2型數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)。

1.2 試藥

1.2.1 試劑 乙腈為色譜純(美國TEDIA公司)，水為過0.2μm濾膜的純水，甲醇、乙醇、正丁醇等其他試劑均為分析純，購自華東化工儀器試劑有限公司。

1.2.2 對照品 人參皂苷Rb1對照品(中國藥品生物制品檢定所，含測用，批號：110704-200921)；人參皂苷Rg1對照品(中國藥品生物制品檢定所，含測用，批號：110703-200726)；人參皂苷Re對照品(中國藥品生物制品檢定所，含測用，批號：110754-200822)；芍藥苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，含測用，批號：110736-201035)；D-無水葡萄糖(中國藥品生物制品檢定所，含測用，批號：110833-200503)；人參對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號：120917-200609)。

1.2.3 試藥 三批加減四君子湯胃內漂浮片(自制)；人參、白芍等藥材均購自浙江中醫藥大學中藥飲片廠，經浙江中醫藥大學藥學院宋捷民教授鑒定合格。

2 方法[9-12]與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 人參的鑒別 取本品粉末5g，加甲醇30mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加10mL水使溶解，用水飽和正丁醇萃取3次(15,10,10mL)，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。吸取人參皂苷Rg1、Re、Rb1溶液，對照藥材溶液，藥材溶液，供試品溶液，陰性對照溶液各2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(32∶11∶2)為展開劑，展開，取出晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。結果見圖1。

2.1.2 白芍的鑒別 取本品粉末5g，加乙醇50mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加10mL水使溶解，用水飽和正丁醇萃取3次(15,10,10mL)，合并萃取液蒸干，殘渣加乙醇1mL使溶解，作為供試品溶液。吸取芍藥苷溶液，白芍藥材溶液，供試品溶液，陰性對照溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結果見圖2。

1.人參皂苷；2.人參對照藥材；3. 人參藥材；4.胃內漂浮片樣品；5.陰性(缺人參藥材)

1.芍藥苷；2.白芍藥材；3、4. 胃內漂浮片樣品；5.陰性(缺白芍藥材)

2.2 含量測定

2.2.1 HPLC法測定制劑中人參皂苷、芍藥苷的含量

2.2.1.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil BDS C18(4.6mm ×250mm，5μm)；檢測波長：人參皂苷203nm，芍藥苷230nm；柱溫：人參皂苷30℃，芍藥苷25℃；流速：均為1.0 mL/min；流動相：人參皂苷為(0～10 min，乙腈-水為19∶81；10～40min，19～29乙腈；40～45 min，29～31 乙腈；45～60min，31～37乙腈)、芍藥苷為乙腈-水為14∶86；進樣量：10 μL。

2.2.1.2 線性關系考察 分別精密吸取人參皂苷和芍藥苷對照品溶液適量注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定人參皂苷和芍藥苷峰面積。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。計算回歸方程分別為：Rg1：Y=376527.6801X-321.0534，r=1.0000；Re：Y=328135.4893X-569.1802，r=1.0000；Rb1：Y=272196.5638X+2797.8999，r=1.0000；芍藥苷：Y=1335381.6741X-10139.8343，r=1.0000。表明人參皂苷Rg1在0.284～2.272μg，人參皂苷Re在0.432～3.456μg，人參皂苷Rb1在0.716～5.728μg，芍藥苷在0.284～2.272μg范圍內呈良好的線性關系。

2.2.1.3 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，重復進樣5次，每次10μL，測定峰面積，計算RSD。得人參皂苷Rg1、Re、Rb1、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.44%，0.39%，0.89%，0.92%，表明測定儀器的精密度良好。

2.2.1.4 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10μL，分別于0, 2, 4, 6, 8, 12h進行測定，計算供試品溶液人參皂苷和芍藥苷的峰面積RSD。得人參皂苷Rg1、Re、Rb1、芍藥苷峰面積的RSD分別為1.7%，2.8%，1.7%，3.0%，表明樣品溶液在12h內穩定。

2.2.1.5 重復性試驗 稱取同一批次樣品6份，按供試品溶液制備方法制備供試液，精密吸取10μL進樣，照上述色譜條件進行測定，計算供試品溶液人參皂苷和芍藥苷的含量RSD。試驗結果顯示人參皂苷Rg1、Re、Rb1、芍藥苷含量的RSD分別為2.6%，2.9%，2.4%，2.0%，表明該方法重復性良好。

2.2.1.6 加樣回收率試驗 取已知人參皂苷和芍藥苷含量的樣品，分別加入一定濃度的對照品混合溶液0.8mL、1.0mL、1.2mL，按供試品溶液的制備方法制備，精密吸取10μL進樣，測定人參皂苷和芍藥苷峰面積，計算加樣回收率。得人參皂苷Rg1、Re、Rb1、芍藥苷的加樣回收率分別為101.7%、 102.4 %、100.9%、101.8%。

2.2.1.7 樣品的測定 取三批樣品按供試品溶液的制備方法分別制備供試液，測定加減四君子湯胃內漂浮片中人參皂苷和芍藥苷的含量。結果顯示三批制劑的人參皂苷平均含量為3.542mg/g，芍藥苷平均含量為3.546mg/g，故規定加減四君子湯胃內漂浮片中人參皂苷的含量限度為2.834mg/g，芍藥苷的含量限度為2.837mg/g。

2.2.2 紫外分光光度法測定制劑中總多糖含量

據文獻報道，多糖成分具有免疫調節作用，能起到治療慢性萎縮性胃炎的作用[13,14]。測定多糖含量常采用紫外可見分光光度法，經預試驗證明采用苯酚-硫酸法測定多糖含量靈敏度高且重復性好，故將其作為該制劑質量的評價指標之一。

2.2.2.1 線性關系考察 精密吸取稀釋后的的葡萄糖對照品母液0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.2mL，置于干燥的15mL具塞試管中，各加蒸餾水至2.0mL后，精密加入5%苯酚試劑1.0mL，濃硫酸5.0mL，搖勻，置沸水浴中加熱15min，取出置冷水中涼至室溫；精密吸取2.0mL蒸餾水置于干燥的15mL具塞試管中，同法操作為空白，在489.0nm處測定吸光度，繪制標準曲線。得回歸方程：Y=0.0086X-0.026，r=0.9998。表明葡萄糖在16.328～97.968μg范圍內具有良好的線性關系。

2.2.2.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液2.0mL，按線性關系考察項下方法操作，重復測定5次，記錄吸光度，計算RSD。試驗結果顯示供試品溶液吸光度均值為0.442，RSD為2.2%，表明儀器的精密度良好。

2.2.2.3 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液2.0mL，按線性關系考察項下方法操作，每10min測定1次，1h后改為每30min測1次，記錄吸光度，計算RSD。測得吸光度在180min之內保持穩定，RSD為0.25%。故各樣品吸光度的測定均在180min內完成。

2.2.2.4 重復性試驗 取同一批號樣品按供試品溶液的制備方法制備6份。按線性關系考察項下方法操作測定吸光度，計算RSD。計算多糖含量RSD為3.0%，表明該方法重復性良好。

2.2.2.5 加樣回收率試驗 取已知多糖含量的樣品6份，分別精密加入1.56mg/mL葡萄糖對照品溶液1mL，按供試品溶液制備方法制備，測定供試液中多糖含量，計算加樣回收率。測得供試液中多糖平均加樣回收率為100.5%，RSD為2.6%。

取三批樣品，按供試品溶液的制備方法分別制備供試液，按線性關系考察項下方法操作，測定加減四君子湯胃內漂浮片中總多糖的含量。三批制劑的平均含量為132.6mg/g，故規定加減四君子湯胃內漂浮片中多糖的含量限度為106.1mg/g。

3 討論

3.1 本試驗從定性鑒別、含量測定兩方面建立了加減四君子湯胃內漂浮片的質量控制方法，方法專屬性強、靈敏、可靠。

3.2 采用薄層色譜法建立了人參、白芍的定性鑒別。薄層色譜斑點清晰，分離效果好，陰性對照無干擾，方法靈敏、可靠、專屬性強。

3.3 加減四君子湯胃內漂浮片中人參為君藥，人參皂苷是其主要有效成分，常被用來作為人參制劑的定量指標；白芍為處方增加的藥味，芍藥苷是其主要有效成分；總多糖是本處方制劑的主要有效成分之一，因此質量控制方法中的含量測定主要以人參皂苷Rg1、Re、Rb1及芍藥苷、總多糖為考察指標進行。采用HPLC法對人參皂苷、芍藥苷進行含量測定，結果樣品分離效果理想，陰性空白不干擾測定，采用UV顯色法對總多糖含量進行檢測，

本試驗只對三批樣品進行了含量測定，取三批樣品平均值下浮20%作為含量限度。經過方法學考察表明，制定的測定方法重復性、精密度、穩定性均良好，回收率符合要求。實驗制備的加減四君子湯胃內漂浮片符合2010版《中國藥典》[15]對片劑所做的規定，質量穩定可控，能保證用藥的安全、有效。

[1]宋文朗.四君子湯對脾虛證慢性胃炎患者胃動力的影響[J]. 安徽醫藥, 2013, 17(2): 298-300.

[2]解平芬.加味四君子湯治療胃潰瘍的臨床療效觀察[J]. 中醫臨床研究, 2013, 4(23): 81-82.

[3]雷力民,田玉玲,曾云.中醫藥辯證治療功能性消化不良的生存質量研究[J]. 中醫藥學刊, 2005, 23(8): 1 432-1 434.

[4]王劍虹.四君子湯加減臨證舉隅[J]. 中國中醫藥信息雜志, 2006,13(8): 79-80.

[5]任平,黃熙,張莉,等.四君子湯對實驗性脾虛大鼠胃排空率的影響[J]. 中國中西醫結合雜志, 2000, 20(8): 596-598.

[6]馮小叔,黃可兒.胃漂浮片的研究進展及其在中藥制劑中的應用[J]. 廣州中醫藥大學學報, 2011, 28(1): 94-96.

[7]王銳利,張淑秋.胃漂浮片的研究進展[J]. 山西醫科大學學報, 2005, 26(2): 260-262.

[8]史振祺,蔣新國.胃漂浮片的研究進展[J]. 中國醫藥工業雜志, 2003, 34(4): 199-201.

[9]肖霞,曹俊凱.人參當歸顆粒的薄層鑒別[J]. 中國實用醫藥, 2012, 7(9): 249-250.

[10]馮源, 王胤, 周濃,等.HPLC測定黃牡丹不同部位中芍藥苷的含量[J]. 中國實驗方劑學, 2012, 18(9): 139-142.

[11]丁仕強.HPLC測定前列安通膠囊中芍藥苷的含量[J]. 中國實驗方劑學, 2012, 18(23): 61-63.

[12]馮源, 王胤, 周濃,等.HPLC測定生血復元口服液中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量[J]. 中國實驗方劑學, 2010, 16(3): 51-53.

[13]柳保強. 小刺猴頭多糖對大鼠慢性萎縮性胃炎的實驗研究[D]. 長春:吉林大學，2006:27.

[14]郄婧. 不同種類糖治療慢性萎縮性胃炎構效關系的研究[D]. 長春:長春大學，2011:16.

[15]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典·一部[S]. 北京:中國醫藥科技出版社,2010: 附錄7.