四氯化碳誘導的小鼠肝損傷模型比較*

★ 徐彭 談偉鋒 劉波* 謝珍 曹怡 周年

(江西中醫藥大學藥學院 江西 南昌 330004)

復制合適的穩定的肝損傷動物模型是尋找肝損傷治療藥物的前提。目前對于肝損傷模型主要由化學性、免疫性、藥物、酒精等物質誘導產生[1,2]。四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)是常見的外源性化合物[3]，能產生肝損傷并被用于研究藥物的防治作用。蘭鳳英等[4]以0.2%的CCl4油溶液復制小鼠急性肝損傷模型，發現郁金能抗CCl4致小鼠急性肝損傷的作用。寧康健等[5]采用0.1% CCl4油溶液復制小鼠肝損傷模型研究黃芩苷對小鼠肝損傷的保護研究。此外，也有學者以不同濃度的CCl4復制出小鼠肝損傷模型用于保肝藥的研究[6,7]。但是，由于復制動物模型所用CCl4油溶液的濃度、藥方式和給藥時間不同,導致小鼠肝損傷類型不同，表現多種多樣，缺乏穩定性。因此，選擇穩定、有效的CCl4致小鼠肝損傷模型的復制方法是開展實驗研究的重要基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆明種小鼠120只，雌雄各半，SPF級，體重18～22g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證編號：SCXK(湘)2011-0003。

1.1.2 藥物與試劑 AST、ALT檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20120719和20120719)；CCl4溶液(汕頭市隴西化工廠有限公司，許可證編號：XK13-201-00153)；金龍魚特香花生油(江西省南昌市新建縣歐尚超市，商品編號1005703882)。

1.1.3 實驗儀器 UV-2102C型紫外可見分光光度計(尤尼科上海儀器有限公司)，超聲波清洗器SK5200LH(上?？茖?，BS124S分析天平 (Sartorius)，YP202N電子天平(上海精密儀器有限公司)，手動轉輪切片機(Leica)，H-2數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 腹腔注射給藥誘導小鼠肝損傷 健康昆明小鼠40只，隨機分成4組，即正常組、CCl4高劑量組、CCl4中劑量組、CCl4低劑量組。采用腹腔注射的方式，分別注射生理鹽水、11 mL/kg、10 mL/kg 和9 mL/kg 的1% CCl4油溶液(油為食用植物油)，給藥24 h。

1.2.2 皮下注射給藥誘導小鼠肝損傷 健康昆明小鼠40只，隨機分成4組，即正常組、CCl4高劑量組、CCl4中劑量組、CCl4低劑量組。采用皮下注射的方式，分別注射生理鹽水、11 mL/kg、10 mL/kg 和9 mL/kg 的0.2% CCl4油溶液(油為食用植物油)，隔天給藥，連續給藥14 d。

1.2.3 灌胃給藥誘導小鼠肝損傷 實驗取雌雄各半、體重18～22 g健康昆明小鼠40只，飼養一周后，隨機分成雌雄各半4組，即正常組、CCl4高劑量組、CCl4中劑量組、CCl4低劑量組。采用灌胃給藥方式，分別灌胃蒸餾水、11 mL/kg、10 mL/kg 和9 mL/kg 的0.2% CCl4油溶液(油為食用植物油)，每隔48小時給藥，連續給藥90 d。

1.2.4 血清AST、ALT活性檢測 分別在24 h、14 d、90 d時，眼眶取血，并離心獲取血清，采用比色法測定谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)(所有步驟均按照試劑盒說明書進行)。

1.2.5 肝組織病理學檢查 分別在24 h、14 d、90 d時，脫頸處死動物，取肝臟，并以10%多聚甲醛固定肝臟組織，常規石蠟包埋，經過80%、90%、95%、100%各種濃度乙醇脫水透明后進行石蠟包埋，常規切片，片厚4μm。鋪片和烘片后用二甲苯脫蠟，脫苯、復水、染色、脫水、透明、封固。二甲苯浸泡2次各5min，然后逐層乙醇復水：無水乙醇I 2min，無水乙醇II 2min，95%乙醇I 2min，95%乙醇II 2min，80%乙醇2min，75%乙醇2min 。蒸餾水洗1min接著蘇木素染色5min然后自來水輕輕沖洗1min反藍，1%鹽酸乙醇分化30s，自來水浸泡7min；放置伊紅液中2min，無水乙醇I2min，無水乙醇II2min，二甲苯I4min，二甲苯II4min。待切片干后，透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟病理學形態變化。

2 結果

2.1 腹腔注射誘導急性肝損傷動物模型的復制

表1 不同濃度的CCl4腹腔注射對肝組織操作的影響

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01，以下均同。

表2 不同濃度的CCl4皮下注射對肝組織損傷的影響

由表1可見，不同濃度的CCl4腹腔注射均可產生急性肝損傷，使血清ALT明顯升高，但只有高劑量才能升高AST。

2.2 皮下注射誘導亞急性肝損傷動物模型的復制

由表2可見，不同濃度的CCl4皮下注射均可產生亞急性肝損傷，只有CCl4中劑量不僅可使血清ALT明顯升高，還能升高AST。

2.3 灌胃給藥誘導慢性肝損傷動物模型的復制

表3 不同濃度的CCl4灌胃對肝組織損傷的影響

表3顯示，不同濃度的CCl4灌胃給藥均可產生肝損傷，CCl4各劑量不僅可使血清ALT明顯升高，還能升高AST，作用穩定，且呈濃度依賴性。

2.4 CCl4不同給藥途徑對肝組織形態的影響

圖1顯示，腹腔注射CCl4高、中、低劑量均能造成小鼠肝損傷，肝損傷較為嚴重，損傷區域呈帶狀壞死并伴有嚴重的脂肪性病變，且各組間區別不明顯。皮下注射CCl4高、中、低劑量均能造成小鼠肝損傷，其中CCl4高劑量造成的小鼠肝損傷較為嚴重，損傷區域成帶狀壞死并伴脂肪性病變， CCl4中、低劑量造成小鼠肝損傷與CCl4高劑量相比帶狀壞死較少，多呈小區域肝細胞壞死并伴隨炎細胞浸潤，壞死區域有較多的肝細胞細胞核破裂溶解。灌胃CCl4高、中、低劑量也能造成小鼠肝損傷，CCl4高、中、低劑量誘導肝損傷呈肝細胞變性，其中高劑量誘導的肝損傷區域有大量的肝細胞壞死并伴肝細胞脂肪樣變性，損傷區域有大量的炎性細胞浸潤，周圍的肝細胞細胞核固縮、溶解。中劑量誘導的肝損傷區域有極少量的肝細胞壞死并伴有肝細胞脂肪樣變性，損傷區域有炎性細胞浸潤，周圍的肝細胞核固縮，溶解。低劑量誘導的肝損傷程度較輕，僅有部分區域的肝細胞細胞核固縮、溶解伴有少量的炎性細胞浸潤。

A.正常組；B.腹腔注射CCl4高劑量組；C.腹腔注射CCl4中劑量組；D.腹腔注射CCl4低劑量組；E.皮下注射CCl4高劑量組；F.皮下注射CCl4中劑量組；G.皮下注射CCl4低劑量組；H.灌胃CCl4高劑量組；I.灌胃CCl4中劑量組；J.灌胃CCl4低劑量組

3 討論

CCl4引起肝細胞損傷時，破壞膜的結構，肝細胞內的多種酶可透過肝細胞膜到肝竇狀隙進入血液，使血中的多種酶活性增高[7]。ALT與AST主要分布在肝臟的肝細胞內。肝細胞壞死時ALT和AST活性升高。其升高的程度與肝細胞受損的程度相一致，是目前最常用的肝功能指標[8]。AST和ALT在肝細胞分布不同，其中ALT主要分布在肝細胞漿，AST主要分布在肝細胞漿和肝細胞的線粒體中。急性肝炎和慢性肝炎輕型，雖有肝細胞的損傷，肝細胞的線粒體仍保持完整，故釋放入血的只有存在于肝細胞漿內的ALT，主要表現為ALT升高。重型肝炎和慢性肝炎的中型和重型，或肝硬化、肝癌，肝細胞線粒體遭到嚴重破壞，AST從線粒體和胞漿內釋出，表現AST活性明顯升高[9，10]。本研究顯示急性、亞急性CCl4肝損傷組的ALT與正常組相比存在顯著性差異，而AST與正常組相比并無顯著性差異。說明CCl4急性和亞急性組的肝細胞雖然受到嚴重破壞，但是肝細胞中的線粒體并沒有受到嚴重的破壞。而CCl4所致慢性肝損傷模型不僅能升高ALT,并且升高AST,濃度存在依賴性，說明肝細胞不僅細胞膜被破壞，肝細胞中的線粒體也受到了破壞，造模相對穩定，因此長時間灌胃CCl4最有利于小鼠慢性肝損傷模型的復制。

[1]陳雪龍．實驗性肝損傷動物模型的研究進展[J]. 實驗動物科學,2008,25(3)：47-49.

[2]徐叔云，卞如濂，陳修．藥理實驗方法學·3版[M]. 北京：人民衛生出版社，2002：1 346-1 347.

[3]Brattin WJ，Glende EA，Recknagel RO，et a1．Pathological meehanisms in carbon tetrachloride hepatotoxieity[J]. Free Radic Biol Med，2005，17(1)：27-38.

[4]蘭鳳英,何靜春,趙穎,等.郁金抗四氯化碳致小鼠急性肝損傷的作用[J]. 中國康復理論與實踐,2007,13(5):444-445.

[5]寧康健,呂錦芳,姜錦鵬，等.黃芩苷對小鼠四氯化碳肝損傷保護作用的研究[J]. 中國中醫藥科技,2011,18(2):120-122.

[6]劉東,蔣毅萍,陳志良.甘草甜素與苦參堿聯合用藥對四氯化碳所致小鼠急、慢性肝損傷的保護作用[J]. 中藥材,2007,30(5):581-583

[7]王宇,程薇波,張銀柱,等.10%四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的研究[J]. 現代預防醫學,2006,33(5):701-703.

[8]畢明剛,周娟,許揚,等.巖黃連總堿提取物對小鼠免疫性肝損傷的改善作用[J]. 中國藥理學與毒理學雜志,2009,23(1):39-44.

[9]王曉麗,鄭立運,張艷,等.鹽酸千金藤堿對急性肝損傷小鼠保護作用的研究[J].中華中醫藥雜志,2009,24(10):1 384-1 387.

[10]沈洪,朱路佳,薛潔,等.生姜油不同部位對小鼠急性肝損傷保護作用的比較[J]. 中成藥,2008,9(30):8-10.