1株分離自西沙諾尼果原漿細菌菌株CICC 10881的鑒定及生物學特性研究*

張欣，劉洋，姚粟，曹艷花，翟磊，蘇姣姣，譚望橋，程池

1(中國食品發酵工業研究院中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

2(海南諾尼生物工程開發有限公司，海南?？?，570125)

諾尼(Morinda citrifolia L.)，又稱為海巴戟天，是一種生長于熱帶、亞熱帶的茜草科植物，原產于亞洲、澳大利亞及一些太平洋島嶼，在我國主要分布于海南西沙群島。諾尼的食用歷史悠久，營養豐富且具有非常廣泛的保健功效和藥用價值，如抗菌消炎、增強免疫力等［1-5］。諾尼果原漿是西沙諾尼果經洗凈、放置后熟、打漿，未經過濾和滅菌而制成的。因其最大限度地保留了諾尼的營養成分，因而更有利于人體的吸收，并發揮其應有的保健功效。

本研究以西沙諾尼發酵果原漿中分離篩選得到的1株優勢菌株CICC 10881為研究對象，利用16S rRNA和16S-23S rRNA基因條形碼序列(Bar-Coding)對其進行分類學鑒定，并對其生長條件進行初步研究，旨在為進一步了解其生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株分離自西沙諾尼發酵果原漿樣品(由海南諾尼產業園開發有限公司提供)，并保藏于中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)，保藏編號為CICC 10881。

1.1.2 培養基

LB、NB、R2A、MRS、TSB 培養基均購自北京陸橋技術有限責任公司。

DSM989培養基(蛋白胨 0.5%、酵母浸粉0.5%、葡萄糖0.5%、MgSO4·7 H2O 0.1%);GY培養基(酵母浸粉1%、葡萄糖5%)。

1.1.3 主要試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP、DL 2000 Marker均購自天根生化科技有限公司;GoldView購自北京塞百盛基因技術有限公司;溶菌酶購自Sigma公司、蛋白酶K購自Merk公司;API 20E、API 50CH試劑條購自法國梅里埃公司;其他化學藥品均為進口分析純產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株分離

在無菌條件下吸取10 mL諾尼發酵果原漿于盛有90 mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩混勻。采用梯度稀釋法制備10-2～10-6的系列稀釋液，分別涂布到MRS培養基中置于30℃下培養48 h。挑取單菌落轉接到新鮮的MRS斜面培養后于4℃保藏。

1.2.2 形態學觀察

將供試菌株接種于MRS固體培養基，置于30℃培養48 h后，觀察其在MRS培養基上的菌落形態特征;并利用光學顯微鏡及電子顯微鏡進行菌體形態特征觀察［6］。

1.2.3 生理生化特征API檢測

采用API 20E及API 50CH試劑條對CICC 10881的酶活性、碳源利用及其產酸情況等生理生化特征進行檢測，具體操作方法按試劑條使用說明書。

1.2.4 16S rRNA基因序列分析

利用細菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen公司)提取菌株CICC 10881基因組DNA。采用劉洋等［7］的方法以基因組DNA為模板，擴增16S rRNA基因序列并用ABI 3700基因測序儀測序。測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。測序結果在EzBioCloud數據庫中進行比對［8］，用CLUSTAL W對CICC 10881及其若干近緣種16S rRNA基因序列進行多序列比對［9］，并利用N-J法通過MEGA 5軟件進行系統發育分析［9］。

1.2.5 16S-23S rRNA基因序列分析

以菌株CICC 10881基因組DNA為模板，利用16S-23S rRNA基因序列的特異性引物及條件進行PCR擴增［10-11］。產物用ABI 3700基因測序儀測序，測序得到的結果在GenBank數據庫中進行比對。

1.2.6 培養條件研究

1.2.6.1 培養基對菌株CICC 10881生物量的影響

將菌株分別接種于LB培養基、營養肉湯培養基、R2A、DSM989、MRS、TSB 培養基中，30℃ 200 r/min振蕩培養24 h，取1 mL培養液12 000 r/min離心5 min，棄上清液，用200 μL無菌水重懸后，測定600 nm處的吸光度值，確定最佳培養基。

1.2.6.2 溫度對菌株CICC 10881生物量的影響

將菌株接種于 MRS培養基中，分別在25、30、35、42℃，轉速200 r/min下振蕩培養24 h后，分別取1 mL培養液12 000 r/min離心5 min，棄上清液，用200 μL無菌水重懸后，測定600 nm處的吸光度值，確定最佳溫度。

1.2.6.3 初始pH值對菌株CICC 10881生物量的影響

將MRS培養基初始pH值分別調整至4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，在 30℃，轉速200 r/min 下振蕩培養24 h后，分別取1 mL培養液12 000 r/min離心5 min，棄上清液，用200 μL無菌水重懸后，測定600 nm處的吸光度值，確定培養基最佳pH值。

2 結果

2.1 形態學觀察

菌株CICC 10881在MRS培養基上菌落較小，呈淺黃色，圓形，邊緣整齊，表面光滑并凸起(見圖1a);利用光學顯微鏡觀察顯示菌體細胞呈橢圓或短桿狀，革蘭氏陰性，單個或成對排列(見圖1b)。菌體電子顯微鏡觀察菌體呈圓端短桿，長度1.0～1.5 μm，寬度0.6～0.8 μm，掃描電鏡成像效果見圖1c。

圖1 菌株CICC 10881形態學觀察結果Fig.1 Morphological observation of strain CICC 10881

2.2 生理生化結果

菌株CICC 10881的酶活性、碳源利用及其產酸情況等生理生化特征結果詳見表1。結果顯示，菌株CICC 10881接觸酶反應陽性，不液化明膠;能利用D-葡萄糖、D-木糖產酸，不能利用L-阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、淀粉、甘露醇、N-乙酰葡糖胺、蔗糖等碳源物質;生理生化結果符合醋桿菌屬(Acetobacter sp.)的特征。

2.3 16S rRNA基因序列分析

菌株CICC 10881的基因組DNA提取結果見圖2，所提取的DNA片段約為23.1kb，利用引物27f和1492r擴增得到16S rRNA基因全長序列，結果顯示，PCR產物僅有一條帶，大小約為1500 bp(見圖3)。擴增產物經測序及分析處理后，將序列信息提交至GenBank，登錄號為 KJ934259。以 Escherichia coli KCTC 2441T(EU014689)為外群，構建CICC 10881與相關近緣模式菌株的系統發育樹(圖4)。由系統發育分析確定菌株CICC 10881歸屬為醋桿菌屬(Acetobacter sp.)。

表1 CICC 10881生理生化特征API檢測結果Table 1 API test of strain CICC 10881

圖2 CICC 10881基因組DNAFig.2 CICC 10881 genomic DNA

圖3 CICC 10881 16S rRNA基因擴增產物Fig.3 CICC 10881 16S rRNA gene PCR amplication

圖4 CICC 10881 16S rRNA基因系統發育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of CICC 10881 16S rRNA gene

2.4 16S-23S rRNA基因序列分析

以菌株CICC 10881的基因組DNA為模版，利用特異性引物(its1/its2)擴增菌株16S-23S rRNA基因序列，產物經測序及分析處理后，將序列信息提交至GenBank，登錄號為KJ934261。將序列在GenBank中進行Blast比對，與東方醋桿菌(Acetobacter orientalis)的16S-23S rRNA基因序列的相似性為99%，與醋桿菌屬中的其他近緣種的相似性均低于95%。圖5為以Gluconobacter oxydans DSM 3503T(AJ007763)為外群，構建CICC 10881與相關近緣模式菌株的系統發育樹。由系統發育分析確定菌株CICC 10881被鑒定為東方醋桿菌(Acetobacter orientalis)。

2.5 菌株CICC 10881分類鑒定結論

通過形態學觀察，生理生化鑒定，16S rRNA基因序列系統發育分析及16S-23S rRNA基因序列的比對分析，分離自海南西沙諾尼發酵果原漿樣品中的菌株CICC 10881被鑒定為東方醋桿菌(Acetobacter orientalis)。

圖5 CICC 10881 16S-23S rRNA基因序列系統發育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of CICC 10881 16S-23S rRNA gene

2.6 菌株最適生長條件

培養基、初始pH值、溫度對菌株生物量的影響見圖6。菌種在6種培養基中均能生長，NB、TSB、MRS培養基更有利于菌體生長，以MRS培養基為最佳。溫度和初始pH值對菌株生物量的影響很大;30℃時菌體生物量達到最大值，低于30℃，菌體生長緩慢，而超過35℃菌體生長趨于停滯;初始pH值在4.5～6.5菌體均生長良好，pH5.5時菌體量達到最大值，堿性條件菌體生長受到抑制，可見酸性條件下更適宜菌體生長。因此，菌株的最適培養基為 MRS培養基，最適pH 5.5，最適溫度30℃。

3 討論

本文采用多相分類鑒定技術對我國海南西沙諾尼發酵果原漿中的分離菌株CICC 10881進行“種”水平分類地位的鑒定。多相分類的概念最早是由Colwell［12］提出的，綜合利用微生物多種不同信息，包括表型、基因型和系統發育分析，對微生物進行分類的方法，已廣泛應用于微生物分類學研究領域。

本研究利用細菌通用引物27f和1492r對菌株CICC 10881的16S rRNA基因序列擴增和序列測定，利用MEGA 5進行系統進化分析，CICC 10881被鑒定為醋桿菌屬(Acetobacter sp.)。結合形態、培養特征觀察、生理生化特征試驗以及16S-23S rRNA基因序列分析，最終確定CICC 10881為東方醋桿菌(Acetobacter orientalis)。

東方醋桿菌(Acetobacter orientalis)是2002年Lisdiyanti等［13］從印度尼西亞美人蕉花中首次分離到，此外在印尼的水果楊桃和椰子果、以及傳統發酵豆制品天貝中也發現東方醋桿菌的存在。目前，尚未見從諾尼果原漿中分離到東方醋桿菌(Acetobacter orientalis)的報道，國內也沒有該菌種的保藏，該菌尚屬首次在諾尼果原漿中分離獲得，亦是我國首次分離獲得此菌種。本課題組不僅在諾尼發酵果原漿中發現該菌作為優勢菌存在，更重要的是在諾尼果實中也分離到這種內生細菌。因此，推斷該菌是諾尼果實發酵過程中起關鍵作用的一種微生物。本文也對菌株CICC 10881的培養條件進行了研究，與諾尼果原漿的低pH等環境特征一致，其最適培養條件為MRS培養基，最適溫度30℃，最適pH 5.5，這為研究該菌的生物學功能、菌劑的開發以及用于諾尼果發酵工藝的改進等方面奠定基礎。

圖6 培養基(a)、溫度(b)、初始pH值(c)對菌株生物量的影響Fig.6 Effects of medium(a)，temperature(b)and pH(c)on the biomass of the strain

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