傳統農家大醬中耐鹽性乳酸菌的分離與鑒定*

徐鑫，王茜茜，王曉蕊，薛亞婷，烏日娜

(沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽，110866)

大醬是以大豆為主要原材料，利用米曲霉、酵母菌、乳酸菌等微生物，經過幾個月的自然發酵，最終形成的半流動狀態的發酵性食品［1］。大醬又稱黃豆醬、大豆醬、黃醬，我國北方地區稱大醬。其色澤為紅褐色或棕褐色，鮮艷，有光澤;有明顯的醬香和醋香，咸淡適口，呈黏稠適度的半流動狀態。豆醬不僅可以作為調味品，而且富含豐富的營養物質。由于經過發酵，所以極易被人體吸收。事實上，它不單是一種調味品，而且是一種副食品，在人們的日常飲食中占有重要地位，尤其在東北地區，是一種深受廣大人民歡迎的傳統型發酵食品。大豆醬的風味非常獨特，其風味的形成主要是由發酵過程中微生物的生物化學反應引起的，與風味形成有關的微生物群落主要是酵母菌和乳酸菌。

乳酸菌(lactic acid bacteria)是一類革蘭氏陽性，過氧化氫酶反應陰性的桿菌或球菌，它不形成芽孢、不運動，能發酵碳水化合物產生50%以上乳酸的一類細菌的總稱［2］?；谛螒B學、不同生長溫度、葡萄糖發酵方式、產生乳酸的構型、酸或堿的耐受性以及高鹽濃度下的生長能力對乳酸菌菌屬進行分類。目前，乳酸菌在分類學上大致可以分為23個屬，包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、氣球菌屬(Aerococcus)，片球菌屬(Pediococcus)、漫游球菌屬(Vagococcus)、奇異菌屬(Atopobium)、李斯特氏菌屬(Listeria)、真絲菌屬(Eubacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)中的少數種、芽孢乳桿菌屬(Sporolactobacillus)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、四聯球菌屬(Tetragenococcus)、環絲菌屬(Brochothix)、魏斯氏菌屬(Weissella)、糖球菌屬(Saccharococcus)、孿生菌屬(Gemella)、酒球菌屬(Oenococcus)、營養缺陷菌屬(Abiotrophia)［3］。

乳酸菌不僅有利于食品發酵，改善風味，提高營養價值等功能，而且其作為存在人體內的益生菌，還能對人體的生理功能起到有益的調節作用［4］。近年來對乳酸菌的研究表明，乳酸菌有很多特殊的保健功能，如改善腸道功能、產細菌素、抗腫瘤、增強免疫力、抗氧化能力、降低膽固醇、產生相關酶類等有益功能。

乳酸菌發酵食品是一種國內外消費者喜愛的營養保健食品。發酵大醬用的生產菌株是乳酸菌，大醬中含有較高濃度的鹽，在生產過程中乳酸菌的生長會受到鹽濃度的影響而受到抑制。篩選出專用于發酵大醬的乳酸菌種對于在發酵大醬生產中縮短生產周期、提高食品安全性和穩定產品質量起著關鍵性的作用。

本實驗旨在從農家大醬中篩選出耐鹽性較好的乳酸菌菌株，并采用16S rDNA的方法對該菌株進行鑒定，意在實現農家大醬的安全化、工業化生產，并為構建東北地區乳酸菌菌種資源庫做出貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

農家大醬:采自遼寧沈陽、大連、撫順，本溪共15個樣品。

1.1.2 培養基與試劑配制

MRS培養基配方:葡萄糖20.0 g/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，牛肉浸膏8 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，蛋白胨8 g/L，吐溫·80 1 g/L，酵母粉4 g/L，檸檬酸鈉2 g/L，三水乙酸鈉5 g/L，K2HPO42 g/L，臨用前添加1%CaCO3，121℃高壓滅菌20 min。

10×TE緩沖液:1 mol/L Tris-HCl Buffer(PH:7.4、7.6、8.0)100 mL，0.5 mol/L 的 EDTA 20 mL(pH:8.0)，定容 1L，121℃、20 min 滅菌備用。

1 mol/L Tris-HCL(pH 8.0):稱取121.1g Tris溶于800 mL無菌水中，加濃HCl調pH到8.0，定容至1L，高壓滅菌。

0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)186.1g EDTA-Na·2H2O溶于800 mL無菌水中，需用磁力攪拌器劇烈攪動，用NaOH調pH值到8.0(約20g)，定容至1L，高壓滅菌。

10%SDS:稱取SDS 10g于100～200 mL燒杯中，加80 mL雙蒸水中60℃加熱溶解，用 HCl調 pH至7.2，定容至100 mL，室溫保存。滅菌10 mol/L CTAB(十六烷基三甲基溴化銨):10g CTAB溶于80 mL無菌水中，定容至100 mL，高壓滅菌。

0.7 mol/L NaCl:4.095 g NaCl溶于80 mL無菌水中，定容100 mL，高壓滅菌。

酚、氯仿、異戊醇:Tris-飽和酚從4℃冰箱中取出，上層為保護液，取下層黃色酚相使用。按比例與氯仿、異戊醇混合，放入4℃冰箱存放。

1.1.3 儀器與設備

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠;UV-4802紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司;生物潔凈工作臺，蘇州市華宇凈化設備有限公司;Centrifuge 5418R小型臺式冷凍離心機，(德國)Eppendorf;DNP-9080型生化培養箱、恒溫水浴鍋，上海精宏試驗儀器有限公司;VS-1型渦旋儀，上海瀘西分析儀器廠有限公司;尼康生物顯微鏡，南京江南光電(集團)股份有限公司;ND-100型微量紫外分光光度計，上海美析儀器有限公司;DW-86L486型超低溫保存箱，青島海爾特種電器有限公司;CDS8000型UPV凝膠成像分析系統、PTC-200型梯度基因擴增儀、電泳儀，美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 農家大醬的采樣

將農民家庭以傳統方法制作的大醬，在其發酵容器中充分攪拌后，取20g左右大醬加入封口袋中封存，將收集的樣品放入提前準備好的冰盒內冷卻，間隔一段時間需要更換一次冰袋，使大醬保存在較低溫度狀態下帶回實驗室，然后放入 -20℃冰箱凍存，盡快進行乳酸菌的分離，防止菌體死亡。

1.2.2 乳酸菌的分離純化

稱取1 g大醬樣品，加入含有10 mL生理鹽水的滅菌試管中，按照10倍梯度稀釋法稀釋大醬樣品至10-8g/mL。分別取 10-6g/mL、10-7g/mL、10-8g/mL 3個梯度樣品100 μL，采用涂布法將樣品接種于MRS瓊脂培養基上，將培養皿放入BBL厭氧培養罐中，在罐中加入保險粉以除去氧氣。分別將培養罐置于20、30、37℃ 3個梯度的培養箱中厭氧培養48h。待菌落形成后，用接種環挑取疑似乳酸菌菌落形態的單個菌落，接種于 MRS液體培養基中，置于37℃培養箱中培養24 h。對菌體采用平板劃線法進行純化，仔細觀察菌落形態以及革蘭氏染色后的細胞形態特征，在顯微鏡油鏡下挑選視野清晰且形態典型的菌體，進行拍照記錄，并同時進行過氧化氫酶試驗。凡是革蘭氏染色呈陽性、過氧化氫酶試驗為陰性的菌株，均暫定為乳酸菌，并進一步培養穿刺保存。

1.2.3 耐鹽性乳酸菌篩選

將初步鑒定得到的疑似乳酸菌保存菌株用接種針挑去部分菌體，接種于5 mL已滅菌的MRS培養基中，于37℃培養箱中培養24 h，作為活化1代菌。用移液槍吸取200 μL一代菌接種于5 mL已滅菌的MRS培養基中，于37℃培養箱中培養24 h，作為活化2代菌。以此方法將菌株活化至3代，第3代培養12 h，此時菌株的活性最好。吸取混勻后的3代菌液100 μL分別加入 5 mL NaCl濃度分別為 4%、6%、8%、10%、14%、16%、20%的 MRS液體培養基中，37℃培養24h。培養液用渦旋儀混勻后，以空白MRS液體培養基調零，在波長600 nm處，測OD值。

1.2.4 乳酸菌的生理生化鑒定

取革蘭氏陽性和過氧化氫酶陰性菌落按照東秀珠、蔡妙英［5］的常見細菌系統鑒定手冊方法，對菌株進行生理生化試驗。

1.2.5 分離株的保存

采用真空冷凍干燥法［6］對菌體進行凍干保存。

1.2.6 供試菌液的制備

將采用真空冷凍干燥法凍干保存的菌種，接種于MRS液體培養基中，37℃培養24 h，活化3代。經革蘭氏染色鏡檢確定為純菌后，取第3代MRS液體培養物，12 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，在沉淀中加入5 mL滅菌生理鹽水，12 000 r/min、10 min(4℃)離心洗滌菌體，重復離心洗滌菌體2次。最后加入5 mL滅菌生理鹽水，用渦旋儀振蕩混勻，即為供試菌液。

1.2.7 總DNA的提取

采用優化后的CTAB法［7］提取DNA。

1.2.8 乳酸菌基因組DNA純度檢測

分別取1 μL上述制備的乳酸菌基因組DNA原液，用ND-1000型微量紫外分光光度計檢測乳酸菌基因組DNA的濃度以及在吸光度為260、280時的OD值。

1.3 PCR擴增

1.3.1 擴增引物

16S rDNA擴增引物采用通用引物［8-9］，正向引物為27f(對應于Escherichia coli 8-27位堿基):5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物為 1495r(對應于 Escherichia coli 1495-1515位堿基):5'-GGCTGCTGGCACGTAGTTAG-3'，由上海美吉生物醫藥科技有限公司合成。PCR擴增片段約為1 500 bp。

1.3.2 擴增體系以及循環參數

將上述制備的基因組 DNA作為PCR擴增的模板，采用20μL反應體系(表1)進行 PCR擴增。

PCR反應條件為:95℃ 預變性5 min;95℃ 變性30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 1 min 30 s，循環 24次;72℃ 末端延伸10 min;10℃ 保溫。

1.3.3 PCR產物檢測

預先制備1.0%的瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)，擴增反應完畢后，取5 μL的 PCR產物與 1μL Loading buffer混合，將樣品加樣于瓊脂糖凝膠點樣孔中進行電泳，電壓5 V/cm，電泳液為1×TAE。大約20 min后，電泳結束，紫外燈下觀察。如果 PCR成功，則可見到約為1 500 bp的條帶。

1.3.4 16S rDNA序列測定及分析

將擴增成功的PCR產物用保溫盒(內含冰袋)寄到上海美吉生物醫藥科技有限公司測序，測得菌株16S rDNA基因序列后，將基因序列在NCBI上使用BLAST進行同源性比對，同時從GenBank數據庫中獲得公認標準序列數據，并用MAGE軟件包以Neighbor Join法制作系統發育樹［10］。

表1 PCR擴增體系Table 1 PCR amplification system

2 結果與分析

2.1 農家大醬中乳酸菌的初步鑒定

2.1.1 農家大醬篩選后的菌落形態觀察結果

從15個樣品中分離獲得典型的菌株62株，從沈陽大醬樣品中篩選出14株菌株，按照大醬采集地編號為SY1～SY14;從大連大醬樣品中篩選出16株菌株，按照大醬采集地編號為DL1～DL16;從撫順大醬樣品中篩選出15株菌株，按照大醬采集地編號為FS1～FS15;從本溪大醬樣品中篩選出17株菌株，按照大醬采集地編號為BX1～BX14。菌株在MRS固體培養基上，為白色或乳白色，圓形菌落，表面光滑有光澤，中間凸起，邊緣整齊，如圖1所示。

圖1 5株乳酸菌菌落形態學特征Fig.1 Colony morphological characteristics of 5 LAB strains

2.1.2 農家大醬中乳酸菌初步鑒定結果

對從農家大醬中分離得到的62株疑似乳酸菌菌株進行純化，對純化后菌株進行革蘭氏染色。顯微鏡油鏡下觀察顯示，在這些菌株中有革蘭氏陽性菌36株，包括球狀菌株16株，桿狀菌株20株。結果如圖2所示。

圖2 5株乳酸菌株的革蘭氏染色菌體形態Fig.2 Morphology after gram stain of 5 LAB strains

對36株革蘭氏陽性菌進行過氧化氫酶試驗，發現10株疑似乳酸菌呈陽性反應，另外有26株為陰性反應。通過革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗從62株疑似乳酸菌株中獲得革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的菌株26株，結果見表2。

表2 從農家大醬中分離得到的菌株初步鑒定結果Table 2 Preliminary identification result of the isolated strains from soybean paste

2.1.3 耐鹽性乳酸菌的篩選

在大醬發酵過程中，NaCl含量在8%左右。高濃度的NaCl能夠抑制某些致病和腐敗微生物的生長繁殖，但也會對乳酸菌的代謝活動產生影響［11］。乳酸菌的生長受到抑制，對最終大醬質量有很大影響，所以耐鹽的乳酸菌對大醬品質的好壞起著決定性作用［12］。文中對篩選出的26株疑似乳酸菌在不同 鹽濃度的MRS液體培養基中生長狀況進行研究分析，同時以吸光值變化作為菌株的生長指標，研究其對不同 NaCl濃度的耐受能力，結果見表3。

表3 26株乳酸菌株在不同NaCl濃度下生長情況Table 3 Growth situation of 26 LAB strains under different concentration of NaCl

由表3中數據可以看出，隨著培養基中 NaCl濃度不斷升高，26株乳酸菌的OD600值在逐漸變小。在NaCl濃度為4% 的MRS培養基中，26株乳酸菌基本不受影響，生長狀況良好，OD600值在 0.921～2.176之間;NaCl濃度為6%的MRS培養基中，部分菌株生長狀況受到影響，OD600值在0.312～1.584之間;當NaCl濃度上升到8%時，大部分乳酸菌的生長受到了抑制，其中菌株 SY1-1、SY3-5、SY4-2、DL3-1、DL3-6、DL4-5、FS1-11、FS2-3、FS5-5 的 OD600值相對較高，表明這7株菌有一定的耐受能力;當 NaCl濃度為10%時，只有菌株 SY4-2、DL3-1、DL4-5、FS1-11、FS5-5的 OD600值在0.195以上，依然可以生長;當 NaCl濃度增加到12%時26株乳酸菌OD600值降低較為明顯，菌株 SY4-2、DL3-1、DL4-5、FS1-11、FS5-5 的 OD600值在0.100左右;當 NaCl濃度上升到14% ～20%時，26株乳酸菌生長 OD600值一直維持在0.030～0.060之間，考慮到接種的影響，我們可以初步斷定26株菌幾乎不生長。因此，篩選得到5株具有較高耐鹽能力的乳酸菌，即菌株 SY4-2、DL3-1、DL4-5、FS1-11、FS5-5，這5株菌的耐鹽濃度可以達到12%左右。

2.1.4 生理生化試驗結果

對篩選出的5株疑似乳酸菌菌株進行生理生化試驗，結果見表4。

表4 5株乳酸菌的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of 5 LAB strains

注:“+”為陽性反應;“-”為陰性反應;“(+)”為弱陽性反應;“(-)”為弱陰性反應。

綜上所述，根據菌株的形態學特征并參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版［13］，對5株乳酸菌的生理生化實驗結果進行分析。結果表明，菌株 DL3-1、DL4-5、FS5-5均屬于乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)，菌株SY4-2、FS1-12屬于腸球菌屬(Enterococcus sp.)。

2.2 16S rDNA基因序列同源性分析結果

2.2.1 乳酸菌基因組DNA提取結果

實驗中采用優化后的CTAB法提取供試菌株基因組DNA，分別用ND-1000型微量紫外分光光度計檢測DNA純度及含量?；蚪MDNA檢測結果如表5所示。

表5 基因組DNA檢測結果Table 5 Genome DNA test results

從表5得知，CTAB法提取的基因組DNA濃度最低的是 FS5-5，為 241.5 ng/μL，最高為 SY4-2，為423.5 ng/μL。OD260/OD280值均在1.70附近。說明基因組DNA受到微量蛋白質或酚類物質的影像，但是能滿足后續16S rDNA擴增和測序的需要。

2.2.2 16S rDNA區域PCR擴增檢測結果

用質量分數為1.0%的瓊脂糖凝膠，對5株供試菌株的基因組DNA的PCR擴增產物做瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過凝膠成像分析系統得到5株菌株的16S rDNA PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖，如圖3所示。

從圖3看出，在約1 500 bp處出現熒光條帶，2號菌的條帶稍暗，但并不影響結果。說明PCR擴增成功，能滿足后續16S rDNA測序的需要。

圖3 16S rDNA PCR擴增后的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis map of 16S rDNA amplification products

2.2.3 測序結果及系統發育樹的構建

將PCR擴增成功的DNA樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。測得16S rDNA基因序列分析顯示，菌株SY4-2的16S rDNA基因序列長度有1 379bp核苷酸;菌株DL3-1的16S rDNA基因序列長度有1 417bp核苷酸;菌株DL4-5的16S rDNA基因序列長度有1 419bp核苷酸;菌株FS1-11的16S rDNA基因序列長度有1 413bp核苷酸;菌株FS5-5的16S rDNA基因序列長度有1 432bp核苷酸。將測序獲得的基因序列與NCBI中相關乳酸菌菌株的16S rDNA基因序列進行同源性分析，并用MEGA軟件以Neighbor Join法繪制系統發育樹［14］。結果如圖4所示。

如圖4所示，從總體上可將這10株乳桿菌分為兩大群，即 FS5-5、Lactobacillus plantarum YML007、Lactobacillus plantarum IMAU32388、DL4-5、DL3-1 和Lactobacillus plantarum P10為第一群，其余乳桿菌菌株組成第二群。第一群中，菌株FS5-5、DL4-5、DL3-1與 Lactobacillus plantarum YML007、Lactobacillus plantarum IMAU32388處于同一分支，同源性較高。在第二群中，菌株FS1-11與所在分支的Enterococcus faecium S4-4系統位置最近，同源性可以達到99%，還有Enterococcus faecium和SY4-2與其在同一分支。綜上所述，我們可以鑒定菌株DL3-1、DL4-5、FS5-5為植物乳桿菌，SY4-2、FS1-12為屎腸球菌。

3 結論與討論

3.1 結論

本研究采用傳統微生物的分離培養方法對農家大醬中的乳酸菌進行了分離。利用NaCl作為外界脅迫條件，對篩選出的乳酸菌進行耐鹽性實驗，挑選出5株耐鹽性較好的菌株。對這5株菌提取DNA，并通過PCR技術將其擴增，采用16S rDNA技術對這5株菌進行鑒定。

圖4 菌株的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain

(1)從15個樣品中分離獲得典型的菌株62株，菌株在MRS固體培養基上，為白色或乳白色，圓形菌落，表面光滑有光澤，中間凸起，邊緣整齊。通過革蘭氏染色與過氧化氫酶試驗，從62株疑似乳酸菌的菌株中篩選出革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的乳酸菌菌株26株。

(2)利用NaCl作為外界脅迫條件，當 NaCl濃度增加到 12%時，菌株 SY4-2、DL3-1、DL4-5、FS1-11、FS5-5的 OD600值在0.100左右。與其他菌株相比，這5株菌具有較好的耐鹽特性。耐鹽濃度可以達到12%左右。對耐鹽性較好的5株菌株進行生理生化實驗，根據菌株的形態學特征并參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版［13］，對5株乳酸菌的生理生化實驗結果進行分析。結果表明，菌株 DL3-1、DL4-5、FS5-5均屬于乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)，菌株 SY4-2、FS1-12屬于腸球菌屬(Enterococcus sp.)。

(3)對這5株菌提取DNA并經過PCR擴增，最后采用16S rDNA的方法進行鑒定。結果顯示5株菌中，DL3-1、DL4-5、FS5-5 為植物乳桿菌，SY4-2、FS1-11為屎腸球菌。

3.2 討論

大醬作為東北地區典型的發酵性食品而受到人們的歡迎。隨著科技的發展，工業化生產的市售大醬進入人們的視野，但是，人們還是喜歡自家手工制作的農家大醬，因為其中有特殊的味道。工業化生產的市售大醬由于需要滅菌而使大醬中的微生物含量較少，本實驗采用農家大醬作為原材料也是出于這方面原因。大醬中含NaCl濃度大約8%左右，乳酸菌長時間生長在鹽濃度下會發生應激反應，從而使自己更有利的存活下去，這樣乳酸菌會對NaCl具有一定程度的耐受性，也更有利于篩選出耐鹽性較好的乳酸菌。在大醬的發酵過程中，耐鹽性較好的乳酸菌會更適應大醬中的鹽環境，從而更好地生長，可以大大縮短大醬的生產周期，穩定產品的質量。

對于基因組的提取，目前采用較多的2種方法為試劑盒法與CTAB法。試劑盒法提取基因組DNA，DNA濃度和純度較高，提取效率高，可直接用于PCR擴增、測序等，但造價相對昂貴些，適用于少量DNA樣品的提取。CTAB法提取基因組DNA，出于安全等多方面因素的考慮，可能在一定程度上影響提取DNA的純度以及穩定性而使DNA中含有少量的蛋白質、RNA等雜質，但是不會影響后續試驗的進行，而且此方法造價低，能滿足一般分子生物學實驗的需要。為了更好地獲得DNA，一方面考慮盡量去除雜質、蛋白和脂類，CTAB在高離子強度的溶液中可以與蛋白質、多糖等物質結合，而不與DNA結合，這里還可以添加一些還原劑比如β-巰基乙醇來避免褐化物質對DNA的影響;另一方面考慮加強DNA的沉淀效果，氯仿-異戊醇可以進一步使蛋白質變性分層并去除脂類，最后用低溫預冷的無水乙醇或者異戊醇來沉淀DNA。

本文從農家大醬中獲得了耐鹽性較好的乳酸菌菌株，但應用菌株對產品品質的提升還需深入研究。下一步工作應該圍繞著應用耐鹽乳酸菌的發酵性能來改善農家大醬產品品質。同時耐鹽性乳酸菌之所以能夠耐鹽，它的耐鹽機理是什么也是要研究的重點。乳酸菌作為益生菌的最大群體，其分布較為廣泛，性能優良的乳酸菌更是人們所需要的。它不僅可以提高食品的品質，而且可以促進人體健康，為人類做出貢獻。

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