4種嗜鹽古菌發酵的龍頭魚魚露特性比較*

高瑞昌，陸文婷，劉向東，崔恒林，袁麗

(江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江，212031)

魚露(fish sauce)，又稱魚醬油，是閩菜、潮州菜和東南亞料理中常用的調味料之一。它是以小魚蝦為原料，利用魚體所含的蛋白酶和其他酶以及在多種微生物共同參與下，對原料魚中的蛋白質、脂肪等成分進行發酵釀制而成［1］。傳統的天然發酵過程非常緩慢，這是限制其產量和規模的主要因素。某些嗜鹽古菌作為外源添加物可以加快魚露的發酵，其一，它與魚中的微生物群落在發酵過程中起協同作用［2］;二，它能產生胞外蛋白酶，在高鹽高滲的環境下催化蛋白質的水解，加速魚露的發酵，而且不會有其他速釀方法產生不良風味等問題［3］。本文利用前期篩選出的4種具有良好產蛋白酶活性的嗜鹽古菌進行魚露發酵，通過對魚露發酵過程中產生的亞硝酸鹽、總胺、氨基酸態氮和揮發性風味物質等指標進行評價，以期挑選出更加適宜發酵魚露的菌種，為魚露的快速發酵提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

實驗材料:TBN4-Halalkalicoccus tibetensis，TNN48-Halogranum rubrum，RO2-11-Halogranum rubrum，9738-Halomicrobiummukohataei，江蘇大學食品與生物工程學院保藏菌種(課題組前期從臺南鹽田篩選，鑒定);龍頭魚，購自鎮江歐尚超市。

實驗設備:PHS-3C型pH計(LIDA)、LRH系列生化培養箱，上海一恒科技有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司;電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司;722N可見分光光度計，上海精科;HP6890/5973氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司;頂空固相微萃取器SPMC-57328U，美國Agilent公司;自動氨基酸分析儀，德國sykamS433D/S433。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚露的制作

利用購自歐尚超市新鮮的龍頭魚，去除內臟，切碎，并加入20%的食鹽，混勻，分別加入109CFU數量級 TBN4，TNN48，9739，RO2-11 菌種，并以未加入任何菌種含有20%食鹽的魚肉作為對照組，放置于37℃恒溫培養箱進行發酵。發酵4.5月后，測定各魚露的指標含量，并與新鮮原料魚相比較。

1.2.2 理化指標的測定

氨基酸態氮(AAN)含量:甲醛滴定法［4］;總酸的測定，參考文獻［5］;可溶性總氮(TSN):凱式定氮法［4］;組胺含量的測定，參考文獻［6］。

亞硝酸鹽含量:分光光度法［7］。稱取經絞碎并混合均勻的樣品20 g于100 mL燒杯中，加硼砂飽和溶液40 mL，攪拌均勻后，以70℃以上的熱水100～150 mL將樣品全部洗入250 mL容量瓶中，放入沸水浴中加熱15 min，取出冷卻后，邊轉動容量瓶邊加入亞鐵氰化鉀溶液(106g/L)20 mL，搖勻后，再加入醋酸鋅溶液(220 g/L)20 mL，以沉淀蛋白質。然后，加水至刻度，混勻，放置30 min后，棄去上層脂肪，清液用濾紙過濾，棄去初濾液5～10 mL，濾液備用。吸取上述濾液40 mL于50 mL容量瓶中，同時吸取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL NaNO2標準液(相當于 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg的NaNO2)分別置于50 mL容量瓶中，各加水至25 mL處。在樣品管及標準管中分別加入0.4%對氨基苯磺酸溶液(4 g/L)4 mL，混勻后靜置3～5 min，然后又在各管及標準管中分別加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液(2 g/L)2 mL，加水至刻度，搖勻，靜置15 min后，用1 cm的比色皿，以零管調節零點，于波長538 nm處，測吸光度，繪制標準曲線并查出待測液的亞硝酸鹽含量。

亞硝酸鹽(以NaNO2計)含量計算:

式中:X1—試樣中NaNO2的含量，mg/kg;A1—測定用樣液中NaNO2的質量，μg;m—試樣質量，g;V1—測試用樣液體積，mL;V0—試樣處理液總體積，mL。

總胺值的測定［8］:在250 mL錐形瓶中，加入適量1～5 g試樣(視胺值大小而定，稱準至0.000 2 g)，然后加入50 mL無水乙醇，煮沸1 min，除去游離氨，冷卻至室溫，加入5滴0.2%溴酚藍指示劑，用0.5 mol/L鹽酸異丙醇溶液滴定至黃色為終點?？偘穬r(KOHmg/g)計算:

式中:C—HCl標準溶液濃度，mol/L;V—HCl標準溶液的用量，mL;M—試樣質量，g;56.11—每摩爾KOH相當的質量，g。

揮發性鹽基氮(TVB-N)含量的測定:微量擴散法［6］。稱取10 g樣品于錐形瓶中，加100 mL水，不時振搖，浸漬30 min后過濾，濾液置于冰箱中備用。將水溶性膠涂于擴散皿的邊緣，在皿中央內室加入1 mL 2%硼酸吸收液及1滴0.2%甲基紅乙醇溶液和0.1%亞甲藍水溶液等體積混合指示液。在皿外室一側加入1.00 mL樣液，另一側加入1 mL飽和碳酸鉀溶液，注意勿使2滴接觸，立即蓋好;密封后將皿于桌面上輕輕轉動，使樣液與堿液混合。將擴散皿置于37℃溫箱內放置2h，揭去蓋，用0.01 mol/L HCl標準溶液或硫酸標準溶液滴定，終點呈藍紫色。同時做試劑空白試驗。

式中:X—樣品中揮發性鹽基氮的含量，mg/100g;V1—測定用樣液消耗HCl或H2SO4標準溶液體積，mL;V2—試劑空白消耗HCl或H2SO4標準溶液體積，mL;N—HCl或H2SO4標準溶液的摩爾濃度，mol/L;m—樣品質量，g;14—1 mol/L HCl或 H2SO4標準溶液1 mL相當氮的質量，mg。

1.2.3 游離氨基酸組成的測定

(1)魚露樣品脫鹽

由于在制作魚露時，加入20%鹽，魚露樣品內鹽含量過高，在測游離氨基酸組成時需先進行脫鹽。

在一定量的魚露樣品中加入3%(重量)活性炭，于80℃下脫色30 min，趁熱過濾得濾液濃縮至干為固形物，將固形物置于250 mL圓底燒瓶中內加一定量冰乙酸，小火加熱，回流并不斷攪拌，待固形物不再溶解后，將溶液趁熱過濾并將濾液減壓蒸餾除去溶劑可得混合氮基酸或向濾液內滴加8～10倍體積丙酮，則氨基酸會立即析出，過濾［9］。

(2)自動氨基酸儀分析［10］

稱取一定量樣品，加入9倍體積1%的磺基水楊酸，10 000 r/min 離心 15 min，取上清液用 0.22 μm濾膜過濾，供上機使用。

1.2.4 揮發性風味物

(1)頂空固相微萃取(SPME)方法［11-12］

先要將頂空固相微萃取頭插入氣相色譜進樣口，高溫老化至無雜峰。將5 mL魚露樣品放入15 mL封閉瓶中于50℃加熱平臺上保持10 min，將 SPME萃取頭插入瓶中，使之與樣品液面保持一定的距離，磁力攪拌速度為 100 r/min，50℃條件下萃取 40 min，與瓶內氣體達到飽和。

(2)GC-MS參數條件

色譜柱:毛細管色譜柱 DB-WAX(60 m×0.25 mm，0.25 μm);進樣口溫度 250℃，SPME 插入進樣孔解吸 3 min;程序升溫:始溫 40℃，保持 4 min，以5℃/min升溫至90℃，再以10℃/min升溫至230℃，保持10 min;載氣(He)流速 1.0 mL/min，不分流。質譜條件:接口溫度250℃，離子源溫度200℃，電子能量70 eV，質量掃描范圍33～450 amu。

2 結果與分析

2.1 龍頭魚的基本成分

龍頭魚去除內臟后，含有10.6%的蛋白質，1.2%的脂肪。由此可看出，龍頭魚含有較豐富的蛋白質和較低的脂肪含量，適合魚露的發酵。

2.2 魚露中氨基酸態氮含量

氨基酸態氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量。該指標越高，說明魚露中的氨基酸含量越高，鮮味越好。由圖1可知，5種魚露的氨基酸態氮含量在發酵4.5個月后呈上升趨勢。未發酵時氨基酸態氮含量為0.02 g/100 mL，發酵4.5月后，接種TBN4的魚露氨基酸態氮含量最高，達到0.458 g/100 mL，對照組其次，為0.447 g/100 mL，這與龍頭魚肌肉中的內源性蛋白酶密切相關。而在發酵過程中，嗜鹽菌一方面可以分解蛋白質產生氨基酸，但另一方面也可能利用氨基酸充當氮類營養物質，從而使得前期生成的氨基態氮含量又進一步降低。TBN4菌株的體現最為明顯。通過Duncan法進行方差分析可知，TBN4與其他嗜鹽菌發酵的魚露氨基酸態氮含量存在顯著性差異(P＜0.05)，含量最高。

圖1 魚露發酵4.5個月后氨基酸態氮含量Fig.1 Amino nitrogen content of fish sauce fermented for 4.5 months

2.3 魚露中亞硝酸鹽含量

發酵4.5月后，對照組亞硝酸鹽含量3.964 mg/kg，接種TBN4魚露亞硝酸鹽含量3.189 mg/kg，接種TNN48魚露亞硝酸鹽含量3.542 mg/kg，接種9738魚露亞硝酸鹽含量3.085 mg/kg，接種RO2-11魚露亞硝酸鹽含量2.607 mg/kg，所有發酵樣品中的亞硝酸鹽含量微量，可忽略不計(國家標準為50 mg/kg)?？赡茉蛞?，高鹽環境能夠有效地抑制其他雜菌的生長，使得生產亞硝酸鹽的雜菌不能生長，一定程度上減少了亞硝酸鹽的產生;原因二，TBN4、TNN48、9738和RO2-11在生長過程中均能消耗亞硝酸鹽，尤其RO2-11具有較強的消耗亞硝酸鹽能力，見圖2。

為驗證推測，實驗進一步在嗜鹽菌液體培養基中加入一定量的亞硝酸鹽，置于37℃恒溫培養箱中培養，結果如圖2所示。數據顯示4種嗜鹽古菌均具有消耗亞硝酸鹽的特性，特別是RO2-11具有較強的轉換能力，在培養1周后，培養基中的亞硝酸鹽基本就被消耗掉，這一特性對解決傳統魚露發酵過程中容易產生亞硝酸鹽的問題將具有很好的應用前景。

圖2 培養基中亞硝酸鹽含量的變化Fig.2 Changes of the medium in the nitrite content

2.4 魚露中總胺含量

由圖3可知，5組樣品在發酵4.5個月后總胺含量較原料魚大幅度地下降，其中接種TBN4的魚露中最低，為10.53 mgKOH/g，對照組的總胺含量最高，為12.32 mgKOH/g。原料魚總胺含量高，可能是因為魚中含有豐富的蛋白質，尚未被發酵。對照組和接種嗜鹽菌的魚露中具有高鹽環境，可以抑制雜菌生長，避免腐敗使總胺含量較低。在接種嗜鹽菌的各魚露中，總胺含量相差不大(P＜0.05)。就總胺的含量降低而言，這4種嗜鹽菌均適合發酵魚露。

圖3 魚露發酵4.5個月總胺含量Fig.3 Total amine content of fish sauce fermented for 4.5 months

2.5 魚露中總酸含量

總酸含量的變化可能因為是發酵過程中微生物產生的乳酸和產生的揮發性鹽基氮酸堿相互作用，最終動態平衡［13］。由圖4可知，發酵4.5個月后，各種魚露的總酸均呈上升趨勢。原料魚由于未發酵產生酸類物質，因而總酸含量很低。而對照和4種嗜鹽古菌發酵魚露的總酸含量均顯著高于原料魚(P＜0.05)。其中，接種TBN4魚露中總酸含量最少(P＜0.05)，為3.32 g/kg，其他魚露的總酸含量均超過4.1 g/kg?？偹岷可仙赡芤驗槭窃诎l酵過程中，蛋白質分解產生游離氨基酸均會使得酸度升高，而同時如圖3和圖5所示，發酵樣品中胺類物質和呈堿性的揮發性鹽基氮以及雜菌產生的氨類物質的含量都非常少［14］，使總酸被中和的量也較少，因此在發酵過程中總酸含量是呈上升趨勢。

圖4 魚露發酵4.5個月后總酸含量Fig.4 Total acid content of fish sauce fermented for 4.5 months

2.6 魚露中揮發性鹽基氮含量

在魚露發酵4.5個月后，測定各組樣品的揮發性鹽基氮含量，結果如圖5。

圖5 發酵4.5個月后揮發性鹽基氮含量Fig.5 Content of volatile basic nitrogen of fish sauce fermented for 4.5 months

揮發性鹽基氮(TVB-N)是指動物性食品由于酶和細菌的作用，在腐敗過程中，使蛋白質分解而產生氨以及胺類等堿性含氮物質。由圖5可看出，原料魚揮發性鹽基氮含量為0.040 g/100 g，發酵4.5個月后，各種魚露的揮發性鹽基氮的含量相比未發酵時，均有不同程度的上升(P＜0.05)，而一般魚露揮發性鹽基氮含量要求不高于0.25 g/100g，因此無論是對照組還是接菌組中的揮發性鹽基氮的含量都遠遠低于該值。對照組TVB-N含量上升可能是由于在發酵過程中，在雜菌的作用下產生少量的揮發性鹽氮。而在接種嗜鹽古菌的魚露中，由于嗜鹽古菌的存在，能夠有效的抑制雜菌的產生，能相對地減少鹽基氮的產生。接種TBN4魚露中揮發性鹽基氮含量的增多，可能是因為TBN4具有良好的蛋白酶活力，后期隨著酶的水解作用，氨基酸含量增加的同時也存在異常發酵即蛋白質酸?。?2］，氨基酸再進一步分解為氨、三甲胺等揮發性鹽基含氮化合物［15］。

2.7 魚露中可溶性總氮含量

在魚露發酵4.5個月后，測定各種魚露的可溶性總氮含量，見圖6。

圖6 發酵4.5月后可溶性總氮含量Fig.6 Total soluble nitrogen content of fish sauce fermented for 4.5 months

可溶性總氮(TSN)能反映微生物群體利用氮源發酵情況，是反映魚體蛋白質被分解程度的指標，主要包括游離的氨基酸態氮、小分子肽氮及可溶性蛋白氮等［14］。由圖6可知，龍頭魚經過發酵4.5個月后，可溶性總氮含量比原料魚有較顯著地增加，但是對照和接入嗜鹽古菌的樣品相差不大。未發酵時，魚體的可溶性總氮含量為0.02 g/100mL，接種9738魚露的可溶性總氮含量為0.93 g/100mL，接種TBN4溶性總氮含量為1.13 g/100mL，而對照組魚露可溶性總氮含量為1.09 g/100mL。對照組中可溶性總氮含量上升可能是因為內源性蛋白酶分解蛋白質造成的。而接種嗜鹽古菌的魚露可能是因為具有產蛋白酶能力的嗜鹽古菌能將蛋白質分解為氨基酸及肽類物質，使得可溶性總氮含量上升。但同時嗜鹽古菌也可能利用可溶性氮充當營養物質，使可溶性總氮又進一步降低。而接菌種的樣品中，TBN4魚露中可溶性總氮含量最高(P＜0.05)，可能是因為TBN4具有良好的蛋白酶活力，同時也可能是該菌株對產生的可溶性氮的消耗能力小于其他3株菌。

2.8 魚露中組胺含量

在魚露發酵4.5個月后，測定各種魚露的組胺含量，見圖7。

圖7 發酵4.5月后組胺含量Fig.7 Histamine content of fish sauce fermented for 4.5 months

食物中的組胺產生主要是由于幾種細菌激發組氨酸的脫羧酶活性［16］。若組胺被人體吸收，進入免疫系統，可能會引發過敏現象。由圖7可知，發酵4.5個月后，各種魚露內的組胺含量均比未發酵時的組胺含量高。據孫國勇等［17］報告，在魚露前期發酵過程中，組胺含量開始會有所升高，而后下降。本實驗顯示原料魚組胺含量為2.81 mg/100 g(國家標準為50 mg/100 g)，可忽略不計。對照組中組胺含量最高，達到87.6 mg/100 g，遠高于原料魚(P＜0.05)。發酵4.5月后，接種TBN4魚露中的組胺含量最低，為2.43 mg/100 g顯著低于對照組和其他菌種發酵樣品(P＜0.05)。而其他3株古菌的組胺產生量也顯著低于對照組(P＜0.05)。原料魚組胺含量低，可能是因為組胺分解酶活性與鹽度有關［16］，20%鹽會降低組胺分解活力。而嗜鹽古菌可能具有降解組胺的能力［16］，且 TBN4＞ RO2-11＞TNN48＞9738。

2.9 魚露發酵后游離氨基酸的組成

在魚露發酵4.5個月后，測定各種魚露的游離氨基酸組成，如表1。

游離氨基酸的組成雖然不能體現某種特殊風味，但卻是形成某種特殊風味的基礎，氨基酸的組成對風味的形成有重要的影響［18］。纈氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和谷氨酸為魚露鮮味氨基酸，而賴氨酸能影響魚露的滋味［19］。由表1可知，各魚露中游離氨基酸組成種類豐富，為人體提供了大量的必需氨基酸，具有豐富的營養價值［20］。其中，接種RO2-11魚露中所含游離氨基酸含量最低，為16.294 g/100mL，必需氨基酸和鮮味氨基酸組成較其他魚露含量低，賴氨酸含量也僅為2.179 g/100mL。接種TBN4和9738魚露中所含游離氨基酸含量較高，分別為29.226 g/100mL和29.927 g/100mL，必需氨基酸和鮮味氨基酸組成較其他魚露含量高，賴氨酸含量分別為3.160 g/100mL和3.113 g/100mL。與對照組相比，接種嗜鹽菌的魚露中含有天冬酰胺和半胱氨酸，天冬酰胺具有降血壓的功效，半胱氨酸對廣泛的毒物具有解毒功效。由此可見，利用TBN4和9738發酵魚露能夠得到全面豐富的氨基酸，并且必需氨基酸和鮮味氨基酸含量高，是理想的發酵劑。

表1 各魚露游離氨基酸組成 g/100mLTable 1 Free amino acid composition of each fish sauce

2.10 魚露揮發性風味物

在魚露發酵4.5個月后，測定各種魚露的揮發性風味物，如表2。

各魚露中均含有烷烯類物質，但烴類化合物大多數分子質量較大且閾值也較高，一般不能成為魚露氣味的主要貢獻體。魚露中醇類物質含量較少，但醇類物質閾值一般偏高(1.5 mg/L)，對魚露的風味影響較小，但適量的醇類物質能提高魚露的風味。研究表明，酮類物質與魚露干酪味的形成有關，但同樣也因為其閾值較高，對魚露風味的影響較小。據研究有機酸能夠促進海鮮風味物質的釋放［14］。接種TNN48的魚露酸類物質含量最高，占總量的26.6%，9738和RO2-11其次，含量為11.11%和13.62%。雖然含硫化合物含量較低，但因為其閾值也較低，故對于魚露特殊風味的產生也有較大作用。然而只有接種TBN4的魚露中檢測到二甲基二硫和二甲基三硫的存在。其他類揮發性風味物質中主要含有含氮化合

物，是氨基酸和糖類經美拉德反應而產生的具有肉香的化合物，主要為呋喃和咪唑［14］，而在接種TBN4的魚露中未檢測到含氮物質的存在。

表2 各魚露揮發性風味物質Table 2 Volatile flavor compounds of each fish sauce

3 結論

利用嗜鹽古菌發酵，一方面促進了風味物質的產生，另一方面又能夠減少亞硝酸鹽和組胺等有害物質的產生。在4種嗜鹽菌發酵的魚露中，接種TBN4的魚露中氨基酸態氮、可溶性總氮含量、揮發性風味物質總量最高，游離氨基酸含量豐富，而對人體健康會產生不良影響的組胺的含量最低;接種9738的魚露中氨基酸態氮含量最高;接種RO2-11的魚露揮發性風味物質總量較高，有害物質組胺的含量較低。因此可考慮使用TBN4單獨發酵和9738、RO2-11與TBN4混合發酵魚露。

［1］ 朱志偉，曾慶孝，阮征，等.魚露及加工技術研究進展［J］.食品與發酵工業，2006，32(5):96-100.

［2］ Akolkar A V，Durai D，Desai A J.Halobacterium sp.SP1(1)as a starter culture for accelerating fish sauce fermentation［J］.Journal of Applied Microbiology，2010，109(1):44-53.

［3］ 楊鑫.江蘇兩鹽田可培養嗜鹽古菌多樣性及速釀魚露的研究［D］.鎮江:江蘇大學，2012:8.

［4］ 張水華.食品分析［M］.北京:中國輕工業出版社，2004:174-175.

［5］ GB/T 12456-2008.食品中總酸的測定［S］.

［6］ 張水華.食品分析實驗［M］.北京:化學工業出版社，2006:156-160.

［7］ GB/T 5009.33-2008.食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測定［S］.

［8］ ZBG71005-89.十八胺機械行業標準(JB)［S］.

［9］ 金燕，金鑫榮，陳衛東，等.一種高效快速的氨基酸母液脫鹽法［J］.化學世界，1994，12(2):662-663.

［10］ GB/T5009.124-2003.食品中氨基酸的測定［S］.

［11］ 牟云壯.異源鹽環境嗜鹽古菌多樣性及發酵魚露理化特性研究［D］.鎮江:江蘇大學，2013:77.

［12］ 龔巧玲.魚露的安全快速發酵工藝技術研究［D］.杭州:浙江工業大學，2009:48.

［13］ XU W，YU G，XUE C，et al.Biochemical changes associated with fast fermentation of squidprocessing byproducts for low salt fish sauce［J］.Food Chemistry，2008，107:1 597-1 604

［14］ 黃紫燕.外加微生物改善發酵魚露品質的研究［D］.廣州:華南理工大學，2011:50-50.

［15］ 劉培芝.談談提高魚露質量的一些措施［J］.中國調味品，1989(3):15-18.

［16］ Wanaporn T，Somboon T.Degradation of histamine by extremely halophilic archaea isolated from highsalt-fermented fishery products ［J］.Enzyme and Microbial Technology，2010，46(2):92-99.

［17］ 孫國勇，曾慶孝，江津津.魚露前期發酵過程中組胺變化規律研究［J］.中國調味品，2008(6):64-67.

［18］ Solms J.The taste of amino acids，peptides，and proteins［J］.Food Chemistry，1969，17(4):686-688.

［19］ Lopetcharat K，Choi Y J，Park J W，et al.Fish sauce products and manufacturing:A review［J］.Food Reviews International，2001，17(1):65-88.

［20］ 薛佳.羅非魚加工下腳料速釀低鹽優質魚露的研究［D］.青島:中國海洋大學，2011:52-53.