食品中2，3-丁二酮形成機制和檢測方法的研究進展*

相啟森，馬云芳，董吉林，申瑞玲

(鄭州輕工業學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州，450002)

2，3-丁二酮又名雙乙酰、丁二酮，是一種黃色至淺綠色且具有強烈奶油香味的重要香料。2，3-丁二酮天然存在于發酵乳制品和啤酒等發酵飲料中，1983年被美國食品藥品監督管理局(FDA)規定為GRAS級(generally recognized as safe)，廣泛用作焙烤食品、非酒精飲料、糖果、乳制品替代品、奶油等食品的風味物質［1-4］。最近的研究表明，2，3-丁二酮具有導致閉塞性細支氣管炎、誘導氧化應激等毒性作用，食品中2，3-丁二酮的安全性問題引起了國內外的廣泛關注［5-6］。本文綜述了食品中2，3-丁二酮形成機制和檢測方法方面的研究進展。

1 食品中2，3-丁二酮形成機制

在食品加工過程中，2，3-丁二酮的形成途徑主要包括脂質氧化、糖類分解、美拉德反應、微生物發酵和核黃素光敏氧化等。

1.1 脂質氧化

富含脂肪酸的食品在烹調和熱加工過程中能夠產生2，3-丁二酮等羰基化合物，其可能反應途徑見圖1［4］。不飽和脂肪酸在超氧陰離子(O-2·)、單線態氧(1O2)、羥自由基(·OH)等活性氧作用下發生過氧化反應，形成氫過氧化物、環氧化合物等中間產物，中間產物能夠繼續反應并生成2，3-丁二酮等活性羰基化合物［3，7］。例如，生牛乳中 2，3-丁二酮含量為 5 μg/kg，依次經 82℃ 加熱 30 min、146℃ 加熱 4 s后，2，3-丁二酮含量升高到 38 μg/kg［8］。Jiang 等的研究表明，奶油和人造黃油中2，3-丁二酮的生成量隨加熱溫度升高而顯著升高;經100℃和200℃加熱1 h后，人造黃油中2，3-丁二酮含量分別為(264.3±38.8)ng/g 和(2 274.5 ±442.6)ng/g［9］。

圖1 脂質氧化形成2，3-丁二酮的可能途徑Fig.1 Proposed formation pathway of 2，3-butanedione from lipids oxidation

1.2 糖類分解

糖類化合物在加工過程中的熱分解是食品中2，3-丁二酮形成的另一種重要途徑。如圖2所示，加工過程中單糖分子發生異構化(主要存在于果糖和葡萄糖之間)，異構化產物果糖通過一系列反應形成酮-烯醇式互變異構;在堿性或酸性條件下，酮-烯醇式互變異構中C4—C5鍵發生斷裂而形成2，3-丁二酮和乙二醛［4］。加熱溫度、時間和 pH是影響2，3-丁二酮生成的主要因素。2，3-丁二酮生成量隨加熱溫度升高、加熱時間延長而升高;蔗糖加熱過程中2，3-丁二酮形成的最適 pH值范圍為6～8［10］。對于葡萄糖，其斷鍵位置可能在C2和C3之間［11］。

圖2 糖類形成2，3-丁二酮的可能途徑Fig.2 Proposed formation pathways of 2，3-butanedione from carbonydrate

除圖1和圖2所示的2，3-丁二酮形成途徑以外，脂質和糖類通過氧化或分解產生的一系列低分子量羰基自由基在吸收能量后也能夠生成包括2，3-丁二酮在內的α-二羰基化合物［4，10］。

1.3 美拉德反應(Maillard reaction)

美拉德反應是發生于氨基化合物(蛋白質、肽、胺、氨和氨基酸等)和羰基化合物(還原糖、脂質以及由此而來的醛、酮等)之間的一系列形成食品中香味和色素類物質的復雜反應［12］。2，3-丁二酮是一種重要的美拉德反應產物，是構成咖啡香味的主要物質［10］。在D-葡萄糖、氨水和亞硫酸鹽組成的美拉德反應模擬體系中，2，3-丁二酮的生成量隨葡萄糖和氨水濃度的升高而升高，而美拉德反應抑制劑Na2SO3能顯著抑制2，3-丁二酮的生成［10］。

此外，國外對美拉德反應過程中2，3-丁二酮的形成機制進行了大量研究。在［13C-2］甘氨酸/葡萄糖模擬反應體系中，70%的2，3-丁二酮分子結構中含有1個13C原子，表明氨基酸參與了美拉德模擬反應體系中丙酮醛到2，3-丁二酮的轉化［11］。在［13C-2］甘氨酸/乙二醛模擬反應體系中，2，3-丁二酮全部被13C標記;而在［13C-2］甘氨酸/丙酮醛模擬反應體系中，2，3-丁二酮全部含有1個13C原子［11］。以上結果表明，2，3-丁二酮的形成涉及氨基酸中C原子與二羰基化合物之間的反應［11］。綜上所述，美拉德反應中除糖類化合物的熱分解反應形成2，3-丁二酮以外，氨基酸與糖類化合物降解產物(活性醛類化合物)之間的反應也是形成2，3-丁二酮的重要途徑。

1.4 微生物發酵

在啤酒、威士忌、法國白蘭地等發酵型酒精飲料及發酵乳制品中，2，3-丁二酮主要由微生物代謝產生［13-14］。影響微生物合成2，3-丁二酮的因素主要包括微生物種類、發酵底物和發酵時間等。能夠代謝產生2，3-丁二酮的微生物主要包括乳酸菌屬［14］、芽孢桿菌屬［14-15］、腸桿菌屬［16-17］、明串珠菌［18］以及某些酵母［13，19-20］，其底物主要包括葡萄糖、檸檬酸以及牛乳等。李妍等的研究表明，2，3-丁二酮合成能力由高到低依次為瑞士乳桿菌、干酪乳桿菌和保加利亞乳桿菌［21］。同時，微生物種類也影響了2，3-丁二酮的生成動力學。大部分乳桿菌的2，3-丁二酮產量隨發酵時間的延長而升高，而在菌株 Lb.casei subsp.casei 154發酵姜汁過程中，2，3-丁二酮產量在18 h即達到最大值并隨發酵時間的延長而降低［22］。

國內外對乳發酵過程中2，3-丁二酮的生成途徑、生成條件及代謝調控方式等進行了大量研究，發現乳酸菌主要通過檸檬酸途徑和葡萄糖途徑合成2，3-丁二酮［17-19］。在乳酸菌等微生物的檸檬酸代謝途徑中(圖3)，檸檬酸在檸檬酸裂解酶的作用下裂解為乙酸和草酰乙酸，草酰乙酸經脫羧形成的丙酮酸則進一步形成乙醛-焦磷酸硫胺素(乙醛-TPP)，乙醛-TPP經α-乙酰乳酸合成酶催化生成的α-乙酰乳酸在O2存在條件下不穩定，經過非酶氧化脫羧反應形成2，3-丁二酮［23-24］。在乳酸菌等微生物的檸檬酸代謝途徑中(圖3)，乳糖、半乳糖和葡萄糖等經一系列生化反應生成丙酮酸，丙酮酸經一系列酶促反應和非酶氧化脫羧反應形成 2，3-丁二酮［23，25］。生成的 2，3-丁二酮不穩定，可繼續反應生成乙偶姻和2，3-丁二醇［23］。

圖3 乳酸菌中2，3-丁二酮的代謝途徑Fig.3 Pathways for 2，3-butanedione metabolism in lactic acid bacteria

1.5 核黃素光敏氧化

Jung等證實，食品中核黃素(即VB2)經光敏氧化也能夠形成2，3-丁二酮，其可能途徑見圖4［26］。核黃素是一種水溶性維生素，廣泛存在于牛乳、雞蛋、肉類、蔬菜等食物中。游離核黃素對光很敏感，與單線態氧的反應速率為1.01×1010(M·s)-1。光照尤其是紫外線照射下，核黃素極易發生不可逆分解，造成食品中核黃素含量的快速降低［27］。核黃素(溶解于0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸緩沖液)經3 000 lx的強光照射3 h即可生成2，3-丁二酮，且2，3-丁二酮生成量隨光照時間延長而升高［26］。疊氮化鈉是單線態氧的淬滅劑，可有效抑制光照誘導的2，3-丁二酮生成［26］。

圖4 核黃素與單線態氧反應生成2，3-丁二酮的可能反應途徑Fig.4 Proposed mechanism for the formation of 2，3-butanedione from riboflavin and singlet oxygen

2 食品中2，3-丁二酮檢測方法

鑒于2，3-丁二酮的潛在安全性問題，食品中2，3-丁二酮檢測方法的建立是其安全性評價的基礎［28-29］。目前，食品中2，3-丁二酮的檢測方法主要包括紫外分光光度法、熒光分析法、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、生物傳感器法、極譜法以及化學發光法等。

2.1 紫外分光光度法

由于2，3-丁二酮結構中不含發色團，紫外分光光度法檢測時一般需先進行顯色反應，常用的顯色劑主要包括肌氨酸和鄰苯二胺。肌氨酸比色法的原理是:在β-萘酚存在的堿性條件下，2，3-丁二酮與肌氨酸的胍基基團發生反應并形成粉色產物，可通過顯色40 min 后測定 525 nm 吸光度進行定量分析［22，30］。采用該方法測定2，3-丁二酮時需注意排除乙偶姻干擾，這是因為在分析測定過程中乙酰乳酸能夠通過氧化脫羧反應生成2，3-丁二酮，并且2，3-丁二酮與其代謝產物乙偶姻在522 nm處的吸光度類似［30］。一些學者通過2，3-丁二酮與乙偶姻形成粉色產物的速率不同而分別于顯色1 min和60 min測定2，3-丁二酮和乙偶姻的濃度。但1 min后，乙偶姻仍能部分參與粉色產物的形成，導致2，3-丁二酮的測定結果偏高［23］。

《GB/T 4928-2008啤酒分析方法》采用測鄰苯二胺比色法(EBC法)測定啤酒中2，3-丁二酮含量，其原理為2，3-丁二酮等α-二羰基化合物能夠與鄰苯二胺反應生成2，3-二羥基喹喔啉等喹喔啉類衍生物，該類物質在335 nm下有最大紫外吸收峰，可以用比色分析法進行測定(圖5)。與肌氨酸比色法類似，由于其他聯二酮化合物具有相同的反應活性且在蒸餾過程中形成新的聯二酮化合物，該方法的靈敏性較低，測定結果為樣品中總聯二酮含量［31］。

圖5 2，3-丁二酮與鄰苯二胺反應生成喹喔啉類物質的途徑Fig.5 Formation pathwy of quinoxaline derivative from reaction between 2，3-butanedione and 2，3-phenylenediamine

2.2 熒光分光光度法

熒光比色法也常用于2，3-丁二酮的測定［32-34］?；卩彵蕉放c2，3-丁二酮形成的化合物具有熒光特性，陳淑珠等建立了測定酒類中2，3-丁二酮的熒光檢測方法，該方法的檢測范圍為5～360 μg/L，檢測限為3.2 μg/L［34］。熒光比色法靈敏度接近氣相色譜(GC)，但其檢測結果與火焰離子化檢測氣相色譜法(GC-FID)測定結果存在一定偏差［33］。

2.3 液相色譜法和氣相色譜法

高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)具有高效、快速、準確性好、靈敏度高、重現性好、檢測限低、定量準確等特點，廣泛應用于食品中2，3-丁二酮的檢測分析。由于2，3-丁二酮分子量較小且無發色團，色譜檢測時一般需進行化學衍生。HPLC檢測2，3-丁二酮常用的衍生劑包括鄰苯二胺［35］和4-硝基鄰苯二胺［36］，一般采用紫外檢測器［35-36］、二極管陣列檢測器［37］和質譜檢測器［38］。Li等采用 4-硝基鄰苯二胺柱前衍生和Kromasil反相C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)檢測啤酒中的2，3-丁二酮，紫外檢測波長為257 nm。該方法的檢測范圍和檢測限分別為0.005 0 ～ 10.0 mg/L 和 0.000 8 mg/L［36］。2，3-丁二酮的氣相色譜檢測方法主要包括火焰離子化檢測氣相色譜法(GC-FID)［39］、頂空氣相色譜法(HSGC)［40］和固相微萃取-氣相色譜/質譜法(SPME-GCMS)［41］等。Chen等建立了基于 SPME-GC-MS的奶油樣品中2，3-丁二酮的檢測方法。樣品經聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS-DVB)固相微萃取纖維頭于37℃萃取5 min后，采用SPB-1 SULFUR色譜柱(60 m ×0.25 mm I.D，3.0 μm)進行分離，電子轟擊電離源(EI)MS檢測。該方法的檢測范圍為0.024～11.2 mg/kg，檢測限為 0.007 8 mg/kg［41］。

2.4 生物傳感器法

張介馳等利用雙乙酰還原酶(diacetyl reductase，DR)和還原型輔酶I(NADH)共固定作為工作酶膜，用Fe2+/Fe和 2，3-丁二酮還原過程中產生的NAD+/NADH構建2，3-丁二酮檢測生物傳感器［42］。該方法的原理為:在2，3-丁二酮被DR還原的同時，NADH被氧化成NAD+。在雙乙酰還原酶量足夠大的情況下，NAD+生成速度和生成量與底物2，3-丁二酮濃度成正比，通過電流信號而檢測2，3-丁二酮濃度。該方法可準確檢測0.1～0.5 mg/L內的2，3-丁二酮含量［42］。

2.5 極譜法

極譜法檢測2，3-丁二酮是基于α-二羰基化合物與鄰苯二胺反應并生成的喹喔啉類化合物。喹喔啉是極譜分析中的顯色化合物，適用于極譜分析法［43-44］。Esteve等建立了 2，3-丁二酮的極譜檢測方法，該方法的線性范圍為0～960 mg/L，對果汁、奶油和酸奶樣品的檢測線為 0.2 ～0.4 μg/L［45］。該方法同時結合了鄰苯二胺衍生反應的選擇性和極譜技術的專一性，且不需要對樣品進行復雜的前處理。

2.6 化學發光法

Kele等建立了基于2種水溶性釕復合物(RuPD和RuPP)的2，3-丁二酮化學發光法檢測法。該方法的原理是2，3-丁二酮能夠與釕復合物的二胺結構發生反應并導致幾乎沒有發光特性的釕復合物的發光強度增強31倍［46］。該方法的檢測限能夠達到微摩爾級，并可用于細胞培養基中2，3-丁二酮的檢測。

3 展望

除作為香味物質廣泛應用于食品加工，2，3-丁二酮還廣泛應用于醫藥、農藥和精細化學品合成等領域。食品中2，3-丁二酮除來自人為添加以外，在加工過程中，脂質、糖類、維生素等食品組分能夠通過過氧化、氧化分解、美拉德反應、光敏氧化等多種途徑形成2，3-丁二酮。雖然2，3-丁二酮被美國FDA列為GRAS級，但其安全性引起了各方面的廣泛關注。目前，國內涉及2，3-丁二酮安全性的研究報道比較少，相關研究有待加強。在今后的研究中，首先要開展不同食品中2，3-丁二酮含量數據的收集工作，同時結合我國居民各類食物消費量，對食品來源的2，3-丁二酮攝入狀況進行風險評估。其次，應進行食品中氨基酸、脂肪和糖類等成分的組成和含量影響2，3-丁二酮生成方面的相關研究，并深入揭示不同食品組分形成2，3-丁二酮的化學反應途徑。此外，還應研究不同加工方式和工藝參數條件對食品加工過程中2，3-丁二酮生成的影響，并通過改善加工工藝等方式降低2，3-丁二酮的生成，以期保護消費者健康。

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