超聲波提取米團花多糖*

楊婷婷，張廣文，朱玲玲，歐仕益

(暨南大學理工學院食品科學與工程系，廣東 廣州，510632)

米團花(Leucosceptrum canum Smith)別名山蜂蜜、漬糖樹、羊巴巴、蜜蜂樹花、明堂花，主要分布在我國的滇中至滇南地帶，生長在海拔400～1 900 m的林緣、水邊和路邊草地，是一種蜜源植物，在云南一直被人們作為天然的食用原料添加到食物中［1］。近些年研究表明植物多糖具有抗氧化、抗炎、抗癌、增強免疫力等多種生理功能，因此植物多糖的研究受到了人們的普遍關注［2-4］。但關于米團花多糖的研究鮮有報道，對米團花多糖進行研究不僅能擴大植物多糖的來源，還為開發其潛在的藥用價值和商業價值提供理論依據。

傳統的多糖提取方法主要是加熱或煮沸法，不僅效率低而且耗時長。隨著科學技術的進步，超聲波提取、微波提取以及超臨界萃取等新型提取技術已廣泛應用于活性物質的提取，而超聲波提取技術因其在植物多糖提取中的眾多優點更是被廣泛采用［5-8］。本實驗對米團花多糖的提取工藝進行了研究，采用超聲波輔助提取技術，考察了超聲功率、料液比、以及超聲時間對米團花多糖得率的影響。在單因素實驗的基礎上，以米團花多糖得率為響應值，利用響應面分析法(response surface methodology，RSM)對超聲波提取米團花多糖工藝條件進行優化，該設計試驗方案不僅實驗周期短，而且具有求得回歸方程精度高的優點［9-10］。并采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系以獲得最優工藝參數，從而提高了米團花多糖得率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米團花，購于云南省寶山市，依次在65℃烘箱中經24 h烘干后，粉碎，過45目篩，置于干燥器中儲存備用;苯酚、無水乙醇、石油醚，分析純，天津市富起化工有限公司;三氯甲烷、正丁醇、丙酮，分析純，廣州化學試劑廠;考馬斯亮藍、濃H2SO4、葡萄糖，分析純，天津市富宇精細化工有限公司。

透析袋(齊云生物技術有限公司);HH-4型恒溫水浴鍋(江蘇金壇市宏華儀器廠);RE-552 AAB型旋轉蒸發器(上海嘉鵬科技股份有限公司);MP502B型電子分析天平(上海精密科技儀器有限公司);722S型可見分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司);GZX-DH.500-S-Ⅱ型電熱恒溫干燥箱(上海躍進醫療器械廠);高速萬能粉碎機(北京市永光明醫療儀器廠);THC型數控超聲波提取機(濟寧天華超聲電子儀器有限公司);冷凍干燥機(寧波生化儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲波提取米團花多糖

精確稱取5.0 g米團花粉末于250 mL圓底燒瓶中，依次用石油醚、丙酮回流脫脂后，在恒定的溫度下，按一定的料液比例加入適量蒸餾水，混勻后充分浸透，然后置于超聲波儀器內，以一定功率提取一段時間，抽濾提取液，濾液經旋轉蒸發儀濃縮，加入4倍體積的體積分數95%乙醇于4℃下醇沉24 h，5 000 r/min離心5 min。取沉淀，加蒸餾水復溶，采用Sevage［V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1 ］法脫蛋白，按照一定比例取粗多糖溶液和Sevage溶液(體積比4∶1)于20 mL試管中，渦旋5 min，使其充分反應，取其上清液，重復操作3次［11-12］，考馬斯亮藍法測定蛋白脫除率。上清液依次于4℃條件下透析2 d后用4倍體積無水乙醇醇沉，10 000 r/min離心5 min，取其沉淀冷凍干燥得米團花多糖樣品。

以水作溶劑進行提取，按照上述操作，在恒定溫度條件下分別考察超聲功率(300～700 W)、料液比［1∶10 ～1∶50(g∶mL)］、超聲時間(30 ～70 min)對米團花多糖得率的影響。

1.2.2 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法［13］。以葡萄糖溶液為標準，在490 nm處測定葡萄糖濃度與吸光度的對應關系，制作標準曲線。標準曲線的回歸方程為y=1.070 7x+0.037 7，R2=0.999 2。精確稱取米團花多糖樣品10.0 mg，水溶解后定容到10 mL，搖勻，作為多糖儲備液。精確吸取多糖儲備液0.2 mL，加水至2 mL，按測定標準曲線同樣的方法測其吸光值。

1.2.3 多糖得率

多糖得率/%=(多糖含量/米團花原料質量)×100。

米團花多糖含量與多糖得率呈正相關，多糖得率即反映了多糖含量，因此采用多糖得率數據為依據來進行實驗結果討論。

1.3 響應面優化實驗設計

綜合前期單因素試驗的結果，根據Box-Behnken試驗設計原理，在恒定的溫度條件下以超聲功率、料液比、超聲時間3個因素為自變量，米團花多糖得率為響應值，進行試驗設計，并采用響應面分析法在3因素3水平上對提取過程進行優化。試驗因素與水平見表1。

1.4 實驗驗證

精確稱取3組米團花多糖樣品各1.0 g，按最佳提取工藝條件進行實驗，計算多糖得率。

2 結果與分析

2.1 蛋白質脫除率

如圖1所示，經過Sevage法脫蛋白，米團花提取液中的蛋白脫除率隨著脫除次數的增加而增大，在第3次時達到了92.14%，隨后增加脫除次數，脫除率并沒有明顯的變化。因此以脫除3次為最佳脫除次數。

圖1 蛋白脫除率Fig.1 The removal rate of protein

2.2 超聲波提取米團花多糖單因素實驗

2.2.1 超聲功率對米團花多糖得率影響

在料液比 1∶30(g∶mL)，提取時間 50 min，分別考察超聲功率300、400、500、600、700 W 對米團花多糖得率的影響，實驗結果如圖2所示。由圖2所知，隨著超聲功率的增大，米團花多糖得率也逐漸的提高，在500 W時多糖得率達到最大值為17.48%;超聲功率大于500 W時多糖得率反而降低，這主要是由于超聲波功率增大機械作用越強，分子擴散越快多糖就容易溶出，而超聲功率大于500 W時機械作用和空化作用過強而造成多糖降解為寡糖，引起多糖得率的降低。

圖2 超聲功率對多糖得率影響Fig 2 The influence of ultrasonic power on polysaccharide yield

2.2.2 料液比對米團花多糖得率影響

在超聲時間50 min，超聲功率500 W，分別考察料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)對米團花多糖的影響，實驗結果如圖3所示。從圖3中可以看出，在料液比為1∶10 ～1∶30(g∶mL)時，隨著料液比的增加，多糖得率從12.32%增加到17.56%。這是因為料液比的增加加大了溶劑與米團花的接觸面積從而使多糖更易溶出;當料液比為1∶30～1∶50(g∶mL)時，多糖得率從17.56%降低到16.62%。過多的溶劑不僅造成多糖得率降低，而且也造成溶劑的浪費，增大生產成本，所以選擇最佳料液比為1∶30(g∶mL)。

圖3 料液比對多糖得率影響Fig.3 The influence of solid-liquid ratio on polysaccharide yield

2.2.3 超聲時間對米團花多糖得率的影響

在超聲功率500 W，料液比1∶30(g∶mL)條件下，分別考察超聲時間 30、40、50、60、70 min 對米團花多糖得率的影響，實驗結果如圖4所示。從圖4中可以看出，在米團花多糖得率在50 min前隨著提取時間的增加而增加，之后隨著時間的增加多糖得率反而降低。造成這一現象的原因可能是隨著超聲時間的增加，細胞遭到破壞多糖的溶出率增加;超聲時間超過50 min多糖得率降低，一方面是溶劑體系已經達到了動態平衡，另一方面可能是超聲時間過長致使多糖發生分解所致。因此，選擇最佳超聲時間為50 min，米團花多糖得率為17.32%。

圖4 超聲時間對多糖得率的影響Fig 4 The influence of ultrasonic time on polysaccharide yield

2.3 響應面優化實驗

依據軟件Box-Behnken試驗方案進行3因素3水平試驗，結果見表2。將所得的實驗數據采用Design Expert 8.0.6軟件進行多元回歸擬合分析，得到以多糖得率(Y)為目標函數的二次回歸方程:

Y=17.500 00+0.258 75A+0.206 25B+0.272 50C+0.075 000AB-0.297 50AC+0.012 500BC-0.260 00A2-0.090 000B2-0.252 50C2.

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Experiment design and results of Box-Behnken

2.4 回歸方程方差分析

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for regression equation

表3可知，回歸模型的P＜0.000 1，說明該模型極顯著，其響應值與各試驗因素之間存在顯著的線性相關性。模型R2=0.982 9，R2Adj=0.960 8，兩者數值極為相近，說明該模型能反映96.08%響應值的變化，因而該模型擬合程度較好，實驗誤差小CV=0.43%較低，說明實驗操作可信。同時失擬項也進一步表明回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，綜上可以確定回歸方程為米團花多糖超聲波提取工藝的優化提供了一個合適的模型。

從對各因素的方差分析中可以看出超聲功率A、料液比B、超聲時間C的P值均≤0.000 1，說明了A，B，C對米團花多糖得率有顯著性影響，根據它們的F值可以判斷，對多糖得率的影響順序從大到小依次為:C＞A＞B。交互項AC的 P值小于0.001，說明AC的交互作用對米團花多糖得率具有顯著性影響，而AB，BC對多糖得率的影響均不顯著。二次項A2，C2的P值小于0.001，對米團花多糖的得率具有顯著性影響，且A2對多糖得率的影響大于C2。而B2對多糖得率影響不顯著。

2.5 超聲波提取米團花多糖工藝的響應面分析與優化

由圖5可知，AC交互影響顯著，多糖得率隨著超聲功率和超聲時間的增加而迅速增大。較低超聲功率時，隨著提取時間的增加，多糖得率呈緩慢上升趨勢;增大超聲功率，隨著時間延長多糖得率呈較大上升趨勢，且趨勢明顯，并且在功率為500 W，時間為50 min時，多糖得率達到最大值。圖6可知，BC的交互影響不顯著，隨著料液比的變化，多糖得率有較小的上升趨勢，料液比一定，多糖得率隨提取的時間的延長而相應增大;而時間一定時，料液比的增加對多糖得率影響較小。圖7可知，AB的交互影響一般顯著，料液比一定時，超聲功率對多糖影響率較大，隨著超聲功率的增大多糖得率呈先增后降的趨勢。3個因素對多糖得率的影響以及各因素之間的交互影響與回歸分析結果相吻合。

從響應面的最高點和等高線可以看出在所選的范圍內存在極值，響應面的最高點同時也是等值線中的最小橢圓的中心點。通過嶺嵴分析得到米團花多糖最佳超聲波提取工藝條件為:超聲功率548.3 W，料液比1∶30(g∶mL)，提取時間 55.6 min，理論最佳提取率為17.74%。根據實際情況按照料液比1∶30(g∶mL)，超聲功率548 W，提取時間55 min進行3次平行驗證試驗，得到米團花多糖的提取率為17.59%，與預測值較為接近，擬合性好。實驗結果充分驗證了所建模型的正確性，說明響應面法適用于超聲波提取米團花多糖工藝條件的回歸分析和參數優化。

圖5 Y=f(A、C)的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour of Y=f(A、C)

圖6 Y=f(B、C)的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour of Y=f(B、C)

圖7 Y=f(A、B)的響應面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour of Y=f(A、B)

3 結論

在單因素試驗的基礎上，本研究通過Box-Behnken試驗設計，建立了影響米團花多糖得率二次多項數學模型，并應用響應面分析法對影響超聲波提取米團花多糖的主要因素(超聲功率、料液比、超聲時間)進行了優化。結果顯示，超聲波提取米團花多糖的最佳工藝條件為:超聲功率548.3 W，料液比1∶30(g∶mL)，提取時間為55.6 min。在此條件下，實際提取率17.59%，與模型理論預測值17.74%的相對誤差為0.8%。實驗結果證明，利用響應面法對超聲波提取米團花多糖工藝進行優化，可獲得最優的工藝參數，為米團花多糖的進一步深入研究奠定基礎。

傳統的熱水提取米團花多糖實驗。在一定溫度下按料液比1∶30(g∶mL)，時間為55.6 min進行提取，重復實驗5次。在此條件下，米團花多糖提取率為12.38%，這與在超聲條件下多糖得率17.59%有著較大差距，因此超聲波提取米團花多糖與傳統的熱水提取相比較具有較為明顯的優勢。

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