石斛汁乳酸發酵飲料的研制

王超，何梓鈺，査應洪，楊淑儀，杜冰

1(華南農業大學 食品學院，廣東 廣州，510642)

2(紅河群鑫石斛種植有限公司，云南紅河，661200)

石斛屬植物，按形態、產地等可分為鐵皮、金釵、黃草、霍山等數十個品種，其中以鐵皮石斛最為珍貴。鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)的干燥莖［1］，因其表皮呈鐵綠色而得名。鐵皮石斛含有大量的活性物質，主要為石斛多糖［2］、石斛堿［3］、類黃酮、氨基酸、芪類及其衍生物以及多種揮發性成分［4］，除具有抗腫瘤、抗衰老、增強機體免疫力［5］等作用，還具有擴張血管、降低血壓［6］之功效。鐵皮石斛除可鮮食外，還可燉湯、泡茶和浸酒［7］。通常加工成干品，如鐵皮楓斗［8］。此外，還可制成功能性飲料［9］。本文選用凝結芽孢桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌分別接種發酵石斛汁。制成的石斛汁乳酸飲料不僅較好地保存了營養物質，而且綜合了乳酸發酵的優點，集石斛汁精華與乳酸菌的功能性于一體。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛:購于紅河群鑫石斛種植有限公司。

乳酸菌種:植物乳桿菌(Lp-115)、鼠李糖乳桿菌(LR-54)、凝結芽孢桿菌(TQ-33)，本實驗室保存。

MRS培養基，廣東環凱微生物科技有限公司;蛋白胨、牛肉膏，北京奧博星生物技術有限公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

pH S-25型pH計，上海精密科學儀器有限公司;FA1104N電子天平，上海精密科學儀器有限公司;JM-L50膠體磨，上海斯邁克輕工設備廠;YXQ-LS-5OS型立式蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠;SW-CJ-1D型單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司;GHX-9270 B-2隔熱式恒溫培養箱，上海?，斣囼炘O備有限公司;101-2S4電熱鼓風恒溫干燥箱，上海迅能電熱設備有限公司;打漿機，美的集團公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 石斛汁的制備

取新鮮鐵皮石斛莖，用清水洗凈，切成小段，文火煮沸10 min后趁熱打漿，漿水后用膠體磨研磨，分別進行粗磨和細磨各1次。

1.3.2.2 石斛汁加熱殺菌

在90℃，10～15 min下滅菌，以殺滅石斛汁中有害微生物。

1.3.2.3 接種、發酵和冷藏

將滅完菌的石斛汁冷卻至40℃以下，接入乳酸菌發酵劑，在37℃恒溫發酵48 h后置于4℃冰箱中冷藏。

1.3.3 測定指標與測定方法

pH值用采用pH S-25型酸度計測定;總酸的測定采用電位滴定法［11］(以乳酸計);還原糖的測定采用直接滴定法［12］;氨基態氮的測定采用甲醛值法測定［13］;乳酸菌活菌數采用平板計數法［10］測定，參考GB/T 4789.35-2010。

1.3.4 感官評價指標

感官評價標準見表1，相關評價方法參考 GB/T 12315-2008。

表1 感官評價標準表Table 1 Standards of sensory evaluation

2 結果分析

2.1 發酵過程中活菌數的變化規律

將凝結芽孢桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌分別接入石斛汁中進行對比發酵，接入的初始活菌數約為7.08 lg(CFU/mL)，接種開始記為0 h，在發酵過程中間隔取樣，分別測定3種石斛汁中的活菌數，結果如圖1所示。

圖1 發酵過程中活菌數的變化Fig.1 Change of viable cell count in fermentation

從圖1可以看到，3種乳酸菌在發酵過程經歷了短暫的延遲期，延遲期的長短與菌種、菌齡、培養條件等密切相關［15］。凝結芽孢桿菌延遲期較短，很快進入對數生長期。菌體數目呈幾何級增長，并且凝結芽孢桿菌在對數期的增長速度相比另外兩種菌要快。第12 h左右開始進入穩定期，由于營養物質的逐漸消耗以及pH值的降低，凝結芽孢桿菌的繁殖率和死亡率趨于平衡，至發酵結束時活菌數基本不變，第48h時活菌數達到9.47 lg(CFU/mL)。鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌分別在12、18 h時左右進入穩定期，至發酵結束時活菌數分別為9.33、8.95 lg(CFU/mL)。與0h的活菌數相比，凝結芽孢桿菌增加的數量是3種菌株中最高的，從7.08 lg(CFU/mL)增長至9.47 lg(CFU/mL)，表明其在石斛汁中具有優良的增值活性。

2.2 發酵過程中總酸變化規律

接種開始計為0 h，在發酵過程中進行間隔取樣，分別測定3種石斛汁中總酸的變化情況，結果如圖2所示。

圖2 發酵過程酸度的變化Fig.2 Change of acid degree in fermentation

由圖2可以看出，3種乳酸菌發酵石斛汁的總酸含量在0～6 h時均緩慢增加，隨后迅速上升，第36 h之后無顯著變化，至發酵結束時，凝結芽孢桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌發酵石斛汁的乳酸含量分別為7.85、6.93、7.66 mg/mL。這是因為經過短暫的適應期后，乳酸菌利用石斛汁中的糖分作為碳源，通過代謝產生大量乳酸，但由于石斛汁中可供乳酸菌利用的碳氮源有限，發酵后期乳酸菌產酸速度降低。從產酸能力和速率來說，凝結芽孢桿菌與鼠李糖乳桿菌差別不大，而兩者要優于植物乳桿菌。

2.3 發酵過程中pH值變化規律

接種開始計為0h，在發酵過程中進行間隔取樣，分別測定3種石斛汁中pH值的變化情況，結果如圖3所示。

圖3 發酵過程中pH值的變化Fig.3 Change of pH value in fermentation

由圖3可以看出，隨著發酵時間的延長，石斛汁的pH值不斷下降，這主要是乳酸菌產生乳酸等酸性物質的緣故。發酵開始時，由于凝結芽孢桿菌需要適應新環境，產酸較少，這一時期石斛汁的pH值變化不明顯。6 h之后，凝結芽孢桿菌進入對數生長期，石斛汁的pH值迅速下降，至第12 h，pH值由5.84下降至4.23。植物乳桿菌在發酵開始時由于產酸較少，pH值下降緩慢，6 h之后石斛汁的pH值下降速度加快，至第18 h，pH值由5.93下降至4.08。鼠李糖乳桿菌從第6h左右進入對數期，產酸趨勢開始明顯，第36 h之后，由于產酸速度放緩，pH值呈緩慢下降的趨勢。

2.4 發酵過程中氨基態氮的變化規律

接種開始計為0 h，在發酵過程中進行間隔取樣，分別測定3種石斛汁中氨基態氮含量的變化情況，結果如圖4所示。

圖4 發酵過程中氨基態氮的變化Fig.4 Change of amino nitrogen in fermentation

從圖4可以看出，3種乳酸菌在發酵石斛汁的過程中氨基態氮含量的變化不顯著，但不同乳酸菌對蛋白質的利用情況有一定差別。由于乳酸菌缺乏合成幾種必需氨基酸的能力，故乳酸菌須通過蛋白酶系降解生長環境中的蛋白質，主要通過菌體細胞壁蛋白酶和肽酶的分解作用獲得游離氨基酸和多肽［14］。凝結芽孢桿菌在發酵前期的氨基態氮含量比發酵后期高，而植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在發酵過程中氨基態氮的含量無明顯變化?？赡苁怯捎谀Y芽孢桿菌分解蛋白質和利用氨基酸的能力比植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的強，所以凝結芽孢桿菌在發酵前期分解蛋白質得到較多的多肽和游離氨基酸，在發酵后期利用的量也比另兩種菌多。

2.5 發酵過程中還原糖的變化規律

接種開始記為0 h，在發酵過程中進行間隔取樣，分別測定3種石斛汁中的還原糖含量，結果如圖5所示。

圖5 發酵過程中還原糖的變化Fig.5 Change of reducing sugar in fermentation

從圖5可以看到，隨著發酵過程的進行，石斛汁內的還原糖不斷被消耗。在發酵前期，乳酸菌消耗還原糖速率較快，至發酵后期，還原糖含量消耗速度緩慢，這與發酵后期酸度變化情況相對應。此外，不同菌種在發酵過程中對石斛汁中還原糖的利用情況存在差異，植物乳桿菌消耗糖的速率要低于凝結芽孢桿菌與鼠李糖乳桿菌。在未添加任何碳氮源的前提下，發酵48 h后，植物乳桿菌發酵石斛汁中的還原糖含量減少了67.28%，凝結芽孢桿菌與鼠李糖乳桿菌發酵石斛汁中還原糖含量分別減少了78.64%、76.85%。

3 結論

(1)在乳酸菌發酵石斛汁的過程中，凝結芽孢桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌都存在延遲期、對數期和穩定期。其中，凝結芽孢桿菌的延遲期最短，很快進入對數生長期，從第12 h便進入穩定期，至發酵結束活菌數為9.47 lg(CFU/mL)。植物乳桿菌的延遲期較長，從第6 h起進入對數生長期，第18 h進入穩定期，至發酵結束活菌數為8.95 lg(CFU/mL)。

(2)發酵石斛汁過程中，由于乳酸菌不斷利用其中的可發酵糖生成乳酸等酸性物質，pH值不斷降低，酸度不斷增加。發酵48 h后，植物乳桿菌發酵石斛汁的乳酸含量為6.93 mg/mL，凝結芽孢桿菌和鼠李糖乳桿菌發酵石斛汁的乳酸含量分別為7.85、7.66 mg/mL。從3種乳酸菌在發酵石斛汁過程中的產酸速度和產酸能力來說，凝結芽孢桿菌略優于鼠李糖乳桿菌，鼠李糖乳桿菌優于植物乳桿菌。

(3)在未添加其他碳氮源的條件下，發酵48 h后，植物乳桿菌發酵石斛汁中的還原糖含量減少了67.28%，凝結芽孢桿菌和鼠李糖乳桿菌發酵石斛汁中還原糖含量分別減少了78.64%、76.85%。

(4)對3種乳酸菌發酵所得石斛汁進行感官評價，分析評價的指標有口感、色澤、香氣及組織狀態，各指標的評分標準見表1。感官評價總分為口感評分、色澤評分、香氣評分和組織狀態評分之和。共有20位有品嘗經驗的老師和研究生作為評價員對發酵石斛汁進行感官評價，凝結芽孢桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌發酵石斛汁的感官評價最終結果依次為84分、75分、89分。綜合產酸速度、還原糖利用率、活菌數、產品感官等指標考慮，確定發酵菌種為鼠李糖乳桿菌。

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