辛硫磷對家蠶細胞周期蛋白家族基因轉錄活性的影響

劉麗華，沈衛德，李 兵

(1 通化師范學院 生物系，吉林 通化 134000；2 蘇州大學 基礎醫學與生物科學學院，江蘇 蘇州 215123)

辛硫磷對家蠶細胞周期蛋白家族基因轉錄活性的影響

劉麗華1，沈衛德2，李 兵2

(1 通化師范學院 生物系，吉林 通化 134000；2 蘇州大學 基礎醫學與生物科學學院，江蘇 蘇州 215123)

【目的】 探討經辛硫磷誘導后，家蠶細胞周期蛋白家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE)在5齡幼蟲各種組織中的轉錄活性，為進一步研究有機磷農藥對家蠶的損傷機制提供參考?！痉椒ā?采用實時熒光定量PCR方法，以飼喂清水浸泡過的桑葉為對照，分析家蠶5齡3 d幼蟲喂食辛硫磷(4 μg/mL)浸泡桑葉24 h后，腦、脂肪體、中腸、絲腺、馬氏管、精巢及卵巢等7種組織中4種細胞周期蛋白家族基因的轉錄水平?！窘Y果】 與對照組相比，辛硫磷誘導24 h后，CyclinA、CyclinB、CyclinB3在各組織中均表達上調，CyclinE在中腸及脂肪體中表達顯著下調，在精巢與馬氏管中無明顯變化，在其他組織中則表達上調?！窘Y論】 辛硫磷誘導24 h后，家蠶組織中CyclinA、CyclinB及CyclinB3基因表達上調，這可能是家蠶對磷脅迫的響應；CyclinE在中腸及脂肪體中表達顯著下調，這與這2種器官是家蠶重要的解毒代謝器官有關。

家蠶；辛硫磷 ；細胞周期蛋白；基因轉錄

細胞周期蛋白(Cyclin)是一類隨著細胞周期變化而周期性出現和消失的蛋白，具有種屬和組織特異性，其在從酵母到人類等真核生物中都具有廣泛的作用。細胞周期蛋白的共同特點是具有100～150個氨基酸組成的周期蛋白盒保守序列，細胞靠此結構域與細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclindependent kinase，CDK)結合形成活性復合物，對細胞周期的啟動及各時相的轉換起關鍵性調控作用[1]。細胞周期蛋白的表達具有典型的周期性和時相特異性，其可作為調節亞基與相應的CDK形成復合物，并正調節CDK的活性。不同的細胞周期蛋白在不同時相可通過相應的CDK起促進細胞完成周期的作用[2]。

目前，在哺乳動物中已發現了20多種細胞周期蛋白家族成員，其中家蠶體內報道了6種，即CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1和CyclinH，這6種都是家蠶細胞完成細胞周期必不可少的。通過RNA干涉技術下調家蠶CyclinA基因能有效地抑制細胞增殖，使細胞周期阻滯于G1期[3]；CyclinB及 CyclinB3同屬于B型周期蛋白，是家蠶細胞周期M期的限速因素[4]；CyclinE基因在家蠶細胞G1/S期起重要作用[5]；CyclinL1基因與家蠶胚胎期滯育及非滯育性卵的發育調控相關[6]；CyclinH在家蠶發育分化過程中可能對其他周期蛋白的表達有調控作用[7]。

家蠶是我國重要的經濟昆蟲，由于其長期在室內飼養，對外界不良環境的抗性較弱，尤其對農藥的抵抗能力更弱[8]，在生產過程中，常由于農藥中毒而造成家蠶大量減產。有機磷農藥是目前我國農業生產上使用較廣泛的農藥之一，它主要通過抑制其靶標物乙酰膽堿酯酶的活性而使昆蟲中毒死亡[9]。有機磷對家蠶的危害，還表現在對食物消化、生長、繁殖、氧化應激及生理狀態的影響等方面[10-12]。目前此方面已有研究主要集中在有機磷農藥與家蠶抗性的關系方面，而關于有機磷農藥對家蠶細胞周期調控因子的影響尚未見報道。為此，本試驗采用實時定量PCR方法檢測辛硫磷農藥誘導24 h后，家蠶5齡3 d幼蟲各種組織中細胞周期蛋白家族基因CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE表達水平的變化，以期為進一步研究有機磷農藥對家蠶的損傷機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試昆蟲 供試家蠶品種為大造，由蘇州大學蠶桑實驗室提供，于(25±1) ℃、濕度60%～75%條件下用桑葉飼養。

1.1.2 主要試劑 辛硫磷購自Sigma公司；總RNA抽提試劑盒Trizol-A、 M-MLV反轉錄試劑盒、SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒及其他化學試劑，均購自寶生物工程(大連)有限公司。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 試驗處理 供試家蠶飼養至5齡3 d時，將桑葉分別浸泡于用丙酮稀釋至4 μg/mL的辛硫磷藥液(其LC50=7.86 μg/mL)[13](即試驗組)和清水(即對照組)中，3 s后取出晾干，分別飼喂家蠶。24 h后分別采集試驗組與對照組家蠶的腦、脂肪體、中腸、絲腺、馬氏管、精巢及卵巢等組織，凍存于液氮中，備用。

1.2.2 家蠶組織總RNA的提取及cDNA的制備 按照Trizol-A 試劑盒說明書的方法，分別提取試驗組與對照組5齡3 d家蠶幼蟲各組織的總RNA，用紫外分光光度計測定其純度和濃度。用M-MLV反轉錄試劑盒將提取的各組織RNA分別反轉錄成cDNA，備用。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析 采用Primer 5.0軟件，按照Real-time PCR要求設計Actin3內參基因和CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的引物(表1)。以合成的cDNA為模板，采用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒對各基因進行實時熒光定量PCR，具體步驟按照試劑盒說明書進行，反應體系為20 μL。反應程序為：95 ℃變性1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s，40個循環。反應過程由ABI 7300測定儀軟件自動設定，每種組織樣品重復3次。

1.2.4 數據處理 用ABI 7300儀器自帶的Sequence detection software version 1.3.1軟件處理RT-PCR數據，并參照文獻[14]的方法進行效率校正。圖表采用SPSS 16.0軟件制作。

表1 實時熒光定量PCR檢測基因和內參基因的引物Table 1 Primers for real-time fluorescent quantitative PCR to detect transcriptions of target and internal reference genes

2 結果與分析

2.1 辛硫磷誘導對家蠶CyclinA基因轉錄活性的影響

圖1表明，與對照組比，辛硫磷誘導組家蠶各個組織中CyclinA基因表達量均顯著上調，尤以絲腺、腦、精巢和卵巢上升明顯；對照組家蠶中腸、脂肪體、絲腺及馬氏管中幾乎檢測不到CyclinA基因的表達，但經辛硫磷誘導后，CyclinA基因表達顯著提高，這可能是由于CyclinA存在不同的剪接變體[15]，在辛硫磷的刺激下，某些CyclinA剪接變體由原來的沉默狀態被激活，導致表達提高。

2.2 辛硫磷誘導對家蠶CyclinB及CyclinB3基因轉錄活性的影響

圖2和圖3顯示，無論是對照組還是處理組家蠶，其CyclinB和CyclinB3基因在不同組織中的轉錄水平表現均基本一致：在中腸、絲腺、馬氏管中未表達，而在其他幾種組織中，除脂肪體外，試驗組家蠶CyclinB及CyclinB3基因表達量均顯著提高，尤以精巢及卵巢為甚，表明辛硫磷對家蠶生殖細胞CyclinB及CyclinB3基因表達的影響較大。

圖1 辛硫磷誘導對家蠶CyclinA基因在各組織中轉錄的影響1.中腸；2.脂肪體；3.絲腺；4.腦；5.馬氏管；6.精巢； 7.卵巢； 同一組織不同處理相比，標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2～4同

圖2 辛硫磷誘導對家蠶CyclinB基因在各組織中轉錄的影響Fig.2 Transcription levels of CyclinB gene in various tissues of Bombyx mori larvae before and after induction with phoxim

圖3 辛硫磷誘導對家蠶CyclinB3基因在各組織中轉錄的影響Fig.3 Transcription levels of CyclinB3 gene in various tissues of Bombyx mori larvae before and after induction with phoxim

2.3 辛硫磷誘導對家蠶CyclinE基因轉錄活性的影響

如圖4所示，與對照組相比，辛硫磷誘導組家蠶絲腺、腦及卵巢中CyclinE基因表達量均顯著上調，而中腸、脂肪體顯著下調，精巢和馬氏管中無明顯變化。

圖4 辛硫磷誘導對家蠶CyclinE基因在各組織中轉錄的影響

3 討 論

本研究結果顯示，無論是對照組還是處理組，5齡3 d家蠶細胞周期蛋白家族基因在各組織中的轉錄水平均存在差異。對照組家蠶除CyclinE在脂肪體中高表達外，CyclinA、CyclinB、CyclinB3都是在精巢中表達量最高，而在其他組織中表達量相對較低，表明這3個基因在家蠶精母細胞形成精子的過程中發揮重要作用。這與筆者前期的研究結果[16]相同。

CyclinA能分別與CDK2和CDC2作用，推動細胞進入并通過細胞周期的S期和M期[17]。CyclinB及 CyclinB3是細胞周期M期的限速因素[4]。經辛硫磷誘導后，CyclinA、CyclinB、CyclinB3在家蠶各組織中的表達量均顯著提高，推測其原因是家蠶受到辛硫磷刺激后，機體發生了一系列代謝變化，并動員機體的代償適應功能來抵抗和適應各種應激反應，而應激反應分為應激適應和應激損傷2個不同的階段，因此推測辛硫磷誘導24 h后，家蠶各種組織細胞處于應激適應階段，通過上調CyclinA、CyclinB及CyclinB3基因表達，加速各種組織細胞的分裂進程。這可能是家蠶抵抗組織損傷，提高自身防御能力的一種措施。隨著誘導時間的延長，一旦機體不能適應，應激損傷便隨之發生，已有研究表明，有機磷能導致大鼠卵巢與精巢呈現衰退性變化[18-19]。本試驗中家蠶的應激損傷發生在誘導后多長時間還有待于進一步研究。

CyclinE屬于G1期細胞周期蛋白，其通過與CDK2結合，促進G1/S期進程，使細胞進入S期后就不再依賴于細胞外促生長因子而順利完成整個細胞周期[20]。在本試驗中，對照組家蠶CyclinE基因在脂肪體中轉錄水平最高，這是由于家蠶脂肪體在5齡幼蟲期以增加細胞數的方式迅速生長，而在添加辛硫磷后，CyclinE基因表達水平顯著下調，推測這與脂肪體是家蠶解毒代謝的重要器官有關。

本試驗采用熒光定量PCR方法，研究了5齡家蠶經辛硫磷誘導后，細胞周期蛋白家族基因CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE的轉錄情況，明確了其在5齡家蠶不同組織中的轉錄水平，對于研究有機磷對家蠶的損傷機制具有重要的參考價值。

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Effect of phoxim on transcriptional activities of cyclin family genes in silkworm (Bombyxmori)

LIU Li-hua1,SHEN Wei-de2,LI Bing2

(1DepartmentofBiology,TonghuaNormalUniversity,Tonghua,Jilin134000,China;2SchoolofBasicMedicineandBiologicalSciences,SoochowUniversity,Suzhou,Jiangsu215123,China)

【Objective】 This study investigated the effect of phoxim on transcriptional activities of cyclin genes (CyclinA,CyclinB,CyclinB3,andCyclinE) in various tissues of 5thBombyxmoriinstar larvae to provide reference for the damage mechanism of phoxim pesticides to silkworm.【Method】 The transcription levels of cyclin genes in seven organs including brain,fat body,midgut,silk gland,Malpighian tube,testis and ovary after feeding folium mori treated by phoxim (4 μg/mL) to 5thBombyxmoriwere analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR with clear water as control.【Result】 Compared with the control group,transcriptional levels ofCyclinA,CyclinB,andCyclinB3 in various tissues were up-regulated 24 h after phoxim induction.CyclinEtranscriptional levels were significantly down-regulated in midgut and fat body,while it did not change significantly in testis and Malpighian tubules.Transcriptional levels ofCyclinEin other organs were unregulated.【Conclusion】 Increase of transcriptional levels ofCyclinA,CyclinBandCyclinB3 may be due to the response ofBombyxmorito phosphorus stress.The significant reduction ofCyclinEin midgut and fat body may be because midgut and fat body are detoxification metabolism organs.

Bombyxmori.;phoxim;cyclin;gene transcription

時間:2015-08-05 08:56

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.09.005

2014-02-28

國家自然科學基金項目(31072086)；吉林省科技廳項目(20130101100JC)；吉林省教育廳項目(2013493)

劉麗華(1972-)，女，吉林通化人，副教授，博士，主要從事動物資源與功能基因組研究。E-mail：liulihua209@163.com

沈衛德(1951-)，男，江蘇蘇州人，教授，博士，博士生導師，主要從事動物資源與功能基因組研究。 E-mail：shenwd@suda.edu.cn

S884.9+6

A

1671-9387(2015)09-0031-05

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150805.0856.010.html