中國鱟和圓尾鱟血淋巴細胞分類和特征的比較研究

吳芳麗黃茜枝李瓊珍胡夢紅呂為群王有基

(1. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306; 2. 廣西壯族自治區水產科學研究院, 南寧 530021)

中國鱟和圓尾鱟血淋巴細胞分類和特征的比較研究

吳芳麗1黃茜枝1李瓊珍2胡夢紅1呂為群1王有基1

(1. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306; 2. 廣西壯族自治區水產科學研究院, 南寧 530021)

為了更好地了解中國鱟(Tachpleus tridentatus)和圓尾鱟(Carcinoscorpius rotundicauda)血淋巴細胞的種類組成和特征差異, 綜合運用光學顯微鏡、掃描電鏡和粒度儀, 較為系統地對兩種鱟的血淋巴細胞進行了分類和特征研究, 從而為兩種鱟的血淋巴細胞和分子生物學研究提供基礎資料。根據血淋巴細胞大小、核質比、細胞著色特點、細胞中顆粒存在與否、顆粒的密集程度等, 中國鱟和圓尾鱟的血淋巴細胞均可分為大顆粒細胞、小顆粒細胞和透明細胞三種主要類型, 且兩種鱟的血淋巴細胞均以顆粒細胞為主, 透明細胞在血淋巴細胞中所占比例最小, 但具有高核質比。兩種鱟的同類血淋巴細胞在染色和形態上無顯著性差異, 但在同一種鱟中, 血淋巴細胞密度存在顯著的雌雄差異。

中國鱟; 圓尾鱟; 血淋巴細胞; 分類

鱟屬節肢動物門(Arthropoda)、有螯亞門(Chelicerata)、肢口綱(Merostomata)、劍尾目(Xiphosura)、鱟科(Limuroidea)[1]。全世界鱟有四種, 在我國分布的有兩種, 分別為中國鱟(Tachpleus tridentatus)和圓尾鱟(Carcinoscorpius rotundicauda), 以中國鱟種群數量居多[2]。鱟在地球上已生活約4億年, 但其形態結構卻無明顯變化, 仍保持原始的特點, 故有“活化石”之稱, 也是海洋生物鏈不可或缺的組成部分。中國的鱟資源在東海及南海地區分布廣泛[3, 4], 在南邊以北部灣地區為界點[5, 6], 在北邊以岱山為界點[7]。由于近年來環境污染嚴重, 加之鱟試劑行業的快速發展, 鱟資源迅速下降, 雖然目前鱟為國家二級保護動物, 但是大多數人對鱟的生物學特點及科研價值了解甚少。因此, 為了更好地保護和利用這種生物, 需要了解鱟的基礎生物學特征, 并制定相應的保護措施, 以便合理地開發和利用鱟資源。我國鱟資源具有重要的價值, 主要體現為在生物鏈中扮演重要的角色[8], 具有重要的生態學價值; 研究發現鱟血液中含有多種特殊活性物質, “鱟試劑”的研制就是其在醫學方面的重要應用[9, 10]; 此外, 還具有重要的仿生學價值和歷史考古價值等。

鱟有“無脊椎動物獻血冠軍”的美稱, 因為其體內含有大量的血淋巴, 其中含有多種活性物質, 一直是各國學者的研究的熱點[11]。鱟以其天然免疫系統抵抗入侵的異物[12], 自從20世紀50年代開展了有關鱟血液細胞學的研究以及鱟試劑的研發后, 有關鱟血液活性物質的研究才相繼取得了一些成就,但基礎生物學研究還不夠全面, 例如鱟的血淋巴細胞的分類和形態鑒定等都沒有確切數據。本文首次對中國鱟和圓尾鱟的血淋巴細胞運用了光學顯微鏡,掃描電鏡和顆粒計數儀, 較為全面和系統地對兩種鱟的血淋巴細胞進行觀察和分類研究, 以期為今后進一步研究中國鱟和圓尾鱟的免疫防御機制和鱟試劑的開發利用提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 中國鱟和圓尾鱟的采集

成體雌性與雄性中國鱟和圓尾鱟采自中國廣西北海海域。中國鱟和圓尾鱟運回實驗室后, 暫養在溫度(24—27)℃連續充氣并配備生物活性過濾系統的玻璃纖維水族箱中(1000 L), 經過沙濾和紫外線消毒的養殖海水鹽度為(30±1) ‰。暫養期間每天下午4點用蛤仔進行飼喂。適應期結束后隨機選取實驗用鱟, 稱重并放置于獨立的水箱中, 雌性中國鱟的平均重量為(700.0±10.0) g, 雄性為(250.0±20.0) g,雌性圓尾鱟的平均重量是(260.0±10.0) g, 雄性為(150.0±15.0) g, 每種鱟雌雄各選6 只作為實驗材料。

1.2 血淋巴采集和總血球計數(THC)

把鱟的頭胸甲與腹甲向內彎折, 用酒精棉擦拭彎折處, 再用去離子水多次擦洗[13], 用配備22 G針頭的1 mL注射器從關節處插進抽取血淋巴液。每只鱟抽取5 mL血淋巴液。收集的血淋巴液儲存于冰中以減少細胞自發性凝集。血淋巴液使用 MultisizerTM3庫爾特顆粒計數儀(Beck man Coulter 公司)進行測定, 以確定血淋巴中細胞的濃度(每毫升的細胞數)和大小分布頻率。檢測時, 將0.5 mL血淋巴液加入到9.5 mL ISOTON?II溶液中, 檢測1000 μL的混合溶液計算其中的細胞個數, 使用 MultisizerTM3軟件分析數據 (Beck man Coulter, Inc. USA)。

1.3 細胞光學顯微鏡分析

中國鱟和圓尾鱟分別抽取血淋巴后, 將 50 μL血淋巴液滴在 Super Frost Plus載玻片上(Men zel-Germany)。當血細胞黏著在玻片上后, 將其浸泡于戊二醛溶液(2%濃度; 無菌海水配制, FSSW)中靜置20min, 然后用曙紅亞甲基藍II染液(0.2 mL曙紅溶液和2 g亞甲基藍定容100 mL 95%酒精溶液中)進行染色6min。接著, 將玻片轉移到Giemsa染液(吉姆薩粉(Giemsa stain) l.0 g, 甘油(AR) 66 mL, 甲醇(AR) 66 mL, 將Giemsa粉放入研缽中, 先加入少量甘油,研磨至無顆粒為止, 然后再將全部甘油倒入, 放56℃溫箱中2h后, 加入甲醇, 將配制好的染液密封保存棕色瓶內, 于 0—4℃保存)中浸泡染色 30min,再用磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 7.5)沖洗, 直至流下的液體變透明為止, 后于空氣中自然風干。經過染色處理后, 中國鱟和圓尾鱟血淋巴細胞中的酸性顆粒物質被染成粉紅色, 堿性顆粒物質被染成藍色。玻片用中性樹膠封片劑(Fisher Scientific,USA)封片,并置于光學顯微鏡下觀察(Axioplan 2 Imaging,Carl Zeiss, Germany)。顯微圖像使用Color-View II CCD攝像機(Olympus/Soft Imaging System, Germany)拍攝。血細胞及細胞核的直徑用圖像分析軟件(Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Germany)進行測量。

1.4 細胞掃描電子顯微鏡分析

取中國鱟和圓尾鱟的血淋巴液各 50 μL, 分別放于 Super Frost Plus載玻片上(Men zel-Glaser, Germany), 并置于保濕室內在室溫條件下靜置 25min讓細胞黏附。黏附的細胞置入含4%多聚甲醛, 2.5%戊二醛以及0.3 mol/L蔗糖的0.1 mol/L的二甲砷酸鹽緩沖液(pH 7.2)中2h。隨后用0.1 mol/L的二甲砷酸鹽緩沖液進行沖洗, 再用含 1%四氧化鋨的0.1 mol/L的二甲砷酸鹽緩沖液進行固定, 在不同濃度的乙醇溶液(30%, 50%, 70%, 80%, 95% 和100%)中進行脫水處理, 最后浸泡在丙酮中。脫水后的樣品在CO2環境中(BAL-TEC CPD 030 Critical Point Dryer, Liechtenstein)進行干燥, 置于鋁座上用BALTEC SCD 005 Sputter Coater (Liechtenstein)噴涂金-鈀層, 用FEI/Philips XL30 Esem-FEG 掃描電子顯微鏡(Netherlands)調節于10 kV觀察。

1.5 統計分析

在進行數據分析之前, 所有數據使用SPSS 16.0進行 Shapiro-Wilk’s檢驗檢查正態分布性, 用Levene’s檢驗檢查方差齊性。百分比數據在分析前進行反正弦轉換。核質比(Karyoplasmic ratio), 即N/C,為細胞核直徑與細胞胞質直徑的比值。為了更好的比較兩種鱟之間、性別之間、同種亞群之間的特點, 使用student t檢驗和單因素方差分析(ANOVA)進行分析檢驗。以P＜0.05代表差異顯著, 結果表示為平均值±標準差。

2 結果

2.1 血淋巴細胞的光學顯微鏡觀察

中國鱟和圓尾鱟的血淋巴細胞涂片經過染色以后, 在光學顯微鏡下呈現出各種單獨的或聚合的細胞, 并顯示出不同的顏色和大小(圖1)。大量細胞表現出豐富的紅色顆粒和少量的藍色顆粒, 形狀基本為卵形或圓形, 中間藍色部分為細胞核。根據傳統的細胞染色分類標準, 這些細胞稱為顆粒細胞。顆粒細胞根據細胞及顆粒的密度大小又可進一步分為兩種類型, 即大顆粒細胞和小顆粒細胞。大顆粒細胞內部顆粒較致密、染色較深, 小顆粒細胞內部顆粒較稀疏, 染色較淺。在光學顯微鏡下還可以觀察到另外一種類型的細胞, 這種細胞體積較小, 內部含有很少的顆粒物質, 有的甚至觀察不到染色顆粒物質, 但是細胞中有被藍色染料染色的細胞核, 核的周圍有一圈透明的細胞質, 這種細胞稱之為透明細胞或無顆粒細胞。透明細胞呈現出較大的核/質比和淡藍色的細胞質背景(圖1), 可以觀察到一定程度的細胞聚集現象(圖2)。

表1顯示出雌雄性中國鱟和雌雄性圓尾鱟血淋巴細胞各亞群間細胞核直徑、細胞直徑以及核質比。雌性中國鱟和雌雄性圓尾鱟的3種類型的血淋巴細胞的長徑都存在顯著性差異, 雄性圓尾鱟的大顆粒細胞和小顆粒細胞的長徑不存在顯著性差異, 但總體都是大顆粒細胞長徑＞小顆粒細胞長徑＞透明細胞長徑; 雌性中國鱟和雌性圓尾鱟的大顆粒血淋巴細胞長徑和無顆粒血淋巴細胞長徑不存在顯著性差異(圖 3a)。雌雄性中國鱟和雌雄性圓尾鱟的3種類型的血淋巴細胞的短徑都存在顯著性差異, 且總體都是大顆粒細胞短徑＞小顆粒細胞短徑＞透明細胞短徑;雌性中國鱟和雌性圓尾鱟的3種類型的血淋巴細胞短徑不存在顯著性差異(圖3b)。

圖1 中國鱟和圓尾鱟血淋巴細胞的光學顯微圖Fig. 1 Light micrographs of hemocytes of Tachpleus tridentatus and Carcinoscorpius rotundicauda

圖2 中國鱟和圓尾鱟透明細胞的聚集現象Fig. 2 Aggregates of the hyaline cells in Tachpleus tridentatus and Carcinoscorpius rotundicauda

雌雄性中國鱟和雌雄性圓尾鱟的大顆粒血淋巴細胞核長徑之間不存在顯著性差異, 小顆粒血淋巴細胞核長徑也是如此; 中國鱟和圓尾鱟的透明細胞核長徑之間存在顯著性差異, 但是同種鱟雌雄性間的透明細胞核長徑不存在顯著性差異(圖 3c)。雌雄

圖3 中國鱟和圓尾鱟各亞群血淋巴細胞直徑數據分析

Fig. 3 The cell diameters of each hemocyte subpopulation in Tachpleus tridentatus and Carcinoscorpius rotundicauda

a. 中國鱟和圓尾鱟各亞群血淋巴細胞長徑數據分析; b. 中國鱟和圓尾鱟各亞群血淋巴細胞短徑數據分析; c. 中國鱟和圓尾鱟各亞群血淋巴細胞核長徑數據分析; d. 中國鱟和圓尾鱟各亞群血淋巴細胞核短徑數據分析; e. 中國鱟和圓尾鱟各亞群血淋巴細胞核質比數據分析; 不同小寫字母表示同一種鱟中三種細胞之間具有顯著性差異(P＜0.05), 不同大寫字母表示每種細胞在四類鱟之間存在顯著性差異(P＜0.05)

a. The long diameter of hemocyte subpopulations; b. The short diameter of hemocyte subpopulations; c. The long diameter of nucleus in hemocyte subpopulations; d. The short diameter of nucleus in hemocyte subpopulations; e. The N/C retio of hemocyte subpopulations. Different small letters indicate significant difference among three types of cells in each species, and different capital letters indicate significant difference among four different species

GC: 大顆粒細胞; SGC: 小顆粒細胞; HC: 透明細胞; HSCF: 雌性中國鱟; HSCM: 雄性中國鱟; YHSCF: 雌性圓尾鱟; YHSCM: 雄性圓尾鱟

GC: the granular cell; SGC: the semi-granular cell; HC: the hyaline cell; HSCF: the female Tachpleus tridentatus; HSCM: the male Tachpleus tridentatus; YHSCF: the female Carcinoscorpius rotundicauda; YHSCM: the male Carcinoscorpius rotundicauda性中國鱟和雌雄性圓尾鱟的大顆粒血淋巴細胞核短徑之間都不存在顯著性差異; 中國鱟和圓尾鱟的小顆粒血淋巴細胞核短徑之間不存在顯著性差異, 透明細胞的核短徑也是如此, 但是同種鱟雌雄性間這兩種細胞核短徑之間不存在顯著性差異(圖 3d)。雌雄性中國鱟和雌雄性圓尾鱟的3種類型的血淋巴細胞的核質比都分別存在顯著性差異, 且總體都是透明細胞核質比＞小顆粒細胞核質比＞大顆粒細胞核質比(圖3e)。

表1 中國鱟和圓尾鱟的總血球計數和細胞體積與表面積Tab. 1 The number and distribution of the hemocytes in Tachpleus tridentatus and Carcinoscorpius rotundicauda

2.2 總血球計數

使用庫爾特計數法對中國鱟和圓尾鱟雌雄類別中的總血球進行了計數和細胞頻率分布評估(表1)。中國鱟雌性血淋巴細胞濃度為(3.89±1.13)×106cell/mL,中國鱟雄性血淋巴細胞濃度為(2.16±0.12)×106cell/mL;圓尾鱟雌性血淋巴細胞濃度為(3.27±1.32)×106cell/mL,圓尾鱟雄性血淋巴細胞濃度為(1.73±0.28)×106cell/mL,總體來說, 中國鱟和圓尾鱟都是雌性的血淋巴細胞濃度大于雄性的, 同種性別的中國鱟和圓尾鱟間血淋巴細胞濃度不存在顯著性差異。

細胞大小的頻率分布表明, 雌性中國鱟和圓尾鱟的細胞直徑范圍為 6.0—20.0 μm, 峰值在 11—13 μm; 雄性中國鱟和圓尾鱟的細胞直徑范圍為6.5—19.0 μm, 峰值在11.5—14 μm。雌性中國鱟細胞表面積介于 200—2.4×106μm2, 雄性中國鱟細胞表面積介于50—1.2×106μm2; 雌性圓尾鱟細胞表面積介于 200—2.0×106μm2, 雄性圓尾鱟細胞表面積介于50—1.0×106μm2?？傮w來說, 雌性中國鱟大多集中在5.0×105—1.8×106μm2, 雌性圓尾鱟最多集中在5.0×105—1.5×106μm2, 雄性中國鱟和圓尾鱟最多集中在3.0×105—8.0×105μm2。中國鱟和圓尾鱟細胞體積與細胞表面積的分布趨勢相同, 雌性中國鱟和圓尾鱟的血淋巴細胞體積較雄性的大, 雌性中國鱟大多集中在6.0×105—2.5×106μm3, 雌性圓尾鱟最多集中在5.0×105—1.5×106μm3, 雄性中國鱟和圓尾鱟最多集中在2.0×105—2.0×106μm3。

2.3 血淋巴細胞的掃描電子顯微鏡觀察

通過掃描電鏡對中國鱟和圓尾鱟的雌性以及雄性血淋巴細胞分別進行了觀察, 發現了 3種在細胞形態上有明顯區別的細胞類型, 包括: (1)體積較大的細胞, 表面有瘤狀突起以及一些凹槽, 有些呈餅狀, 分析認為是大顆粒細胞; (2)體積較1類細胞小,表面有瘤狀突起, 一般呈球形, 比較規則, 分析認為是小顆粒細胞; (3)細胞體積較1、2類都小, 有連續的變形的突起, 細胞有褶皺的表面, 基本呈球形,分析認為是透明細胞(圖4、圖5)。測量發現大顆粒細胞直徑為(10.0±1.1) μm, 小顆粒細胞直徑為(7.8± 0.4) μm, 透明細胞直徑為(6.0±0.5) μm。

3 討論

鱟的血淋巴系統異常復雜, 為節肢動物最復雜的心血管系統[14], 至今各國學者對鱟血淋巴細胞的種類看法不一, 其主要原因是: 首先, 很難建立統一的血細胞的分類標準。第二, 由于血細胞種類的多樣性, 所采用的研究手段也不盡相同。盡管在無脊椎動物血淋巴細胞的分類方面存在一些爭議, 但是大多數學者都認同水生無脊椎動物血細胞分為兩個主要類別: 一類是細胞中有顆粒的粒細胞, 另外一類是含有少量或是沒有顆粒的透明細胞。這兩種類型在本研究中都有觀察到, 經Giemsa染液染色后, 3種不同細胞亞群被鑒別出來, 包括 2種粒細胞和一種無顆粒細胞。染色表明, 顆粒細胞大多數是嗜酸性的, 而無顆粒細胞呈嗜堿性。鱟血淋巴細胞主要為顆粒性細胞, 其胞質中含有眾多的大小顆粒,鱟的血淋巴細胞中含有多種免疫因子, 大部分存在于這些顆粒中, 這些免疫因子在鱟的天然免疫中起著重要的作用[14, 15]。粒細胞和透明細胞的區別通過光學顯微鏡很容易觀察到。但是要對顆粒血細胞的不同種類進行細分需要關注更多細節, 用掃描電鏡來進行血細胞的研究對細胞的分類起到一定的補充和驗證作用, 而且能夠提供精確的關于細胞表面的信息和特征。因此, 對于中國鱟和圓尾鱟血細胞的研究, 在使用光學顯微鏡確定大致的血細胞的種類后, 可以進一步用掃描電鏡來檢驗不同類型細胞的表面特征和驗證在光學顯微鏡下的細胞類群鑒定。

圖4 中國鱟血淋巴細胞的掃描電子顯微圖Fig. 4 Scanning electron micrographs of hemocytes of Tachpleus tridentatus

圖5 圓尾鱟血淋巴細胞的掃描電子顯微圖Fig. 5 Scanning electron micrographs of hemocytes of Carcinoscorpius rotundicauda

在光學顯微鏡下通過染色后可以根據細胞的內部結構和細胞大小來區分不同的血細胞。染色結果說明了粒細胞中的大部分顆粒都是嗜酸性的, 與細胞的亞群類型無關?；诠鈱W和電鏡顯微分析, 細胞呈現不同的大小和內部粒度, 又可以將顆粒血細胞分為兩個亞類, 即大顆粒細胞和小顆粒細胞。中國鱟和圓尾鱟的大顆粒細胞核質比一般在 0.3—0.4,而小顆粒細胞核質比在 0.4—0.5。透明細胞與顆粒血細胞的不同主要表現在高核質比和小體積, 顆粒血細胞會出現較多的染色顆粒, 細胞質著色清晰,且核質比較透明細胞小很多, 這種現象在其他的一些水生無脊椎物種上也同樣存在[16, 17]。

對中國鱟和圓尾鱟的3種血淋巴細胞在掃描電鏡下觀察到的基本形態與在光學顯微鏡下觀察到的形態基本相符, 掃描電鏡結果主要強調細胞的表面結構, 最小的球形細胞對應了光鏡下所觀察到的透明細胞; 在掃描電鏡下觀察到的體積較大且有一些瘤狀突起的球狀細胞是小顆粒細胞, 因為在光學顯微鏡下觀察到這類細胞體積中等且細胞內有一定的顆粒密度但不是特別充盈; 而在掃描電鏡下觀察到的體積最大, 細胞表面有凹槽及瘤狀突起且呈餅狀,這種細胞極有可能是大顆粒細胞。相比之下高密度的粒細胞由于內部顆粒較多且粒度差異性較大, 其表面由于顆粒的支撐看上去凸起較多且飽滿, 凹槽也比較清晰, 這是因為這種細胞內部充滿了顆粒,所以細胞內部沒有多余的空間。而小顆粒粒細胞由于細胞內顆粒的充盈度不是特別高, 其表面略微形成一些褶皺。在掃描電鏡下可以看到透明細胞呈現出一種特別的狀態, 細胞表面有很多皺褶, 這是由于內部的顆粒非常少。

總血球計數結果表明, 中國鱟和圓尾鱟的血淋巴細胞數量不是固定的。眾多因素, 包括外源性(如水溫、污染物、鹽度、地理位置)和內源性(如性別、年齡、動物的生育期)可以影響中國鱟和圓尾鱟的血淋巴細胞總數和各亞群的比例, 這些結論已在多種水生無脊椎動物血淋巴細胞的研究中得到驗證[18—20]。在本研究中, 兩種鱟來自廣西北海北部灣地區, 外在環境條件基本一致, 其總血球數的變化主要歸因于內源性因素, 如年齡和性別等。相比傳統的血球計數板法, 本研究總血球計數由庫爾特計數器評估,具有更高的精確度和便捷性。

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CLASSIFICATION AND CHARACTERIZATION OF HEMOCYTES BETWEEN TACHPLEUS TRIDENTATUS AND CARCINOSCORPIUS ROTUNDICAUDA

WU Fang-Li1, HUANG Xi-Zhi1, LI Qiong-Zhen2, HU Meng-Hong1, LU Wei-Qun1and WANG You-Ji1
(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Guangxi Institute of Fisheries, Nanning 530021, China)

In the present study, light microscopy, scanning electron microscopy and particle size analyzer were utilized to investigate hemocyte classification and characterization between two horseshoe crabs Tachpleus tridentatus and Carcinoscorpius rotundicauda. Hemocyte classification was based on cell size, nuclear-cytoplasmic (N/C) ratio, the morphology, and the number and size of cytoplasmic granules in the hemocytes. Three major types of hemocytes were distinguished in the two horseshoe crabs: the granular cell (GC), the semi-granular cell (SGC) and the hyaline cell (HC). GC was the major cell type in both horseshoe crabs; HC was the minor cell type with highest N/C ratio. The hemocyte types between the two horseshoe crabs had no significant differencesin staining and morphology. However, significant differences of total hemocyte counts were observed between males and females within each horseshoe crab species.

Tachpleus tridentatus; Carcinoscorpius rotundicauda; Hemocyte; Classification

Q175

A

1000-3207(2015)06-1169-08

10.7541/2015.153

2014-08-08;

2015-05-29

上海海洋大學 2012年度上海大學生國家級創新活動計劃項目(G201331015005); 國家自然科學基金項目(31302207);上海市自然科學基金項目(13ZR1455700); 上海市高校知識服務平臺項目(ZF1206)資助

吳芳麗(1993—), 女, 甘肅天水人; 研究方向為水生生物學。E-mail: 1033543663@qq.com

王有基(1981—), 男, 博士; 研究方向為環境生物學與保育。E-mail: yj_wang@shou.edu.cn