表達雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白重組乳酸乳球菌的構建及其表達的優化

張 旺，劉琳琳，祁小樂，高玉龍，王永強，高宏雷，李 凱，高 立，劉長軍，張艷萍，王笑梅，崔紅玉

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室/禽免疫抑制病創新團隊，黑龍江哈爾濱 150001)

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由IBD 病毒(IBDV)引起的一種高接觸性和高致死性傳染病[1]。其主要特點為感染雛雞的法氏囊，造成法氏囊的B 淋巴細胞損傷，引起嚴重的免疫抑制性疾病[2]。VP2 為IBDV 的主要結構蛋白[3]，也是唯一的衣殼蛋白，能夠刺激機體產生中和抗體的抗原表位。研究顯示，重組表達的VP2 蛋白(rVP2)免疫雛雞后，能夠保護其免受IBDV 的感染[4]。VP2 蛋白已成為基因工程疫苗研發的主要候選蛋白[3-5]。

rVP2 作為IBDV 抗原蛋白已通過多種載體進行了表達及應用，如大腸桿菌、桿狀病毒、酵母、昆蟲細胞、植物細胞、HVT 活載體和雞痘活載體等[6]。目前已有3 種商品化的利用rVP2 作為抗原蛋白制備的基因工程亞單位疫苗，分別為大腸桿菌、桿狀病毒和畢赤酵母[7]。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)表達系統，因其自身的高度安全性[8]，表達外源蛋白的高度穩定性和良好的抗原蛋白遞呈性[9]，受到了國內外研究學者的高度關注。Nisin 表達系統，又被稱作NICE 系統[10]，是目前廣泛用于革蘭氏陽性菌高效的外源基因表達系統。本研究利用Nisin 表達系統，構建了能夠持續表達rVP2 的重組乳酸乳球菌L.lactis/pNZ-VP2，為進一步研究體內免疫效率實驗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株及載體 IBDV 強毒株HLJ-0504由本實驗室分離并保存；L.lactis NZ3900 株和L.lactis表達質粒pNZ8149 均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 KOD-Plus-Neo PCR 酶購自東洋紡公司；限制性內切酶和Micro BCATMProtein Assay Kit 購自Thermo Scientific；T4 DNA 連接酶購自NEB公司；質粒試劑盒和膠回收試劑盒購自AXYGEN 公司；Nisin 和紅外熒光素標記山羊抗鼠IgG 購自Sigma 公司；鼠源VP2 單克隆抗體抗(MAb)由本實驗室制備；10 ku 蛋白濃縮管購自Millpore 公司。

1.3 重組乳酸菌的構建 根據L.lactis MG1363 菌株對IBDV 強毒株HLJ-0504 基因序列(AAV88106.1)進行密碼子優化，應用Geneious 軟件設計一對特異性引物：5'-ATGCCATGGCAAACCTGCAAGA-3'(NcoⅠ)/5'-ACCGAGCTCGTCTCCTGCAATCTAGGGGAGAGT T-3'(SacⅠ)，由吉林庫美生物有限公司合成。預計擴增VP2 基因大小為1 338 bp。擴增的VP2 基因經NcoⅠ/SacⅠ雙酶切后克隆于pNZ8149 載體中，構建重組表達質粒pNZ-VP2，并將其電轉化于乳酸菌NZ3900 感受態細胞中，經乳糖缺陷篩選獲得重組菌L.lactis/pNZ-VP2。

1.4 重組乳酸菌的誘導表達及蛋白提取 L.lactis/pNZ-VP2 在L-Elliker 培養基平板上劃線復蘇，按照1∶50 轉接到L-Elliker 培養液中，待OD600nm=0.4～0.5時，加入終濃度為1 ng/mL 的Nisin，30℃靜置誘導3 h，離心分離菌體和上清。在離心分離的上清中利用10 ku 蛋白濃縮管提取乳酸菌分泌型蛋白；通過表面蛋白洗脫法提取乳酸菌表面蛋白，具體方法為：取離心收集的10 mL 菌體經PBS 洗滌后，以1 mL 終濃度為2 %的SDS，1 %的巰基乙醇重懸，70 ℃水浴作用10 min,解離菌體表面蛋白經12 000 r/min，4 ℃，離心10 min，將上清保存備用。此外，將表面蛋白處理后的菌體利用超聲裂解法提取乳酸菌胞內蛋白，具體方法為：取離心分離菌體，經PBS 洗滌后，重懸菌體，利用細胞超聲破碎儀對菌體進行超聲破碎，將超聲破碎后的樣品，12 000 r/min，4 ℃，離心10 min，上清保存備用。

1.5 重組蛋白的表達部位檢測 將獲得的乳酸菌分泌蛋白、表面蛋白和胞內蛋白進行SDS-PAGE 電泳，利用半干轉膜儀，將目的蛋白轉印于尼龍膜上，經5%的脫脂乳室溫封閉，以MAb VP2(1∶2 000)作為一抗，紅外標記山羊抗鼠的IgG(1∶5 000)作為二抗，通過熒光檢測儀進行western blot 檢測，確定rVP2 在重組菌中的表達部位。

1.6 重組蛋白表達條件優化及其表達持續性檢測

1.6.1 重組蛋白表達條件的優化 通過3 因素3 水平的正交試驗對重組蛋白表達條件進行優化，條件參數包括Nisin 誘導劑終濃度：2 ng/mL、5 ng/mL和10 ng/mL；誘導起始OD600nm：0.3、0.4 和0.5 和誘導持續時間：2 h、3 h 和5 h。將在不同誘導條件下收獲的rVP2 進行SDS-PAGE 電泳，考馬氏亮藍染色后，利用薄層凝膠掃描儀進行灰度值分析，得到其占總蛋白的百分比，利用BCA 總蛋白分析試劑盒對樣品總蛋白進行定量分析，通過計算得到rVP2 的絕對含量，最后應用統計學軟件計算最佳表達條件。

1.6.2 重組蛋白表達的持續性檢測 L.lactis/pNZVP2 在Nisin 終濃度為2 ng/mL 的條件下進行誘導，并分別于12 h、24h、48 h、72 h、96 h 和120 h 進行取樣，通過western blot(方法同前)檢測rVP2 表達的持續性。

2 結果

2.1 VP2基因的克隆及重組乳酸菌的鑒定 以合成的經過優化的VP2 基因片段為模板，利用PCR技術擴增VP2 基因，PCR 產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示目的片段大小約為1 350 bp 與預期相符。對重組乳酸菌質粒進行提取和酶切鑒定并以其為模板進行PCR 鑒定，提取的重組乳酸菌質粒大小約為4 800 bp，經PCR 鑒定、酶切鑒定及測序鑒定，結果表明重組質粒pNZ-VP2 構建正確(圖1)，并成功轉入乳酸菌NZ3900 中獲得重組菌L.lactis/pNZ-VP2。

圖1 VP2 基因片段鑒定Fig.1 Identification of VP2 gene by PCR

2.2 重組蛋白的表達 重組菌L.lactis/pNZ-VP2 在L-Elliker 培養基平板上劃線復蘇，通過終濃度為1 ng/mL 的Nisin，30 ℃靜置誘導培養3 h 后經SDSPAGE 電泳，電轉印后，利用VP2 MAb作為一抗，紅外標記山羊抗鼠的IgG 作為二抗，進行western blot 檢測，結果顯示L.lactis/pNZ-VP2 在52.6 ku 附近出現目的條帶，而空載體菌株無條帶出現，與預期相符，證明rVP2 在L.lactis/pNZ-VP2 中得到表達(圖2)。

2.3 重組蛋白表達部位的檢測 通過對L.lactis/pNZ-VP2 提取得到的胞內蛋白、表面蛋白和分泌蛋白樣品進行western blot 檢測。結果顯示，在L.lactis/pNZ-VP2 胞內可以檢測到大量rVP2，但菌體表面只能夠檢測到少量rVP2，而在菌體培養液上清中檢測不到rVP2。即在L.lactis/pNZ-VP2 中rVP2 主要存在于乳酸菌胞內，少量存在于乳酸菌表面(圖3)。

圖2 rVP2 蛋白western blot 檢測Fig.2 Identification of rVP2 protein by western blot

圖3 rVP2 蛋白表達部位檢測Fig.3 Location of rVP2 expressed in Lactococcus

2.4 重組蛋白表達條件的優化、表達量及持續性檢測 通過3 因素3 水平的正交試驗對表達條件進行優化。結果表明，當L.lactis/pNZ-VP2 生長至OD600nm=0.5 開始誘導，誘導劑Nisin 終濃度為2 ng/mL，誘導時間為5 h 時，rVP2 表達量達到最大值，其濃度為38.0 μg/mL(表1)。對L.lactis/pNZ-VP2 誘導后12 h、24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 的樣品進行western blot 檢測，結果表明，rVP2 在誘導后48 h內保持穩定，于72 h 后表達量稍微減少，直到誘導后120 h 均能夠在L.lactis/pNZ-VP2 中檢測到rVP2，該結果表明，rVP2 能夠在誘導后120 h 內持續表達(圖4)。

表1 誘導條件優化正交試驗Table 1 Orthogonal experiment of induction conditions

圖4 rVP2 蛋白表達的持續性鑒定Fig.4 The sustainability of rVP2 protein detected by western blot

3 討論

為提高生物制品的安全性，我們使用了食品級表達載體pNZ8149，pNZ8149 載體中不含任何毒力基因和抗性基因，通過乳糖缺陷篩選的方法，得到高安全性的重組乳酸菌L.lactis/pNZ-VP2。通過western blot 檢測rVP2，結果顯示，由L.lactis/pNZ-VP2 表達的rVP2 能夠和MAb VP2 發生特異性反應，證明rVP2 和天然抗原蛋白具有結構上的相似性，并且具有良好的免疫原性。

通過對rVP2 表達位置的檢測可知rVP2 主要在胞內進行大量表達，但在菌體表面蛋白中同樣可以檢測到rVP2 的存在，rVP2 的表面展示可能有利于動物機體對抗原蛋白的捕獲，從而有效激發免疫應答。rVP2 表達持續性試驗結果表明，L.lactis/pNZ-VP2 所表達的rVP2 在誘導過程中可持續性存在，進一步增加了rVP2 作為活載體疫苗的可行性。

雖然乳酸乳球菌表達系統有很多優勢，但外源蛋白表達量偏低一直是限制其發展的主要問題。根據Nisin 系統條件優化說明，誘導條件的改變能夠導致外源蛋白表達量的改變，本實驗中為了提高外源蛋白表達含量，通過3 因素3 水平的正交試驗對Nisin 誘導劑濃度，誘導起始菌群數量OD600nm和誘導持續時間進行優化。最終得到最佳的誘導條件為：L.lactis/pNZ-VP2 生長至OD600nm=0.5 時開始誘導，誘導劑Nisin 終濃度為2 ng/mL，誘導時間為5 h時，rVP2 表達量達到最大值。本研究為進一步利用乳酸菌作為活載體研究體內免疫實驗奠定基礎。

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