牛傳染性鼻氣管炎病毒gD蛋白表位鑒定

周躍輝，朱遠茂，任建樂，嚴 昊，王雪枝，馬 磊，史鴻飛，薛 飛

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室/大動物傳染病研究室，黑龍江哈爾濱 150001)

牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由IBR 病毒(IBRV)引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，以高熱、呼吸困難、鼻炎、鼻竇炎和上呼吸道炎癥為主要特征[1]。病毒原發感染后在三叉神經節建立潛伏感染、不定期向外排毒，給該病的清除帶來了困難。該病呈世界性分布，對養牛業造成了嚴重的經濟損失[2]。

IBRV 又名牛皰疹病毒1 型(Bovine herpesvirus 1，BoHV-1)，屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科水痘病毒屬。IBRV 基因組由雙鏈DNA 組成，編碼約70 種蛋白，病毒顆粒囊膜上的11 種糖蛋白在致病性和免疫反應方面起重要作用[3]。gD 是IBRV 的主要結構蛋白之一，由417 個氨基酸組成，糖基化后分子量約為69 ku，該蛋白能夠同時誘導體液免疫和細胞免疫，在病毒吸附和侵入宿主細胞過程中發揮重要作用[4]。本研究采用純化的IBRV 免疫BALB/c小鼠制備了一株針對IBRV gD 的單克隆抗體(MAb)，對其反應性與特異性及抗原表位進行了鑒定，為進一步研究gD 蛋白奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 病毒株、細胞、質粒及實驗動物 IBRV Bartha Nu/67 株、牛副流感病毒3 型(BPIV-3)SD0835株、牛腺病毒3 型(BAV-3)、牛腎細胞系(MDBK)、骨髓瘤細胞SP2/0 細胞、pET-30a、pGEX-6P-1 均由本實驗室保存；6 周齡～8 周齡的BALB/c 小鼠購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心。

1.2 主要試劑 蛋白純化試劑盒(His-bind Purification Kit)購自Invitrogen 公司；弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FICA)、HT、HAT、PEG4000、FITC 標記羊抗鼠IgG(IgG-FITC)、山羊抗鼠IgGHRP 均購自Sigma 公司；MAb 亞類鑒定試劑盒購自Invitrogen 公司；DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；蛋白預染Marker 購自Thermo公司。

1.3 引物設計及合成 根據IBRV 的gD 基因序列(NC_001847)，采用Primer Premier 5 設計一對引物，5'-ATCGGATCCCCGATGCCGCGATACA-3'(Bam HⅠ)/5'-CTCAAGCTTGGGGTGCGTGATGGC-3'(Hin d Ⅲ)用于擴增gD 蛋白基因的106 bp～1 044 bp 編碼序列，引物由哈爾濱博仕生物合成。

1.4 IBRV的gD蛋白的誘導表達及純化 提取IBRV Bartha Nu/67 株基因組DNA，PCR 擴增gD 基因。PCR 產物經純化后克隆于pET-30a 載體中，構建重組表達質粒pET-gD，并將其轉化BL21(DE3)表達菌中，1 mmol/L IPTG 37 ℃誘導4 h，收集菌體。經SDS-PAGE 電泳分析重組蛋白表達情況并進行western blot 鑒定。菌體超聲波破碎后，經蛋白純化試劑盒純化重組蛋白。

1.5 動物免疫 采用經超速離心純化后的IBRV 免疫BALB/c 小鼠，200 μg/只。首免使用弗氏完全佐劑乳化，頸部皮下多點注射，二免和三免使用不完全佐劑乳化，腹腔多點注射。免疫間隔時間為兩周，三免5 d 后鼠尾采血測定效價。融合前3 d 不加佐劑加強免疫一次，200 μg/只。

1.6 間接ELISA的建立 以純化后的gD 蛋白作為包被抗原、免疫BALB/c 小鼠三免后血清作為陽性對照、未免疫BALB/c 小鼠血清作為陰性對照，經方陣滴定，取陽性值接近1.0，陰性值小于0.2 且P/N 最大時的抗原包被量和血清的稀釋度作為抗原及對照血清的最佳工作濃度。

1.7 細胞融合及陽性雜交瘤的篩選 免疫小鼠脾淋巴細胞與對數生長期的SP2/0 細胞按照常規方法進行細胞融合，通過已建立的間接ELISA 篩選陽性雜交瘤細胞株。對初步篩選的陽性孔進行克隆純化，直至獲得單一的陽性克隆雜交瘤細胞系。

1.8 MAb生物學特性的鑒定

1.8.1 MAb 亞類鑒定 按照抗體亞類試劑盒說明書進行MAb 亞類鑒定。

1.8.2 腹水制備及其效價和中和活性測定 常規方法制備腹水，SP2/0 細胞腹水作為陰性對照，采用間接ELISA 檢測其效價。腹水從1∶4 開始倍比稀釋，加入等體積含300 TCID50/0.1 mL 的IBRV 培養液，37 ℃作用4 h，接種于鋪滿單層MDBK 細胞的96 板培養板中，每個稀釋度4 個重復，每孔100 μL，置于37 ℃、5 % CO2培養箱中。48 h 后觀察細胞病變(CPE)，120 h 后判定結果，以能夠中和2 孔或2孔以上的血清最高稀釋度為中和效價。

1.8.3 MAb 的western blot 分析 超速離心純化后IBRV 和純化后gD 重組蛋白經SDS-PAGE 后轉移到硝酸纖維膜上，5 %脫脂乳4 ℃過夜封閉，加入1∶1 000 倍稀釋的HRP 標記MAb，室溫1 h，洗滌后加入DAB 顯色液孵育，出現明顯條帶后終止反應。

1.8.4 間接免疫熒光(IFA)檢測 將IBRV、BAV-3、BPIV-3 分別接種MDBK，待CPE 達到50 %時棄去培養液，經無水乙醇固定20 min，以MAb(1∶500)為一抗，兔抗鼠IgG-FITC(1∶100)為二抗，進行IFA檢測。

1.9 MAb針對抗原表位的鑒定及分析

1.9.1 MAb 抗原表位鑒定 將gD 蛋白基因106 bp～1 044 bp 序列(aa36～aa348)分為相互重疊的片段，設計引物，上下游分別引入Bam HⅠ/XhoⅠ位點，目的片段克隆于表達載體pGEX-6P-1 中構建重組質粒，轉化感受態表達菌BL21，誘導表達的重組GST 多肽與MAb 進行western blot 驗證，對陽性區段逐步進行截短表達，完成抗原表位初步定位。為精確鑒定抗原表位，以上下游引物退火形成目的片段的方式設計引物從初步定位的肽段的N 端和C 端分別以1 個氨基酸殘基為單位逐步遞減，通過MAb與表達的GST 融合蛋白的western blot 分析，確定MAb 識別的抗原表位。

1.9.2 抗原表位分析 選取多個IBRV 分離株及相關反芻動物皰疹病毒gD 蛋白氨基酸序列進行比對分析，以了解其保守性。

2 結果

2.1 gD蛋白的原核表達、鑒定及純化 將gD 基因的106 bp～1 044 bp 編碼序列克隆至pET-30a 載體，轉化BL21(DE3)表達菌，誘導后進行SDSPAGE 分析及western blot 鑒定。SDS-PAGE 分析結果表明gD 重組蛋白呈部分可溶表達，分子量約為52 ku，上清中蛋白經純化效果較好。Western blot 表明在52 ku 處有一特異的反應條帶，表明表達產物具有良好的反應性(圖1)。

2.2 MAb的制備及初步鑒定 常規細胞融合后經過3 次克隆純化后獲得一株穩定分泌MAb 的陽性雜交瘤細胞株，命名為1G3。經MAb 亞類鑒定為IgG1/κ。腹水效價為1∶12 800。病毒中和試驗結果表明其腹水的病毒中和效價為1∶32。

2.3 MAb的western blot鑒定 取純化后IBRV 及重組gD 蛋白經SDS-PAGE，與HRP 標記1G3 進行western blot 鑒定，以未接毒MDBK 細胞作為陰性對照，結果表明，MAb 1G3 與IBRV 和重組gD 蛋白反應，不與MDBK 細胞對照反應，目的條帶大小均符合預期(圖2)。

圖1 表達的重組gD 蛋白的SDS-PAGE 及western blot 分析Fig.1 SDS-PAGE and western blot analysis of the recombinated gD protein expression

圖2 MAb 1G3 的western blot 鑒定Fig.2 The identification of MAb 1G3 by western blot

2.4 MAb的IFA鑒定 將IBRV、BAV-3、BPIV-3分別接種MDBK，以MAb 1G3 為一抗，兔抗鼠IgG-FITC 為二抗，進行IFA 檢測。結果表明MAb 1G3 與IBRV 反應，不與BAV-3、BPIV-3 等牛呼吸道病毒反應(圖3)。

圖3 MAb 1G3 的IFA 鑒定Fig.3 The specificity identification of MAb 1G3 by IFA

2.5 MAb 1G3的抗原表位鑒定

2.5.1 抗原表位初步鑒定 將gD 蛋白aa36～aa348氨基酸逐步進行截短與GST 標簽進行融合表達，產物經SDS-PAGE 分析及western blot 鑒定，初步將MAb 1G3 的抗原表位定位于D211 和D212 的交叉部位，共計7 位氨基酸(aa259～aa265)(圖4)。

2.5.2 抗原表位的精確定位 分別從初步定位的7個氨基酸殘基的N 端和C 端進行逐個氨基酸的截短直至不發生反應為止，結果表明當缺失第1 位氨基酸時，MAb 反應活性下降，缺失第2 位氨基酸及第7 位氨基酸時，MAb 1G3 與之不反應，因此判定7肽259EESKGYE265為MAb 1G3 的抗原表位(圖5)。

圖4 抗原表位的初步鑒定Fig.4 The preliminary identification of antigen epitope

圖5 抗原表位的精確定位SDS-PAGE 及western blot 分析Fig.5 SDS-PAGE and western blot analysis of the precise location of antigen epitope

2.6 抗原表位分析 分析多個IBRV 分離株及其他相關反芻動物皰疹病毒的gD 蛋白氨基酸序列，進行序列比對，結果表明該抗原表位在IBRV 各分離株以及BoHV-5 中均保守，在其他反芻動物皰疹病毒如山羊皰疹病毒1 型(CpHV-1)、鹿皰疹病毒1 型(CvHV-1)及駝鹿皰疹病毒1 型(ElkHV-1)中差異較大(圖6)。

3 討論

圖6 抗原表位保守性分析Fig.6 Conservative analysis of antigenic epitope of IBRV gD

MAb 在病原的生物學特性和抗原性研究、檢測診斷以及預防治療等方面具有重要的應用價值[5]。IBRV 是一種重要的牛呼吸道傳染病病原，在初次感染牛體后呈潛伏感染狀態[6-8]。IBRV gD 蛋白可以誘導中和抗體的產生，在病毒吸附和侵入細胞的過程中發揮著重要作用，是病毒復制必需蛋白[9-10]。分別用gB、gC、gD 免疫鼠和牛，結果顯示gD 與其它糖蛋白相比，可誘導更高而持久的細胞免疫。王延輝等利用原核表達系統截短表達了IBRV 的gD 蛋白，重組蛋白呈部分可溶性表達[3]；祖立闖等用純化的gD 蛋白初步建立了檢測IBRV 血清抗體的間接ELISA[4]。本研究利用pET-30a 表達了IBRV 的gD蛋白，重組蛋白呈部分可溶性表達，約為52 ku。純化后的重組gD 蛋白具有良好的反應性。以超離純化IBRV 免疫小鼠，用純化的重組gD 蛋白作為檢測抗原，經常規融合后獲得了一株具有中和IBRV 活性的MAb 1G3。應用肽掃描技術對其中和表位進行了精確鑒定，對IBRV 的不同分離株進行gD 蛋白序列分析表明，該抗原表位在IRBV 不同分離株及Bo-HV-5 中保守，BoHV-5 按照之前的分類是BoHV-1的一個亞型，兩者氨基酸同源性較高，共用很多抗原表位[11-12]。在進行抗原表位精確鑒定的過程中，發現若缺少第259 位氨基酸，MAb 1G3 的western blot 反應性大大下降，但仍然存在，ELISA 試驗表明缺失第259 位氨基酸后其OD 值由2.0 降至0.8，后續的試驗表明，在259EESKGYE265的N 和C 端再增加1 個和2 個氨基酸殘基，其反應活性不變，表明7 肽259EESKGYE265是MAb 1G3 識別的真實抗原表位。本研究為IBRV 的糖蛋白gD 的結構和免疫學特性及IBRV 致病性的深入研究奠定了基礎。

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